(高清版)GBT 41698-2022 鸭源生物制品外源病毒检测方法

鸭源生物制品外源病毒检测方法2022-10-12发布国家标准化管理委员会 I Ⅱ 2规范性引用文件 3术语和定义、缩略语 4免疫血清的制备及采集 25抗体检测 25.1鸭瘟病毒(DPV)ELISA抗体检测 5.2鸭肝炎病毒I型(DHVI)中和试验 5.3鸭坦布苏病毒(DTMUV)血凝抑制试验 55.4鸭坦布苏病毒(DTMUV)ELISA抗体检测 5.5番鸭细小病毒(MPV)胶乳凝集抑制试验 5.6番鸭小鹅瘟病毒(GPV)胶乳凝集抑制试验 6外源病毒检验结果综合判定 附录A(规范性)溶液配制 I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会(SAC/TC374)提出并归口。本文件起草单位：中国兽医药品监察所。Ⅱ我国鸭养殖数量位居世界首位，近年来鸭的疫病日益增多，生产和使用的鸭源生物制品种类越来越多。外源病毒检验是病毒类活疫苗质量控制项目之一，对保证产品质量至关重要。《中国兽药典》(2020年版)附录中关于禽源生物制品外源病毒检验的相关方法和标准主要是针对鸡源或鸡用制品，缺少鸭源生物制品相关方法和标准，难以客观评价产品质量。本文件借鉴国际先进经验，聚焦鸭源生物制品外源病毒检验的关键参数、目前主要流行的鸭病毒病现状以及检测方法研究成熟度，制定鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒I型、鸭坦布苏病毒、番鸭细小病毒、番鸭小鹅瘟病毒5种病毒的鸡检测方法。1鸭源生物制品外源病毒检测方法1范围本文件描述了用鸡进行鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒I型、鸭坦布苏病毒、番鸭细小病毒、番鸭小鹅瘟病毒的鸭源生物制品外源病毒检测的方法。本文件适用于鸭源生物制品(活疫苗及生产毒种)中外源病毒的检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。以天然或人工改造的鸭源微生物、寄生虫、生物毒素或鸭源生物组织及代谢产物等为材料，采用生物学、分子生物学或生物化学、生物工程等相应技术制成的，用于预防、治疗、诊断鸭疫病的产品。来源于田间弱毒株或采用物理、化学或生物学致弱方法获得的弱毒株，经培养繁殖后制备的疫苗。具有一定数量、背景明确、组成单一、经系统鉴定免疫原性和繁殖特性良好、生物学特性和鉴别特征明确、纯净、用于兽用生物制品研制、生产和检验的病毒。对可能因生产工艺、原辅材料等造成外源性病毒污染制品而进行的一类检验。无特定病原鸡specificpathogenfreechicken在屏障环境或隔离环境的饲养条件下，不含有鸡白痢沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸡喉气管炎病毒、淋巴白血病病毒、网状内皮增生症病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽腺病毒Ⅲ群、禽腺病毒I群、禽痘病毒等19种特定病原微生物，可用于微生物学监测的鸡。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。