蛋白质化学精讲

第二章蛋白质化学

主要内容：介绍氨基酸的结构、分类、性质及肽的概念，重点讨论蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互关系。目录第一节蛋白质元素组成及生理功能第二节蛋白质的基本结构单位──氨基酸第三节肽第四节蛋白质的分子结构第五节蛋白质的分子结构与功能的关系第六节蛋白质的重要性质第七节蛋白质分类（自学）蛋白质主要元素组成：C、H、O、N、S及P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se等微量元素。

蛋白质平均含N量为16％,这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据：

蛋白质含量＝蛋白质含N量×6.25三聚氰胺

三聚氰胺（cyanuramide），分子式C3H6N6。三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。又称蜜胺、2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪。白色单斜棱晶。

三聚氰胺是一种重要的有机化工中间产品，主要用来制作三聚氰胺树脂，具有优良的耐水性、耐热性、耐电弧性、优良阻燃性。用途：可用于装饰板的制作，用于氨基塑料、粘合剂、涂料、币纸增强剂、纺织助剂等。三聚氰胺

三聚氰胺是一种重要的有机化工原料(详细解释见:/html/20080912/20080912_109294.shtml),既然是一种化工原料为什么跑到八杆子打不到的奶粉里呢?大家知道,奶粉一个重要指标就是蛋白质含量,蛋白质的主要组成成分是氨基酸,目前的快速检测法(凯氏定氮法),就是通过估计氮的含量来间接估计蛋白质的含量,而三聚氰胺这种东西,最大的特点就是氮的含量很高,高达66%,加入这个东西,能提高产品的蛋白质的检测含量.所以它又美其名曰"蛋白精".

你可以google"三聚氰胺+蛋白精"就可以惊人的发现,原来有多少不法商人在做这个生意,但一般是打动物饲料的主意,有人宣称,可以随意配置你所需要的蛋白含量.大量摄入三聚氰胺，会损害人体和动物的生殖、泌尿系统，产生肾、膀胱结石，其危害性是早就明确了的。美国在从中国进口的动物饲料里发现这个东西影响动物健康后,已经禁止使用这个作为饲料添加剂.而中国却变本加厉,用做了人而且是婴儿产品的添加剂.蛋白质的主要生理功能

蛋白质（protein）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：催化功能；结构功能；调节功能；防御功能；运动功能；运输功能；信息功能；储藏功能

蛋白质的基本结构单位──氨基酸一、氨基酸的通式二、蛋白质氨基酸、稀有的蛋白质氨基酸和

非蛋白质氨基酸的概念三、二十种常见的蛋白质氨基酸分类、结构及三字符号四、氨基酸的性质五、氨基酸的生产和应用-氨基酸的通式

氨基酸光学性质

1、除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。2、参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区（220-300nm）显示特征的吸收谱带，最大光吸收（

max）分别为279、278、和259nm。由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。生物体内的氨基酸类别蛋白质氨基酸：蛋白质中常见的20种氨基酸稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨基酸。二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号

据营养学分类

必需ＡＡ非必需ＡＡ据R基团化学结构分类

脂肪族ＡA（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)杂环ＡＡ(His、Pro)据R基团极性分类极性R基团AA非极性R基团AA（８种）不带电荷（７种）带电荷：正电荷（３种）负电荷（２种）据氨基、羧基数分类一氨基一羧基ＡＡ一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)

人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThr

Arg、His非极性R基团氨基酸不带电荷极性R基团氨基酸带电荷R基团氨基酸甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）缬氨酸（Val,V）亮氨酸（Lue,L）异亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸（Ser,S）苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）碱性氨基酸

赖氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）组氨酸（His,H）杂环杂环氨基酸

组氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trg,W）

氨基酸的性质

（1）两性解离和等电点（2）光学性质（3）重要化学反应

a.与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定.

b.与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定.

c.与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应），用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。氨基酸的两性解离性质及等电点

pH=pI

净电荷=0

pH<

pI净电荷为正pH>pI净电荷为负CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3++H++

OH-+H++

OH-(pK´1)(pK´2)

当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelectric

point，pI)。

氨基酸等电点的计算

可见，氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK′值之和的二分之一。pI=2pK´1+pK´2一氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´2+pK´R二氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´1+pK´R一氨基二羧基AA的等电点计算：TrpTyrPhe的紫外吸收光谱

摩尔吸收系数波长氨基酸与茚三酮反应+3H20水合茚三酮(无色)NH3CO2RCHO+还原性茚三酮普鲁士蓝

(弱酸)加热水合茚三酮+2NH3+还原性茚三酮氨基酸与茚三酮反应紫色化合物铊中毒症状最初为胃肠道刺激症状，如恶心、呕吐、食欲减退，腹绞痛或隐痛，也有牙龈糜烂以及出血性胃炎等，有时患者仅表现为厌食或恶心。中毒后2至5天出现双下肢酸、麻、针刺感，下肢特别是足部疼痛是铊中毒的突出表现。运动障碍出现较晚，常可波及颅神经，可发生视力减退、中毒性脑病。脱发也是铊中毒的体征，一般于中毒后1至3周左右发生。指甲和趾甲于第4周出现白色横纹。普鲁士蓝即亚铁氰化铁，是一种无毒色素

.氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应

（sanger反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色)++HF弱硷中氨基酸氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应

（Edman反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱硷中(400

C)(硝基甲烷400

C)H+第三节肽一、肽(peptide)和肽键(peptidebond)的概念二、肽的重要性质

酸碱性质、重要化学反应类似于氨基酸性质三、天然存在的活性肽生理活性肽的功能类别：激素、抗菌素、辅助因子

实例：谷胱甘肽(glutathione,GSH)

短杆菌肽

促甲状腺素释放因子（TRH）

-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯（甜味剂）肽和肽键的形成肽键肽单位谷胱甘肽

谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。促甲状腺素释放因子（TRH）短杆菌肽S

-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯CH2NH2

CH

C

NH

CH

C

OO

CH2COOH

O

CH3第四节蛋白质的分子结构

一、蛋白质的结构层次的划分二、蛋白质的一级结构三、多肽主链折叠的空间限制和

维持蛋白质构象的作用力四、蛋白质的二级结构五、蛋白质的超二级结构和结构域六、蛋白质的三级结构七、蛋白质的四级结构蛋白质结构的主要层次一级结构四级结构二级结构三级结构primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二级结构结构域

supersecondarystructureStructuredoman二、蛋白质的一级结构

多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质的一级结构(primarystructure)。这是蛋白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。一级结构测定例：牛胰岛素的一级结构一级结构测定

基本战略：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法要点：a.测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分

b.

测定肽键的N－末端和C－末端

c.

应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段。

d.

分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序

e.

将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。蛋白质顺序测定基本战略

将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质酰胺平面与α-碳原子的二面角（φ和ψ

）

二面角

两相邻酰胺平面之间，能以共同的Cα为定点而旋转，绕Cα-N键旋转的角度称φ角，绕C-Cα键旋转的角度称ψ角。φ和ψ称作二面角，亦称构象角。完全伸展的多肽主链构象α-碳原子酰胺平面Φ=1800，ψ=1800Φ=00，ψ=00的多肽主链构象酰胺平面Φ=00，ψ=00侧链非键合原子接触半径维持蛋白质分子构象的作用力

a.盐键b.氢键c.疏水键d.范得华力e.二硫键多肽链四、蛋白质的二级结构

(１)α－螺旋（α－helix）(２)β－折叠（β-pleatedsheet）(３)β－转角（β-turn）(４)无规则卷曲（nonregularcoil）蛋白质的二级结构（secondarystructure）指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元．主要有以下类型：特征：1、每隔3.6个AA残基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;

2、螺旋体中所有氨基酸残基R侧链都伸向外侧，链中的全部>C=0和>N-H几乎都平行于螺旋轴;3、每个氨基酸残基的>N-H与前面第四个氨基酸残基的>C=0形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。

α－螺旋（α－helix）形成因素：与ＡＡ组成和排列顺序直接相关。多态性：多数为右手（较稳定），亦有少数左手螺旋存在（不稳定）；存在尺寸不同的螺旋。β－折叠（β-pleatedsheet）

特征：两条或多条伸展的多肽链（或一条多肽链的若干肽段）侧向集聚，通过相邻肽链主链上的N-H与C=O之间有规则的氢键，形成锯齿状片层结构，即β－折叠片。类别：平行反平行

β－转角（β-turn）

特征：多肽链中氨基酸残基n的羰基上的氧与残基（n+3）的氮原上的氢之间形成氢键，肽键回折1800。无规则卷曲示意图无规则卷曲细胞色素C的三级结构五、蛋白质的超二级结构和结构域

(2)结构域（structuredomain）

蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个α－螺旋或β－折叠或β－转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构

基本组合方式：αα；β×β；βββ

在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。

形成意义：

动力学上更为合理

蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性(１)超二级结构（supersecondarystructure

）超二级结构类型βββααβ×β12345

52341

Β-链βαββ-迂回回形拓扑结构回形拓扑结构β-迂回卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域-螺旋-转角-折叠二硫键结构域1结构域2

丙酮酸激酶结构域4羧肽酶

腺苷酸激酶

(a)(b)

丙糖磷酸异构酶乳酸脱氢酶结构域1黄素蛋白平行

-折叠的结构比较（a）

-园桶形排布，（b）马蹄形排布

六、蛋白质的三级结构

多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使α－螺旋、β－折叠片、β－转角等二级结构相互配置而形成特定的构象。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。

实例：肌红蛋白

核糖核酸酶肌红蛋白三级结构核糖核酸酶三级结构示意图

N

His12CHis119Lys41七、蛋白质的四级结构

四级结构是指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范得华力。亚基本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。实例：血红蛋白

