基因工程的基本操作程序（教学课件）高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序1.转化指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程，此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。2.转化的受体细胞受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法03将目的基因导入受体细胞①用______________将________________________直接注入_______中。微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定时间内，剪去______，将____________滴加在_________上，使目的基因借助________________进入_______。柱头DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊（1）将目的基因导入植物细胞--花粉管通道法我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法花粉管通道法是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。03将目的基因导入受体细胞冠瘿瘤农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。（1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法03将目的基因导入受体细胞②农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数____________没有侵染能力。双子叶植物裸子植物单子叶植物b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（____________）转移到被侵染的细胞，并且将其________________________Ti质粒Ti质粒T-DNA可转移的DNA整合到该细胞的染色体DNA上将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。③利用农杆菌进行转化的思路：Ti质粒的T-DNA转化进入植物细胞（1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。载体：农杆菌Ti质粒（T-DNA)03将目的基因导入受体细胞阅读P81资料卡，完成以下填空表现出新性状的植株植物组织培养第一次导入第二次导入第一次拼接第二次拼接将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA导入受体细胞。将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。Ti质粒T—DNA目的基因构建基因表达载体重组Ti质粒转入农杆菌导入植物细胞农杆菌转化法示意图转化的具体方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________。受体细胞为_______与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株体细胞b.可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得_______，再进行________、_________等。受体细胞为_______花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定受精卵（1）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法03将目的基因导入受体细胞03将目的基因导入受体细胞操作程序：（2）将目的基因导入动物细胞--显微注射法构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）获得具有新性状的动物03将目的基因导入受体细胞拓展：【其他方法】科学家也用病毒DNA

与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如慢病毒载体、腺病毒载体等。（2）将目的基因导入动物细胞03将目的基因导入受体细胞选讲（3）将目的基因导入微生物细胞----Ca2+处理法过程Ca2+处理细胞感受态细胞(细胞膜通透性增强)表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子03将目的基因导入受体细胞Ca2+的作用：使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸DNA分子【小结】03将目的基因导入受体细胞成熟mRNA相应酶去除内含子转录翻译真核基因：编码区（外显子+内含子）多肽链前体mRNA蛋白质加工如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？提示：一般不能产生原来的蛋白质原因：①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子；②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）03将目的基因导入受体细胞选讲将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。思考你认为可以从哪些方面/水平进行检测？（1）检测目的基因是否已经导入（检测DNA）（2）检测目的基因是否已经转录（检测mRNA）（3）检测目的基因是否已经表达（检测蛋白质）（4）检测目的基因是否已经发挥作用（检测个体是否获得某种特性）04目的基因的检测与鉴定检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因检测方法：利用PCR对目的基因扩增后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定检测内容及方法----分子水平检测04目的基因的检测与鉴定例：提取棉花细胞DNA用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增对扩增产物进行检测①制作基因探针；②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。探针与受体中的DNA分子杂交出现杂交带：不出现杂交带：已插入未插入或PCR扩增后用DNA分子杂交技术检测DNA分子杂交技术：

DNA分子杂交技术原理（基因探针）变性1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素标记或荧光标记，作为基因探针；2、提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。若出现杂交带，则导入成功。04RT-PCR2.检测目的基因是否转录出了mRNA检测内容及方法----分子水平检测04目的基因的检测与鉴定检测方法：PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测或分子杂交技术检测琼脂糖凝胶电泳过程:提取生物材料RNA逆转录成DNA后检测是否有目的基因。RNA分子杂交技术1、制作基因探针；2、探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明转录出了mRNA。变性探针15N15N转基因生物的mRNA杂交分子（可检测）原理：碱基互补配对原则3.检测目的基因是否翻译——通过抗原-抗体杂交检测从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白抗原抗体杂交脱分化04目的基因的检测与鉴定检测目的基因是否表现出相应的性状检测抗虫棉是否具有抗虫性状采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫观察棉铃虫存活情况04目的基因的检测与鉴定检测内容及方法----个体水平鉴定转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测内容及方法----个体水平鉴定04目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法分子水平检测第一步转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR或DNA分子杂交技术第二步目的基因是否转录出mRNAPCR或分子杂交技术第三步目的基因是否翻译形成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体水平鉴定抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度

抗性检测，基因工程产品与天然产品的功能活性比较

功能活性。检测内容及方法总结:03目的基因的检测与鉴定04目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定前提核心关键保证利用PCR获取和扩增目的基因、启动子、终止子、标记基因农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、感受态细胞转化法(微生物);分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。第一步第二步第三步第四步半期复习周末完成3-2大书1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？

科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平。2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。

到社会中去2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？

科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物（非抗品种）轮作或套种等。（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全生评价等。

到社会中去【例5】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(

)A.PCR产物的分子大小在250至500bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰B选讲【例6】下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为抗氨苄青霉素基因）。下列叙述错误的是（）A．④过程中可利用目的基因作为探针对植株进行筛选B．可同时选用限制酶PstI、SmaI对含目的基因的DNA进行剪切C．过程②可采用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞D．质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达D选讲【例7】通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变.图1为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点.有关叙述正确的是（

）A.两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等C.第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8A选讲【例9】实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是∶在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（

）A．做RT-PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA反转录为DNA后再进行扩增C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D．病毒的检测还可以