生物化学与分子生物学技术原理-6市公开课一等奖百校联赛特等奖课件

绪论生物化学与分子生物学定义与其它学科关系发展简史实际应用第1页

什么是生物化学？

简单说，生物化学是生命化学。

生物化学是用化学理论和方法作为主要伎俩，硕士物体基本物质结构（如Carbohydrates,Lipids,ProteinsandNucleicacid)、性质及其生命活动改变规律（生命活动如：生长、生殖、代谢、运动等）第2页是硕士物体化学组成与性质（静态生化，StaticBiochemistry)，以及机体内所进行化学改变(DynamicBiochemistry)科学。第3页

分子生物学是研究核酸、蛋白质等全部生物大分子形态、结构特征及其主要性、规律性和相互关系科学。分子生物学(molecularbiology)是生物化学主要组成部分。第4页生物化学与分子生物学

同相关学科关系生物化学与分子生物学是生物学最深层次；生物化学与分子生物学是化学最高层次；生物化学与分子生物学为农学、医学和食品科学提供理论依据和研究伎俩；物理学、信息科学和数学为生物化学与分子生物学提供研究伎俩。第5页与生物化学关系最为亲密研究方向侧重点研究方法分子生物学生物大分子结构与功效、分子间信息传递生物化学与遗传学生物化学大分子代谢转化生物化学与化学以及生理学但存在一定差异第6页分子生物学三大标准1)组成生物大分子单体是相同共同核酸语言共同蛋白质语言2)生物遗传信息表示中心法则相同

DNARNAproteincharacter3)生物大分子单体排列（核苷酸、氨基酸）不一样

不一样高级结构不一样生物大分子之间互作不一样物种特征第7页准备和酝酿阶段

时间：19世纪后期到20世纪50年代初。两点重大突破：确定了蛋白质是生命主要基础物质；确定了生物遗传物质基础是DNA。

第8页当代分子生物学建立和发展阶段时间：从50年代初到70年代初，1953年Watson和CrickDNA双螺旋结构模型作为当代分子生物学诞生里程碑。主要进展包含：遗传信息传递中心法则建立对蛋白质结构与功效深入认识第9页

初步认识生命本质并开始改造生命深入发展阶段时间：70年代后－至今基因工程技术作为新里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命新时期开始。第10页生物化学中关键技术电泳（1923）生物大分子分离、分析超离心（1925）蛋白质、细胞亚器官分离；分子量确实定同位素标识（1934）物质代谢路径、生物大分子结构测定层析（1944）生物大分子分离纯化X-光衍射、NMR：生物大分子结构测定第11页超速离心（1920S）电泳（1930S）电镜（1930S）同位素示踪（1940S）柱层析（1940S）X射线衍射（1950S）氨基酸分析与测序（1950S）核酸杂交（1960S）核苷酸测序（1970S）

重组DNA技术（1970S）DNA合成（1980S）单克隆抗体组织化学（1980S）聚合酶链式反应（1980S）分子生物学惯用技术第12页1901-111项生理医学诺贝尔奖中，69项（62%）颁给了生物化学与分子生物学领域第13页发展历程分子生物学中重大成就与突破者－－－NobelPrize取得者－－－组成了分子生物学发展主要内容－－－里程碑1910科赛尔Kossel（德）蛋白质、细胞及细胞核化学研究（首先分离到A、T和组氨酸）第14页

1958莱德伯格Lederberg（美）噬菌体转导比德尔

Beadle&泰特姆

Tatum（美）Onegene-oneenzyme红色面包霉突变体BeadleTatum

Lederberg第15页

1959奥乔亚

Ochoa(美籍西班牙裔)

科恩伯格

Kornberg（美）Ochoa

Kornberg

细菌多核苷酸磷酸化酶，成功地合成了RNA，基因（DNA）→RNA→蛋白质

实现了DNA分子在试管内（细菌无细胞提取液）复制第16页

1962Watson（美）＆Crick（英）

Wilkins（新西兰）经过DNA分子X射线衍射研究证实DNADoubleHelixModel第17页DNA双螺旋发觉深刻意义确立了核酸作为信息分子结构基础;提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递基本方式；最终确定了核酸是遗传物质基础；为认识核酸与蛋白质关系及其在生命中作用打下了最主要基础。