2BABS:牛血清白蛋白硼酸氯化钠溶液(bovineserumalbuminboricacidsodiumchloridesolution)DHVI:鸭肝炎病毒I型(duckhepatitisvirus-typeI)DTMUV:鸭坦布苏病毒(ducktembusuvirus)ELD₅₀:鸡胚半数致死量(MedianEmbryoLethalDose)ELISA:酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay)GPV:番鸭小鹅瘟病毒(goslingplaguevirus)LPAI:胶乳凝集抑制(latexparticlesagglutinationinhibition)MPV:番鸭细小病毒(mmuscovyducklingparvovirus)OD:光密度(opticaldensity)PBS:磷酸盐缓冲溶液(phosphatebufferedsaline)SPF:无特定病原体(specificpathogenfree)TMB:3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)VAD:病毒调整稀释液(virusadjustingdiluent)4免疫血清的制备及采集4.1取至少2瓶鸭源生物制品，按瓶签注明羽份稀释，混匀后备用。4.2取20只2周龄～3周龄无特定病原鸡(SPF鸡),每只同时点眼、滴鼻接种各10羽份制品(4.1),肌肉注射100羽份制品(4.1),21d后，按上述方法和剂量重复接种1次。第1次接种后观察临床症状至第42天并经翅静脉或心脏采血，分离血清。5抗体检测5.1鸭瘟病毒(DPV)ELISA抗体检测将抗原吸附在固相载体上，加入待检抗体，孵育后再加入针对抗原的单克隆抗体，没有完全被待检血清中抗体结合的抗原即可和后加入的单克隆抗体结合，加入相应的酶标记抗体后，形成抗原-待测抗体复合物、抗原-单克隆抗体-酶标抗体复合物。抗原-单克隆抗体-酶标抗体复合物能与该酶的底物反应生成有色产物。使用酶标测定仪测定反应物的光密度值(OD值),通过计算对被检测抗体进行定性。5.1.2试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。低温储存的试剂恢复至20℃~25℃后待用，液体试剂使用前5.1.2.2TMB底物溶液，商品化的TMB底物5.1.2.3样品稀释液(商品化抗体稀释液)。5.1.2.4洗涤液：分别称取80.00gNaCl、2.00gKCl、2.00gKH₂PO₁、11.50gNa₂HPO₄,溶于800mL3子水，调pH至7.1～7.3,添加去离子水至1L,加入硫柳汞至终质量浓度为0.01g/mL,加入5mL子水或蒸馏水稀释10倍。5.1.2.5羊抗鼠酶标抗体，商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体。5.1.2.6抗原包被板，用灭活后纯化的鸭瘟病毒(SH2017株)包被的96孔酶联反应板。5.1.2.7鸭瘟病毒阳性对照血清，中和效价1:2～1:8。5.1.2.8阴性对照血清，中和抗体效价低于1:2。5.1.2.9鸭瘟病毒单克隆抗体，中和抗体效价不低于1:4。5.1.3.3洗板机。5.1.4.1血清样品的存放与运送：血清样本置—20℃及以下冷冻保存，避免反复冻融。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。5.1.4.2样品稀释：将待检血清用样品稀释液(5.1.2.3)按1:10稀释后进行测定。重复洗涤3次。可用洗板机(5.1.3.3)或手动洗涤。育1h。5.1.5.8终止：每孔加入终止液(5.1.2.1)50μL,置酶标仪(5.1.3.2)在OD450nm波长下测定各孔5.1.5.9试验成立条件：当阴性血清对照孔平均OD450nm值大于或等于0.8,且阳性对照孔的阻断率(PI)大于或等于50%,判定检测结果有效。阻断率(PI)按式(1)计算。PI=(1-S/N)×100% (1)S——样品孔平均OD450nm值，为2孔样品OD450nm值的平均数；4N——阴性血清对照孔平均OD450nm值，为2孔阴性血清对照OD450nm值的平均数。