烟草花叶病毒的外壳蛋白四级结构血红蛋白四级结构

烟草花叶病毒外壳蛋白四级结构的自我组装

第五节蛋白质的分子结构与功能的关系

一、蛋白质一级结构与功能二、蛋白质高级构象与功能蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。

一级结构决定高级结构，

也决定蛋白质的功能1、蛋白质一级结构的种属差异与同源性

实例：细胞色素Ｃ2、蛋白质一级结构的变异与分子病

实例：血红蛋白质异常病变

镰刀型贫血病3、蛋白质前体的激活与一级结构

实例：胰岛素原的激活

高级构象决定蛋白质的功能

1、蛋白质高级构象破坏，功能丧失

实例：核糖核酸酶的变性与复性2、蛋白质在表现生物功能时，构象发生一定变化（变构效应）

实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能不同生物与人的Cytc的AA差异数目生物与人不同的AA数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、猪、羊、狗11马12鸡、火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44

不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素细胞色素c分子的空间结构不变的AA残基

35个不变的AA残基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图镰刀形红细胞正常红细胞

-链N端氨基酸排列顺序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…

Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图

核糖核酸酶变性与复性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis变性复性血红蛋白输氧功能和构象变化O2HbHb-O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin第六节蛋白质的重要性质

一、两性解离性质及等电点二、蛋白质胶体性质三、蛋白质的沉淀四、蛋白质的变性与复性五、蛋白质的紫外吸收特性六、蛋白质呈色反应

蛋白质两性解离性质和等电点

pH=pI

净电荷=0

pH<

pI净电荷为正pH>pI净电荷为负PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+

当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectric

point，pI）。二、电泳技术

1．电泳的一般原理2.

电泳技术的类别

3、常用电泳技术4、电泳技术的拓展电泳的一般原理

电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。电泳技术分类垂直板电泳毛细管电泳水平板电泳电泳支持物滤纸凝胶薄膜圆盘电泳常用电泳技术1、醋酸纤维薄膜电泳2、聚丙烯酰胺凝胶电泳3、琼脂糖电泳4、毛细管电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）

1、一般PAGE2、SDS3、PAGE等电点聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

PAGE是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶(PAG)作为支持物，采用电泳基质的不连续体系(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性)或连续体系（一层凝胶、一种pH和一种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N

-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TEMED

光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED

不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应不连续PAGE的浓缩效应

样品浓缩胶分离胶快离子慢离子蛋白质ABC++--样品浓缩胶分离胶电极缓冲液低电位梯度E11高电位梯度E21+-SDS

原理：

当SDS（SodiumDodecylSulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示：

LogMr=a–bmr应用:测定蛋白质分子量测定蛋白质亚基数Mr（相对迁移率）mr（相对迁移率）LogMr等电点聚焦（isoelectricfocusing）

原理:

在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：

高效率分离纯化蛋白质测定蛋白质分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+线性梯度琼脂糖电泳

琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，这种多糖链在1000C左右时呈液态，当温度下降到450C以下时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。

琼脂糖凝胶用作电泳的固相支持物具有分子筛效应，其对生物分子的分离作用不仅与其分子的构象及其相对分子质量大小有关，而且与凝胶的浓度也有密切关系，故可根据分离对象分子量大小选择适当浓度的凝胶。

琼脂糖电泳常用于核酸分离，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为2OObP至5Okb的DNA，

琼脂糖凝胶还常用作免疫电泳的固相支持物。不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA的范围琼脂糖凝胶浓度／(%)可分辨的线性DNA大小范围／(kb)

0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1DNA相对分子质量标准物水平型平板电泳槽

蛋白质胶体性质

由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。

蛋白质胶体性质的应用透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。

盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（saltingout）。透析（dialysis）半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器

透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：

玻璃纸（赛璐玢纸，cellophanepaper）

火绵纸（赛璐玎纸,celloidinpaper）

其他改型纤维素材料超过滤（ultrafiltration）

利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。滤膜抽气滤膜离心AB蛋白质的沉淀

如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。沉淀方法类别:

1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）2、酸硷（等电点沉淀）3、有机溶剂沉淀4、重金属盐类沉淀5、生物碱试剂和某些酸类沉淀6、加热变性沉淀

蛋白质变性与复性

●蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性作用（denaturation）。

表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和化学性质（化学反应，被酶解性）改变

应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老……

●蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。蛋白质主要呈色反应

双缩脲反应酚试剂反应→蛋白质定量、定性

茚三酮反应测定常用方法

双缩脲反应

蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物红紫色络合物(硷性溶液)Cu2+蛋白质的紫外吸收光谱

蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260测定范围：0.1～0.5mg/ml第一节生物大分子物质的制备

一．一般过程和原则二．注意事项三．纯化方案的设计和评价例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化确立有效成分的测定方法材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的抽提有效成分的纯化和浓缩生物大分子分离纯化的一般步骤和原则

层析法电泳法超离心法透析和超滤盐析（硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀离心│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）生物组织→→提取液→

→粗产品→→结晶分子大小溶解度电荷性质吸附性质生物亲和力依据原理注意事项

基本原则：防止生物分子变性、降解1．控制适当的pH2．控制低温