第18页

1962肯德鲁

Kendrew＆佩鲁茨

Perutz（英国）Kendrew

Perutz

测定了肌红蛋白及血红蛋白高级结构（三级）

成为硕士物大分子结构先驱第19页

1965雅各布

Jacob＆莫诺

Monod（法国）Jacob

Monod

提出并证实了Operon作为调整细菌细胞代谢分子机制首次提出mRNA分子存在第20页

1969Nirenberg（美）Holly＆Khorana尼伦伯格Nirenberg克拉纳Khorana

霍利Holley

破译了遗传密码酵母phetRNA核苷酸序列并证实了全部tRNA三级结构相同性第一个合成了核酸分子，并人工复制了酵母基因第21页

1975Temin，Baltimore(美)&

Dulbecco特明Temin巴尔摩Baltimore发觉了逆转录酶（以RNA为模板，逆转录生成DNARNA肿瘤病毒）杜尔贝克Dulbecco第22页桑格Sanger吉尔伯特Gilbert伯格Berg1980Sanger（英）Gilbert&Berg（英）酶法核苷酸测序设计者化学测序法设计者DNA重组，在细菌中表达胰岛素DNA重组技术元老Sanger还因为测定了牛胰岛素一级结构而取得1958年诺贝尔化学奖。第23页

1984Kohler（德）Milstein（美）Jerne（丹麦）科莱尔Kohler米尔斯坦Milstein杰尼

Jerne发展了单克隆抗体(MonoclonalAntibodiesMcAb)技术，完善了极微量蛋白质检测技术第24页

1988麦克林托克

McClintock(美)可移动遗传因子（jumpinggeneormobileelement）McClintock50年代初发觉88年获奖第25页

1989奥尔特曼

Altman（加）＆切赫

Cech（美）核酶即核糖核酸质酶（Ribozyme）发觉者（即一些RNA含有酶功效）SidneyAltman

ThomasR.Cech

第26页

1989Bishop＆Varmus（美）正常细胞一样带有原癌基因

1993Roberts＆Sharp（美）断裂基因（splittinggene）

Mullis（美）PCR仪创造者

Smith

基因定点突变

1994Gilman＆Rodbell

发觉G蛋白在细胞信号传导中作用

1995Lewis（美）、Nusslein－Volhard（德）、Wieschaus（美）

20世纪40～70年代先后独立判定了控制果蝇体节发育基因第27页1990.10：被誉为生命科学“阿波罗登月计划”人类基因组计划（HGP）开启。1998.5：美国科学家克里格文特创建塞莱拉遗传企业，目标是投入３亿美元，到２００１年绘制出完整人体基因组图谱，与国际HGP展开竞争。1999.12.1：国际HGP联合研究小组宣告，他们完整地破译出人体第22对染色体遗传密码。2000.3.14：当初美国总统克林顿和英国首相布莱尔发表联合申明，呼吁将人类基因组研究结果公开，方便世界各国科学家都能自由地使用这些结果。2000.5：国际HGP完成时间预计从原定年6月提前至6月。2000.6.26：科学家公布人类基因组“工作框架图”。2001.2：国际HGP(美、英、日、德、法和中国)科学家和美国塞莱拉企业分别宣告完成绘制人类基因组测序草图。分别在15日出版《Nature》和16日《Science》公布。人类基因组计划(HumanGenomeProject)第28页“What’sHumanGenomeProject?”“OnebaseOnedollar!”-byataxidriver(andataxpayer)第29页humanArabidopsis拟南芥ThermotogamaritimaEscherichiacoli大肠杆菌Buchnerasp.APSRickettsiaprowazekiiUreaplasmaurealyticumBacillussubtilisDrosophilamelanogasterThermoplasmaacidophilumPlasmodiumfalciparumHelicobacterpylorimouseCaenorhabitiselegansratBorreliaburgorferiBorreliaburgorferiAquifexaeolicusNeisseriameningitidisZ2491Mycobacteriumtuberculosis全基因组已经测序一些生物第30页生物化学与分子生物学意义

1.生物化学是各门生物科学基础，也是揭开生命奥秘主要基础。2.生物化学在工业上广泛应用比如：食品工业中酱油大豆蛋白曲霉水解氨基酸美拉德反应酱油啤酒生产：大麦芽+大米麦芽糖、葡萄糖+氨基酸啤酒酵母（7天）乙醇、糖、双乙酰低温发酵（20天）啤酒第31页生物有效物质提取制药工业：链激酶、尿激酶、氨基酸、核甘酸（所谓基因营养物）、SOD、紫杉醇等。生物制品：疫苗皮革工业：角质酶脱毛