5.1.7.1当PI≥21.6%,样品判为鸭瘟病毒抗体阳性。5.1.7.2当PI≤15.4%,样品判为鸭瘟病毒抗体阴性。5.1.7.3当15.4<PI<21.6%,样品判为可疑；应再重复检测1次，若结果仍为PI<21.6%,则样品判为鸭瘟病毒抗体阴性。5.2鸭肝炎病毒I型(DHVI)中和试验病毒感染SPF鸡胚后，能够在鸡胚上生长复制，并导致鸡胚死亡，血清中的特异性抗体能够中和病毒，抑制病毒在鸡胚中复制。血清抗体阻止病毒在鸡胚复制的能力能通过血清抗体中和病毒试验进行测定。本方法是应用固定病毒稀释血清，在SPF鸡胚上进行中和试验来测定血清抗体。5.2.2试剂和材料5.2.2.1磷酸盐缓冲溶液(PBS):0.01mol/L,pH7.2,配制按照附录A的A.1的方法。5.2.2.2生理盐水，配制按照A.2的方法。5.2.2.3鸭肝炎病毒I型(鸡胚适应毒)。5.2.3仪器和设备5.2.3.1恒温恒湿培养箱。5.2.4血清样本的处理5.2.4.1血清样本的存放与运送：血清样本置—20℃以下冷冻保存，避免反复冻融。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。5.2.4.2检测前血清样本的处理：血清样本置56℃灭活30min。5.2.5.1样本稀释：用PBS(5.2.2.1)或灭菌生理盐水(5.2.2.2)将待检血清进行2倍系列稀释。5.2.5.2病毒稀释：用PBS(5.2.2.1)或灭菌生理盐水(5.2.2.2)将鸭肝炎病毒I型(鸡胚适应毒)(5.2.2.3)稀释成100ELD₅₀/0.1mL。5.2.5.3中和：取稀释好的病毒液分别与等量2倍系列稀释的血清样本混合，病毒对照为病毒液与PBS(5.2.2.1)或灭菌生理盐水(5.2.2.2)等量混合物，置恒温恒湿培养箱(5.2.3.1)37℃作用1h。5.2.5.4接种鸡胚与中和效价计算：取1:2、1:4、1:83个稀释度中和后的混合物，每个稀释度用注射器(5.2.3.2)尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2mL,同时设病毒对照组(尿囊腔接种0.2mL)和空白对照组(尿囊腔接种0.2mL灭菌生理盐水)各5枚，置37℃孵育至168h,每日用照蛋器(5.2.3.3)照蛋，记录接种后48h～168h死亡的鸡胚数，按Reed-Muench法计算其半数保护量(PD₅o),能使50%鸡胚保护的最高稀释倍数即为该血清的中和抗体效价。半数保护量(PD₅o)按式(2)计算。lgPD₅₀=1gD₁+U₁/U₂×lgA (2)5PD₅₀——半数保护量；D₁——高于或等于50%保护率的血清稀释度；U₁——高于或等于50%的保护率与50%的差值；U₂——高于或等于50%的保护率与低于50%的保护率的差值；A——稀释系数。5.2.5.5试验成立条件：空白对照组鸡胚全部健活，病毒对照组鸡胚死亡数应不少于4枚。中和抗体效价不低于1:4判为阳性。5.3鸭坦布苏病毒(DTMUV)血凝抑制试验病毒表面具有血凝素蛋白，能和红细胞浆膜上的唾液酸受体物质特异结合，当一定量病毒和适当比例的红细胞混合后发生凝集，此为血凝(HA)现象。用病毒特异性抗体和病毒作用，阻断了病毒和红细胞的结合从而抑制了血凝，此为血凝抑制(HI)现象。鸭坦布苏病毒经化学处理后血凝素蛋白暴露，在一定的pH环境下能凝集鸡、鸭、鹅等动物的红细胞。该病毒与检测血清中和后，根据其血凝特性来确定鸭坦布苏病毒抗体在血清中是否存在。除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.3.2.1磷酸盐缓冲溶液(PBS):0.01mol/L,pH7.2,配制按照A.1的方法。100mL,调整pH至6.1,115℃灭菌30min。2℃~8℃保存。5.3.2.3VAD:称取8.77gNaCl、11.1gNa₂HPO₄·12H₂O、24.96gNaH₂PO₄·2H₂O,加入去离子水定容至1000mL,2℃~8℃保存。该溶液与等量BABS混合后pH应为6.2。5.3.2.4硼酸氯化钠溶液：称取8.77gNaCl、4.42gH₃BO₃、0.96gNaOH,加入去离子水定容至1000mL,调整pH至9.0,2℃~8℃保存。5.3.2.5BABS:称取0.1g牛血清白蛋白V,加入硼酸氯化钠溶液(5.3.2.4)至100mL。2℃~8℃保存。5.3.2.6白陶土悬浊液：称取25g白陶土，加入100mL硼酸氯化钠溶液(5.3.2.4),用前摇匀。5.3.2.7鹅红细胞悬液：取未做任何疫苗免疫、无传染病史、无明显临床症状的健康2月龄～36月龄鹅2只～4只，静脉采血，按1:1(体积比)加入阿氏液(5.3.2.2)抗凝。500g/min离心5min,去除阿氏液及白细胞。用PBS洗涤红细胞2次，每次500g/min离心10min,弃上清，加入红细胞压积10倍以上的PBS摇匀，2℃~8℃静置存放。存放时间不超过10d。5.3.2.80.33%鹅红细胞悬液：静置存放的鹅红细胞悬液，使用前弃去上清，重新加入PBS摇匀，以500g/min离心15min,用VAD(5.3.2.3)配制成体积分数为0.33%鹅红细胞悬液，2℃~8℃存放。存放时间不超过48h。5.3.2.910%鹅红细胞悬液：静置存放的0.33%鹅红细胞悬液(5.3.2.8),使用前弃去上清，重新加入PBS摇匀，以500g/min离心15min,用PBS配制成体积分数为10%鹅红细胞悬液，2℃~8℃存放。存放时间不超过48h。效价不低于1:128。65.3.2.11鸭坦布苏病毒阳性血清，HI抗体效价不低于1:80。5.3.2.12鸭坦布苏病毒阴性血清，HI抗体效价低于1:10。5.3.4血清样本的处理5.3.4.1血清样本的存放与运送血清样本置—20℃以下冷冻保存，避免反复冻融。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。5.3.4.2检测前血清样本的处理5.3.4.2.2用微量振荡器(5.3.3.2)剧烈振荡血清-白陶土混合物，每5min振荡1次，共振荡4次。5.3.4.2.3室温下1000g离心20min。5.3.4.2.5每5min轻轻摇动上层清液，不得扰动下层白陶土沉淀，使红细胞保持悬浮状态，共摇动5.3.4.2.6室温下800g离心10min,红细胞沉积于白陶土上层。5.3.4.2.7将上清液移入新管中，即得稀释倍数为1:5的血清样品，待用。5.3.5试验步骤5.3.5.1鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原HA效价测定鸭坦布苏病毒凝集抗原(5.3.2.10)样品加入1mLBABS(5.3.2.5)复原，完全融化成澄清液体后，进行HA效价测定。采用96孔U型微量板进行试验，按表1,从第1孔至第12孔，用微量移液器每孔加入BABS(5.3.2.5)50μL,加入抗原样品50μL。从第1孔起，依次作2倍系列稀释，至第11孔，弃去微量移液器内50μL液体，第12孔为不加样的红细胞对照孔。每孔加入50μL0.33%鹅红细胞悬液(5.3.2.8)。立即在微量板振摇器上摇匀，放入湿盒，置恒温培养箱(5.3.3.3)37℃作用60min,观察凝集反应。结果判定：微量板水平放置，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度为试验抗原血凝效价。