生物化学不但为这些生产过程建立了科学基础并为其技术改造创造了条件第32页与农业方面有亲密联络

举例作物病理研究

a.玉米大斑病（每年损失20-40%产量）抗病蛋白

b.水稻白叶枯病（损失20-30%产量）奶牛产奶量与营养关系中国奶牛普通4-5吨/年产国外奶牛8-10吨/年产食量自动化，营养个体化第33页重组DNA技术应用第34页1212野生型转基因抗真菌病转基因草坪草抗棉铃虫棉花抗虫水稻第35页全球转基因农作物销售额及预测第36页生物工程作物防虫（转基因棉花、转基因西红柿）生物制药（转基因动物-人血白蛋白）作物育种（转基因水稻-抗除草剂）第37页Atobaccoplantexpressingthegeneforfireflyluciferase.Lightwasproducedaftertheplantwaswateredwithasolutioncontainingluciferin,thesubstrateforthelight-producingluciferaseenzyme(seeBox13–2).Don’texpectglow-in-the-darkornamentalplantsatyourlocalplantnurseryanytimesoon.Thelightisactuallyquiteweak;thisphotographrequireda24-hourexposure.Therealpoint—thatthistechnologyallowstheintroductionofnewtraitsintoplants—isneverthelesselegantlymade.烟草表示萤火虫荧光素基因第38页表示抗虫基因西红柿第39页Glyphosate-resistantsoybeanplants.ThephotographsshowtwoareasofasoybeanfieldinWisconsin.(a)Withoutglyphosatetreatment,thispartofthefieldisoverrunwithweeds.(b)Glyphosateresistantsoybeanplantsthriveintheglyphosate-treatedsectionofthefield.Glyphosatebreaksdownrapidlyintheenvironment.Agriculturaluseofengineeredplantssuchastheseproceedsonlyafterconsiderabledeliberation,balancingtheextraordinarypromiseofthetechnologywiththeneedtoselectnewtraitswithcare.Bothscienceandsocietyasawholehaveastakeinensuringthattheuseoftheresultantplantshasnoadverseimpactontheenvironmentoronhumanhealth.转草甘膦基因大豆第40页Cloninginmice.Thegeneforhumangrowthhormonewasintroducedintothegenomeofthemouseontheright.Expressionofthegeneresultedintheunusuallylargesizeofthismouse.表示人生长激素老鼠第41页喷洒工程菌去除石油污染美国GE企业结构成功含有巨大烃类分解能力工程菌，并获专利，用于去除石油污染。第42页生化与司法判定司法判定是健全法制中一个必需工作步骤，它包含了法律上要判定一切事、屋和人。受伤与死亡现象中生化

a.DNA含量随死亡时间而下降b.心肌丁二酸脱氢酶、细胞色素氧化酶随死亡时间而上升c.精子DNA第43页DNA指纹技术应用亲子判定（VNTR）

第44页亲子判定风靡意大利（几十万）当代家庭“情流感”

第45页

犯罪分析血液、唾液、头发、精液和其它出现在犯罪现场样品成为嫌疑犯被监禁或释放强有力证据误差率在百万分之一以下，结果非常准确。第46页DNA身份证DNA指纹技术让你能拥有一张独一无二真正意义上个人识别身份证。个人DNA基因身份证第47页第一章：生物大分子提取、沉淀和离心分离第48页第一节生物大分子提取

蛋白质（包含酶），核酸，脂类，糖类等生物大分子制备分四个阶段：一.选择材料和预处理二.细胞破碎及细胞组分分离三.提取和纯化四.浓缩，干燥和保留第49页一.选择材料及预处理动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子原材料，所选取材料主要依据试验目标来确定。

有效成份是指欲纯化某种单一生命大分子物质。而有效成份以外其它物质则统称杂质。

第50页1.动物组织：

选材：必须选择有效成份含量丰富且易分离脏器组织为原材料。

脱脂：脏器中含量较高脂肪，轻易氧化酸败，造成原料变质影响纯度操作和制品率。

保留：对预处理好材料，若不马上进行试验，应冷冻保留。

a.冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保留：－10℃冰箱内；长久保留：－70℃低温冰箱内。

b.干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备用；对于含耐高温有效成份（如：肝素）肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长久保留。

第51页2.植物材料：

选材：注意植物品种和生长发育情况不一样，其中所含生物大分子量改变很大，另外与季节性关系亲密。

a.提取核DNA：选取黄化苗（生长7－10天小麦，水稻），预防叶绿体DNA干扰

b.提取RNA：依据试验目标选取生长幼嫩组织为好。

保留：冷冻采样后尽快放于－4℃――20℃冰箱内。

DNA,RNA采样后，N2速冻，至－70℃冰箱。对RNA样，如不马上使用，冷冻保留尤为主要。第52页3.微生物：

选材：应注意它生长久，在微生物对数生长久，酶和核酸含量较高，能够取得高产量，以微生物为材料时有两种情况：

a.利用微生物菌体分泌到培养基中代谢产物和胞外酶等。普通用离心法搜集上清液，上清液只能在低温下短期保留

b.利用菌体含有生化物质，如：蛋白质，核酸和胞内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保留，冻干粉可在4℃保留数月。

3.第53页二.确定测定方法在效成份在原材料中含量较低，纯化是使其纯度增高过程，所以，提取和分离每个步骤均要测定有效成份含量。测定方法要专一、准确、灵敏和简便。使用较多测定方法有分光光度法、荧光分析法、生物活性(如酶活力、激素活性)测定、电泳分析等，有时可用电化学法和免疫分析法。第54页三.细胞破碎1.机械破碎：(1)研磨法：

剪碎动物组织如鼠肝、兔肝等置研钵中，用研磨棒研碎。为了提升研磨效果，可加入一定量石英砂。用匀浆器处理，也能破碎动物细胞。细菌和植物组织细胞破碎均可用此法。第55页(2)组织捣碎器法：用捣碎器(转速8000-10000r/m)处理30-45s可将植物和动物细胞完全破碎。不过在捣碎期间必须保持低温，捣碎时间不易太长，以防温度升高引发有效成份变性。现在多用细胞破碎仪。(3)超声波法：借助声波震动力破碎细胞壁和细胞器有效方法。多用于微生物细胞破碎，常采取间歇处理和降低温度方法进行。第56页(4)压榨法：是一个温和、彻底破碎细胞方法。用30MPa左右压力迫使几十毫升细胞悬液经过一个小孔(＜细胞直径孔)，致使其被挤破、压碎。(5)冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40℃左右)快速融化。如此重复冻融屡次，细胞可在形成冰粒和增高剩下胞液盐浓度同时，发生溶胀、破碎。第57页2.溶涨和自溶：

溶涨：细胞膜为天然半透膜，在低渗溶液如低浓度稀盐溶液中，因为存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引发细胞膜发生胀破现象称溶胀。比如红血球置清水中会快速溶胀破裂并释放出血红素。

自溶：细胞结构在本身所含有各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解现象称自溶。应用此法时要尤其小心操作，因为水解酶不但可使细胞壁、细胞膜破坏，同时也可将一些有效成份在自溶时分解。3.化学处理：

用脂溶性溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂(如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠)处理细胞时，可将细胞壁、细胞膜结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类或DNA等物质，并造成整个细胞破碎。

第58页4.生物酶降解：生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁功效。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来是因渗透压差引发细胞膜破裂，最终造成细胞完全破碎。

比如从一些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采取了加溶菌酶(来自蛋清)破坏细胞壁步骤。当有些细菌对溶菌酶不敏感时，可加巯基乙醇（ME）或者8mol/L尿素，以促进细胞壁消化。另外，也可加入蛋白酶K来提升破壁效果。

第59页四.抽提1.抽提含义：

抽提通常是指用适当溶剂和方法从原材料中把有效成份分离出来过程。经过处理原材料中有效成份可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（如丙酮、乙醇）等抽提，有时还可用蒸馏水抽提。