表1HA效价测定操作术式孔号123456789红细胞对照稀释倍数稀释液/μL抗原/μL*50.450J弃500.33%鹅红细胞巷液/μL775.3.5.28个血凝单位(8HAU)工作抗原液的制备根据测定的血凝抑制试验抗原的HA效价，用BABS(5.3.2.5)配制8HAU的抗原。血凝效价除以8为抗原的预稀释倍数。效价为1:128,稀释倍数为128/8=16,16倍稀释，即1mL的抗原液加入15mLBABS进行抗原配制完成后应进行标定，即将8HAU抗原液做HA效价测定，稀释至1HAU时应使红细胞完全凝集，稀释至0.5HAU时应使部分红细胞凝集。应用96孔U型微量板进行试验。按表2,将血清(5.3.4.2.7)用BABS(5.3.2.5)作2倍系列稀释，加入25μL8HAU工作抗原液，充分振摇后，置于湿盒内2℃~8℃过夜。取出恢复至室温后，加入50μL0.33%鹅红细胞悬液(5.3.2.8),混匀，放入湿盒，置恒温培养箱(5.3及10%鹅红细胞对悬液(5.3.2.9)对照。表2HI试验操作术式孔号2345678红细胞对照血清对照稀释倍数 一弃508HAU抗原/μL0.33%鹅红细胞悬液/μL微量板水平放置，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，阳性血清对照以凝集图形与红细胞对照孔一致(即红细胞呈显著钮扣状)的血清最高稀释度为判定终点，阴性血清对照孔红细胞应完全凝集。当阴、阳性血清对照的HI效价与已知效价相差不超过1个滴度时，试验结果成立。微量板水平放置，以待检血清凝集图形与红细胞对照孔一致(即红细胞呈钮扣状)的血清最高稀释度作为判定终点；如果待检血清孔红细胞完全凝集，则判为HI效价小于1:5。待检血清的HI抗体效价小于1:10判为阴性，HI抗体效价等于1:10判为可疑，HI抗体效价大于或等于1:20判为阳性。5.4鸭坦布苏病毒(DTMUV)ELISA抗体检测将抗原吸附在固相载体上，加入待检抗体，孵育后再加入针对抗原的单克隆抗体，没有完全被待检血清中抗体结合的抗原即能和后加入的单克隆抗体结合，加入相应的酶标记抗体后，形成抗原-待测抗体复合物、抗原-单克隆抗体-酶标抗体复合物。抗原-单克隆抗体-酶标抗体复合物能与该酶的底物反应生成有色产物。使用酶标测定仪测定反应物的光密度值(OD值),通过计算对被检测抗体进行定性。8除非另有规定，仅使用分析纯试剂。低温储存的试剂恢复至20℃~25℃后待用，液体试剂使用前于800mL去离子水，调pH至7.1～7.3,添加去离子水至1000mL,加入硫柳汞至终质量浓度为0.01g/mL,加入5mLTween-20,混匀，经0.22μm滤器除菌，无菌分装。在使用前用去离子水或蒸馏水稀释10倍。5.4.2.5羊抗鼠酶标抗体，商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体。5.4.2.6抗原包被板，灭活后纯化的鸭坦布苏病毒(FX2010株)包被的96孔酶联反应板。5.4.2.7鸭坦布苏病毒阳性血清，中和效价为1:5～1:20。5.4.2.8鸭坦布苏病毒阴性血清，中和抗体效价低于1:2。5.4.2.9鸭坦布苏病毒单克隆抗体，中和效价不低于1:10。5.4.3.3洗板机。血清样本置—20℃以下冷冻保存，避免反复冻融。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。将待测血清用样品稀释液(5.4.2.3)按1:10稀释后进行测定。释好的待检血清(5.4.4.2)加入到抗原包被板孔中，鸭坦布苏病毒阴性血清(5.4.2.8)和鸭坦布苏病毒阳重复洗涤3次。可用洗板机(5.4.3.3)或手动洗板。膜密封包被板，置37℃孵育1h。95.4.5.9试验成立条件：当阴性血清对照孔平均OD450nm值大于或等于0.8,且阳性血清对照孔的阻断率(PI)大于或等于50%,判定检测结果有效。