普通理想抽提液应具备下述条件：对有效成份溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；起源广泛、价格低廉、操作安全等。第60页2.抽提影响因子在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂浓度和极性等因子，可显著影响有效成份性质和数量。所以选择抽提液必须考虑这些原因。（1）pH值：改变溶质解离状态。对蛋白质或酶等含有等电点两性电解质物质，普通选择抽提液pH值应在偏离等电点稳定范围内。通常碱性蛋白质选取低pH值溶液抽提，酸性蛋白质选取高pH值溶液抽提。第61页(2)溶剂极性和离子强度：有些生物大分子在极性大、离子强度高溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低溶液中稳定。比如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2mol/L蔗糖水溶液。一个物质溶解度大小与溶剂性质亲密相关（相同相溶原理）；离子强度经过影响溶质带电性也影响溶质溶解度。降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。

第62页

提升离子强度：在水溶液中加中性盐（KCl,NaCl,NH4Cl,(NH4)2SO4）普通离子强度较低中性盐溶液可促进蛋白溶解（盐溶），高离子强度中性盐可引发蛋白质沉淀，析出（盐析）。

高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA溶解度增加（核酸分离依据）。惯用盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mol/L为宜。不过在提取核蛋白或细胞器中蛋白质时，为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器分离，则宜用高浓度(0.5-2.0mol/L)盐溶液。第63页(3)水解酶：细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，造成蛋白质或核酸分解，而使试验失败。为此，必须采取加入抑制剂，调整抽提液pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活化，采取68％乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸调整），在13－15℃抽提3h，可得到较高回收率。因为68％乙醇可使胰蛋白酶暂时失活，草酸可除去蛋白酶激活剂Ca2+，酸性环境也抑制酶蛋白活性。

RNA提取需预防RNase水解作用，RNase活性很高第64页(4)温度：

普通认为蛋白质或酶制品在低温(如0℃左右)时最稳定。

比如：在生产人绒毛膜促性腺激素(HCG，糖蛋白)制品时，一定要在低温下进行。当温度低于8℃时，从200千克孕妇尿中可提取约100克HCG粗品(活力为160u/mg)；当温度高于20℃时，从400千克孕妇尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。另外，高温下制备HCG粗品极难深入纯化至3500u/mg，原因是高温会使HCG受到微生物和/或糖苷酶破坏。普通提升温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。小分子物质：50－70℃；生物大分子：0－10℃，最好控制在0－4℃第65页（5）搅拌：搅拌能促使欲抽提物与抽提液接触，并能增加溶解度。不过，普通宜采取温和搅拌方法，速度太快时轻易产生泡沫，造成一些酶类变性失活。（6）氧化：

普通蛋白质都含相当数量巯基，该基团经常是酶和蛋白质必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成份子内或分子间二硫键，造成酶(或蛋白质)失活(或变性)。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可预防巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。第66页（7）金属离子：

蛋白质巯基还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。这些金属离子主要起源于制备缓冲液试剂中。处理方法：①用无离子水或重蒸水配制试剂；②在配制试剂中加入1-3mmol/LEDTA(金属离子络合剂)。

（8）抽提液与抽提物百分比：

在抽提时，抽提液与抽提物百分比要适当，普通以5∶1为宜。如抽提液过多，则有利于有效成份提取，但不利于纯化工序进行。第67页第二节沉淀分离技术

沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子原理是依据物质结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团百分比差异）来改变溶液一些性质（如pH值、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中有效成份溶解度发生改变，从而到达从抽提液中分离有效成份目标。蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面有显著差异，所以制备这两种大分子时，所用试剂和操作方法也不完全相同。第68页一.蛋白质沉淀分离（一）盐析沉淀法1.盐析原理

定义：普通在低盐浓度情况下，蛋白质溶解度随盐浓度升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质溶解度又伴随盐浓度升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度盐溶液中，不一样蛋白质溶解度不一样，借此可到达彼此分离目标。

第69页10十月SWAU第70页第71页2.盐选择：蛋白质盐析通常采取中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广是硫酸铵。

硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好安定作用。硫酸铵在水中溶解度大而温度影响小(25℃时溶解度为4.1mol/L，即767g/L;0℃时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引发蛋白质变性，分离效果比其它盐好。不过用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮测定，故有时也要用其它盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠盐析系数Ks较大，但因为在较低温度下溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。第72页3.硫酸铵浓度计算与调整方法

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通常硫酸銨添加以百分饱和度來表示(不是浓度百分比)，比如大部分蛋白质可在80%硫酸銨飽和度下沉淀。因为硫酸銨加入体积很大，会改变最终总体积，极难由浓度百分比來計算，所以使用百分饱和度作为沉淀蛋白质度量。用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度调整方法主要有二种：（1）加入饱和溶液法要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整硫酸铵浓度不高

V=V0(S2-S1)/（1-S2）

V:所需加进饱和硫酸铵溶液体积；V0:原溶液体积；S2：所需到达硫酸铵饱和度；S1:原溶液硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵配制方法：在一定量水中加入过量硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。第73页(2)

加入固体盐法要求：饱和度高，不增大溶液体积

t=G(S2-S1)/（1-AS2）

S2，S1:分别代表所需到达硫酸铵饱和度和原溶液硫酸铵饱和度；t：将1LS1饱和度溶液提升到S2饱和度时所需加进硫酸铵克数；G,A：常数，与温度相关。实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃两张表，室温用25℃）

第74页第75页4.影响蛋白质盐析原因：（1）蛋白质浓度蛋白质浓度高时，欲分离蛋白质经常夹杂着其它蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。所以在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在25－30g/L。（2）离子强度和离子类型影响

a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生

b.不一样蛋白质盐析时所需离子强度不一样，可采取分步盐析，经过逐步增加离子强度，使不一样蛋白分步沉淀出来

c.离子强度相同时，高价离子，半径小离子盐析力强

第76页（3）pH影响大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。（4）温度影响

a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；

b.在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。普通在室温下进行盐析;温度敏感蛋白质在低温4℃进行;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25℃比0℃时溶解度低，更轻易盐析。

第77页5.盐析时注意事项：（1）添加硫酸铵纯度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不停搅拌，预防局部过浓，发生共沉淀；（2）同一溶液中欲分离几个蛋白质时，可采取分段盐析方法。盐析通常与等电点沉淀法配合使用。（3）选择好温度，普通在室温下进行；（4）蛋白浓度不易过高，普通25－30g/L；低浓度盐析，可用离心分离；高浓度盐析（70－80％），用过滤（因为粘度大，离心操作慢）；盐析沉淀得到蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。第78页（二）等电沉淀法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不一样蛋白质含有不一样等电点一这特征，对蛋白质进行分离纯化方法称为等电点沉淀法。

第79页（三）有机溶剂沉淀法：作用机理：（1）降低水溶液介电常数，使溶质溶解度降低；（2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。利用不一样蛋白质在不一样浓度有机溶剂中溶解度不一样而使蛋白质分离方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用有机溶剂是乙醇和丙酮。优点：

比盐析法析出沉淀轻易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也轻易除去。

第80页缺点：有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应马上用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，防止变性。

有机溶剂沉淀法普通与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液pH值应控制在欲分离蛋白质等电点附近。第81页注意：（1)低温操作（2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。（3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处pH，即与等电点共沉淀结合使用。（4)注意离子强度，离子种类影响。第82页（四）选择性变性沉淀法：

选择一定条件使溶液中存在一些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质方法称为选择性变性沉淀法。

比如：利用加热，改变pH或加进一些重金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白理化性质有较全方面了解。第83页（五）非离子多聚物沉淀法：聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物能够沉淀蛋白质和细菌。沉淀机理：空间位置排斥效应。试剂溶解度大，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞机率。优点：（1）操作条件温和，不易引发变性；（2）含有极高沉淀效率；（3）沉淀后多聚物轻易除去。第84页二.核酸提取与沉淀分离

核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。从生物材料中分离出DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白质（DNP）或RNA-蛋白质（RNP）复合物形式存在。所以，要制备初步纯化核酸时，首先要分离出DNP或RNP，再将复合物解聚，除去蛋白质，然后经过沉淀法得到核酸。DNP

在0.14mol/L氯化钠溶液中，RNP溶解度相当大，而DNP溶解度仅为在水中溶解度1%；当氯化钠浓度到达1mol/L时候，RNP溶解度小，而DNP溶解度比在水中溶解度大2倍。