按5.1.6中式(1)计算阻断率(PI)。5.4.7.1当PI≥18.4%,样品判为鸭坦布苏病毒抗体阳性。5.4.7.2当PI≤12.6%,样品判为鸭坦布苏病毒抗体阴性。5.4.7.3当12.6%<PI<18.4%,样品判为可疑；应再重复检测1次，若PI仍<18.4%,则样品判为鸭坦布苏病毒抗体阴性。5.5番鸭细小病毒(MPV)胶乳凝集抑制试验将抗原或抗体结合在聚苯乙烯胶乳微粒表面，然后与相应的抗体或抗原作用，在电解质存在的适宜5.5.2试剂和材料5.5.2.2番鸭细小病毒(MPV)阳性血清，LPAI效价不低于1:256。5.5.2.3番鸭细小病毒(MPV)阴性血清，LPAI效价低于1:2。5.5.2.4番鸭细小病毒胶乳凝集抗原，LPA效价不低于1:16。5.5.2.5番鸭细小病毒单克隆抗体致敏胶乳，致敏胶乳对抗原的LPA效价不低于1:16。5.5.3.3玻片或96孔细胞培养板盖。5.5.3.4水浴锅。5.5.4血清样本的处理5.5.4.1血清样本的存放与运送血清样本置—20℃以下冷冻保存，避免反复冻融。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。必要时瞬时离心。5.5.4.2检测前血清样本的处理血清样本置水浴锅(5.5.3.4)56℃灭活30min。5.5.5.1番鸭细小病毒(MPV)胶乳凝集抗原效价测定5.5.5.1.1按表3,用生理盐水将番鸭细小病毒胶乳凝集抗原(5.5.2.4)作连续倍比稀释后，取不同稀释度的抗原各10μL分别与等量番鸭细小病毒单克隆抗体致敏胶乳(5.5.2.5)在洁净的玻片或96孔细胞培养板盖(5.5.3.3)上混匀，22℃+4℃或37℃水浴箱中静置5min～15min,观察凝集反应。试验设番鸭细小病毒单克隆抗体致敏胶乳对照(5.5.2.5)、番鸭细小病毒胶乳凝集抗原对照(5.5.2.4)和番鸭细小病毒胶乳凝集抗原(5.5.2.4)加稀释液(5.5.2.1)对照。具体操作见表3。表3胶乳凝集试验孔号1235…稀释倍数稀释液/μL抗原/ul弃50取不同稀释度的抗原10μL与10uL致敏胶乳混匀，22℃±4℃或37℃水浴箱中静置5min～15min,观察5.5.5.1.2结果判定：当番鸭细小病毒单克隆抗体致敏胶乳对照呈“一”、番鸭细小病毒胶乳凝集抗原对者判为阳性；“+”为可疑；“—”为阴性；以出现“++”凝集反应的最高稀释度作为判定终点。具体判定标准如下：——++++:1min～3min形成粗大凝集块，液体澄清；——+++:形成较大的凝集块，且液体澄清；——++:50%胶乳凝集，颗粒明显，液体较澄清；———:无凝集颗粒，液体呈均匀乳状。5.5.5.24个凝集单位抗原的制备如抗原凝集价测定结果为1:64,4个凝集单位即做1:16倍稀释(稀释倍数为64/4=16)。取生理盐水(5.5.2.1)15mL,加番鸭细小病毒胶乳凝集抗原(5.5.2.4)1mL,混匀，使最终浓度为1:16(即4个凝集单位),将1:16稀释的抗原加等量稀释液即成2个凝集单位的抗原。检查4个凝集单位抗原的凝集价是否准确，应将0.1mL番鸭细小病毒胶乳凝集抗原(5.5.2.4)分别加入0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL生理盐水(5.5.2.1)中，使最终稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5和1:6。取不同稀释度抗原10μL分别与等量番鸭细小病毒单克隆抗体致敏胶乳(5.5.2.5)混匀，22℃+4℃或37℃水浴箱中静置5min～15min,如果配制的抗原液为4单位，则1:4稀释度出现终点；如果高于4单位，可能1:5或1:6出现终点；如果低于4单位，可能1:3或1:2出现终点。