所以常选取0.14mol/L氯化钠溶液提取RNP，而选取1mol/L氯化钠溶液提取DNP。DNP第85页1.DNP/RNP复合物解聚：主要采取加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂来实现。去污剂：在破碎细胞溶液中，加入适量阴离子去污剂SDS、TritonX-100、Tween40和NP-40等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，将DNP/RNP复合物解聚，进而释放出核酸。有机溶剂：苯酚、氯仿等是蛋白质变性剂。依据抽提液中蛋白质含量和溶剂纯度，用变性剂重复处理抽提液，直到离心后，上层水相（含核酸）和下层有机相之间界面处无变性蛋白为止。蛋白水解酶：用此法除去复合物中蛋白质操作比较温和，惯用水解酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E，能够防止剪切和破坏核酸。第86页2.多糖消除：采取动物或植物作材料提取核酸时，动物在宰杀前饥饿12h，植物在取材前暗室培养数天，其体内糖原和淀粉类物质均会降低。混杂于核酸提取液中多糖类物质，普通可用选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）可到达分离目标。或用等体积2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积乙二醇甲醚处理，离心后，多糖位于中部，核酸存在上层乙二醇甲醚中。第87页3.RNA提取：

tRNA(约占细胞内RNA15%)相对分子质量较小，在细胞破碎以后溶解在水溶液中，滤液用酸处理，调整到pH5得到沉淀中可分离得到tRAN。

mRNA占细胞RNA5%左右，很不稳定，提取条件要严格控制。

rRNA约占细胞内RNA80%，普通提取RNA主要是rRNA。因为RNA是基因表示过程中非常主要生物分子，如mRNA携带了DNA为蛋白质编码信息。RNA分离是研究基因功效主要基础之一，在分子生物学中占有主要地位。

RNA提取方法主要有稀盐溶液提取和苯酚溶液提取。第88页稀盐溶液提取：将细胞破碎制成细胞匀浆，然后用0.14mol/L氯化钠溶液重复抽提，得到核糖核蛋白提取液，再深入与脱氧核糖核蛋白、蛋白质、多糖等分离，可得RNA。苯酚溶液提取：在细胞破碎制成匀浆后，用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经屡次酚/氯仿在一定条件下振荡一定时间，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA，将RNA与蛋白质分开。第89页4.DNA提取：

从细胞中提取DNA，普通在细胞破碎后用浓盐法提取。即用1mol/L氯化钠溶液从细胞匀浆中提取脱氧核糖核蛋白，再与含有少许辛醇或戊醇氯仿一起振荡除去蛋白质。或者先以0.14mol/L氯化钠溶液(也可用0.1mol/LNaCl加上0.05mol/L柠檬酸代替)重复洗涤除去核糖核蛋白后，再用1mol/L氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白，经氯仿戊醇(辛醇)或水饱和酚处理，除去蛋白质，而得到DNA。第90页5.核酸沉淀分离：核酸分离纯化应维持在0-4℃低温度条件下，以预防核酸变性和降解。为预防核酸酶引发水解作用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶活性。惯用沉淀分离法有：

(1)有机溶剂沉淀法

(2)等电点沉淀法

(3)钙盐沉淀法

(4)选择性溶剂沉淀法第91页（1）有机溶剂沉淀法：

因为核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下来。(2)等电点沉淀法：

脱氧核糖核蛋白等电点为pH4.2；核糖核蛋白等电点力pH2.0-2.5；tRNA等电点为pH5。所以将核酸提取液调整到一定pH，就可使不一样核酸或核蛋白分别沉淀而分离。第92页(3)钙盐沉淀法：在核酸提取液中加入一定体积比(普通为1/10)10%氯化钙溶液，使DNA和RNA均成为钙盐形式，再加进1/5体积乙醇，DNA钙盐即形成沉淀析出。(4)选择性溶剂沉淀法：选择适宜溶剂，使蛋白质等杂质形成沉淀而与核酸分离，这种方法称为选择性溶剂沉淀法。①在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。②在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都进入水层，而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。③在DNA与RNA混合液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中RNA分离。第93页三.利用膜分离技术1.透析：透析是把待纯化蛋白质溶液装在半透膜透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行，透析液能够更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。原理：利用蛋白质分子不能经过半透膜性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。第94页

影响透析速度原因：（1）半透膜通透性：惯用半透膜是玻璃纸或赛璐玢纸、火绵纸或其它改型纤维素材料。（2）透析外液更换：重复更换透析外液，增加透析速度；对流水透析，可进行早期透析；搅拌，使梯度差变得均匀，可增加透析速度。（3）温度：温度增加，则透析速度增加，但要注意生物活性。