应根据检验结果做适当调整，使工作液确为4单位。同理检查2单位的凝集价是否5.5.5.3.1按表4,取被检血清(5.5.4.2)50μL加入第1孔[4个凝集单位抗原孔(5.5.5.2)]中，混匀后取50μL加入第2孔，以此类推，以2单位抗原液连续倍比稀释，并设番鸭细小病毒阳性血清(5.5.2.2)、番鸭细小病毒阴性血清(5.5.2.3)、番鸭细小病毒单克隆抗体致敏胶乳(5.5.2.5)及2单位抗原和1单位番鸭细小病毒胶乳凝集抗原对照，37℃水浴中感作60min;各取上述混合液10μL分别与等量致敏胶乳在洁净的玻片或96孔细胞培养板盖(5.5.3.3)上混匀，22℃+4℃或37℃水浴箱中静置5min～15min,判定结果。表4胶乳凝集抑制试验孔号123456000002单位抗原/μl.0弃505.5.5.3.2结果判定：当番鸭细小病毒单克隆抗体致敏胶乳对照呈“一”、2单位番鸭细小病毒胶乳凝集抗原对照呈“++++”、1单位番鸭细小病毒胶乳凝集抗原对照呈“++”、番鸭细小病毒胶乳凝集抗原加稀释液呈“一”、番鸭细小病毒阳性血清对照呈“一”、番鸭细小病毒阴性血清对照呈“++++”、番鸭细小病毒阳性血清加番鸭细小病毒单克隆抗体致敏胶乳呈“一”、番鸭细小病毒阴性血清加番鸭细小病的最高血清稀释倍数判为终点。待检血清阳性的LPAI效价不低于1:2判为阳性。具体判定标准如下：—++++:1min～3min内出现粗大凝集块，液体澄清；——+++:形成较大的凝集块，且液体澄清；——++:50%胶乳凝集，颗粒明显，液体较澄清；———:无凝集颗粒，液体呈均匀乳状。5.6番鸭小鹅瘟病毒(GPV)胶乳凝集抑制试验将抗原或抗体结合在聚苯乙烯胶乳微粒表面，然后与相应的抗原或抗体作用，在电解质存在的适宜5.6.2试剂和材料5.6.2.2番鸭小鹅瘟病毒(GPV)阳性血清，LPAI效价不低于1:256。5.6.2.3番鸭小鹅瘟病毒(GPV)阴性血清，LPAI抗体效价小于1:2。5.6.2.4番鸭小鹅瘟病毒胶乳凝集抗原，LPA效价不低于1:16。5.6.2.5番鸭小鹅瘟病毒单克隆抗体致敏胶乳，致敏胶乳对抗原的LPA效价不低于1:16。5.6.3.1台式低温离心机。5.6.3.3玻片或96孔细胞培养板盖。5.6.3.4水浴锅。5.6.4血清样本的处理5.6.4.1血清样本的存放与运送血清样本置—20℃以下冷冻保存，避免反复冻融。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。必要时瞬时离心。5.6.4.2检测前血清样本的处理血清样本置水浴锅(5.6.3.4)56℃灭活30min。5.6.5.1番鸭小鹅瘟病毒(GPV)胶乳凝集抗原效价测定5.6.5.1.1按表5,用生理盐水(5.6.2.1)将番鸭小鹅瘟病毒胶乳凝集抗原(5.6.2.4)进行2倍系列稀释后，取不同稀释度的抗原各12μL分别与6μL番鸭小鹅瘟病毒单克隆抗体致敏胶乳(5.6.2.5)在洁净的玻片或96孔细胞培养板盖(5.6.3.3)上混匀，37℃水浴中静置20min,观察凝集反应并判断结果。试验设表5胶乳凝集试验孔号1234稀释液/μI抗原/μl5.6.5.1.2结果判定：当番鸭小鹅瘟病毒单克隆抗体致敏胶乳对照呈“一”、番鸭小鹅瘟病毒胶乳凝集抗以出现“十+”凝集反应的最高稀释度作为判定终点。具体判定标准如下：——+十十：形成较大的凝集块，且液体澄清；——+十：50%胶乳凝集，颗粒明显，液体较澄清；——+:少量胶乳凝集，液体较混浊；——-:无凝集颗粒，液体呈均匀乳状。5.6.5.24单位凝集抗原制备5.6.5.2.1如抗原凝集价测定结果为1:64,4个凝集单位配制即做1:16倍稀释(稀释倍数为64/4=16)。取生理盐水(5.6.2.1)15mL,加番鸭小鹅瘟病毒