（4）压力：增加压力可加紧透析速度，如真空透析。第95页2.超滤：利用压力或离心力，强行使水和其它小分子溶质经过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以到达浓缩和脱盐目标。超滤尤其适合用于大分子溶液浓缩、不一样种类分子纯化以及溶剂交换等。原理：在外力作用下，超滤膜对大分子物质截留主要是筛分作用，决定截留效果主要是膜表面活性层上孔大小与形状。除了筛分作用外，膜表面、微孔内吸附和粒子在膜孔中滞留也使大分子被截留。使用中最需注意问题是滤膜表面轻易被吸附蛋白质堵塞，使超滤速度减慢，被截留物质Mr变小。第96页超滤主要应用：浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由经过，从而到达浓缩目标。

第97页

梯度分离：按分子大小梯度分离样品中溶质分子时，超滤是一个经济有效方法，适合用于分离相对分子质量相差10倍以上分子组分。在超滤过程中，即使截留大分子被浓缩，但滤过溶质分子仍保持初始浓度。第98页

脱盐／纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质过程。详细方法为：在溶液进行超滤同时，不停向溶液中补充溶剂，补充溶剂速度与溶液滤过速度相同，使体系一直保持恒定，这种方法又称透析超滤法。第99页超滤法经典用途：

A:对蛋白质、酶、DNA、单克隆抗体、免疫球蛋白进行浓缩和脱盐；

B:药品、激素分离；

C:从PCR扩增仪DNA中去除引物；

D:去除标识氨基酸和核苷酸；

E:HPLC样品制备；

F:从样品中除蛋白；

G:从生物体液、发酵肉汤培养基中纯化抗生素、激素和药品；

H:从细胞悬液、裂解液中回收生物分子；

I:对蛋白质、酶、细胞、DNA、生物分子、抗体和免疫球蛋白进行浓缩和脱盐；

J:哺乳动物细胞搜集；

K:清洗细胞、纯化病毒、去除细胞碎片、除热原。第100页第三节离心分离技术

离心技术在生物科学，尤其是在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广泛应用，离心技术主要用于各种生物样品分离和制备.

生物样品悬浮液在高速旋转下，因为巨大离心力作用，使悬浮微小颗粒（细胞器、生物大分子沉淀等）以一定速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒质量、大小和密度。第101页一.基本原理：⒈离心力（centrifugalforce，Fc）：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心作用力“Fc”由下式定义：

Fc=m·a=m·ω2r

a：粒子旋转加速度，

m：沉降粒子有效质量，

ω：粒子旋转角速度，

r：粒子旋转半径(cm)。

第102页⒉相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）:

因为在转速相同情况下，离心力会随离心机转子半径或者离心管至旋转轴中心距离改变，所以在文件中惯用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，RCF就是实际离心场转化为重力加速度倍数。

X为离心转子半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟转数（revolutionsperminute,简写成r/min,或rpm）。

22第103页

普通在低速离心时（转速小于5000r/min），离心力大小惯用r/min来表示，而超速离心时则用g或×g来表示。因为离心管中从管口到旋转中心距离是不一样，所以在一样转速时，管口和管底所受到离心力也有差异。比如：在某个角度转头中，离心管口到旋转中心距离为4.8cm，而离心管底到旋转中心距离是8.0cm，当转速为1r/min是，离心管口和离心管底所受到相对离心力RCF分别是：RCF（管口）=1.118×10-5×(1)2×4.8=7734gRCF（管底）=1.118×10-5×(1)2×8.0=12891g

科技文件中离心力数据通常是指其平均值（RCFav），即离心管中点离心力。旋转轴340rminravrmax第104页

为便于进行转速和相对离心力之间换算，Dole和Cotzias利用RCF计算公式，制作了转速“rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系列线图，图式法比公式计算法方便。换算时，先在r标尺上取已知半径和在rpm标尺上取已知离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上交叉点即为对应相对离心力数值。第105页⒊沉降系数（sedimentationcoefficient，s）：依据1924年Svedberg对沉降系数下定义为颗粒在单位离心力场中粒子移动速度。若ω用2πn/60表示，则X1：离心前粒子到旋转轴距离。

X2：离心后粒子到旋转轴距离。

S：普通在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。比如，动物细胞核糖体沉降系数等于80S，它含义就是：80×10-13s。细胞及细胞各组分沉降系数有很大差异，所以能够利用生物样品沉降系数差异采取离心技术将他们彼此分开。

第106页⒋沉降速度（sedimentationvelocity）：对于球形颗粒

Fc=(1/6)

d3(ρp−ρm)ω2X

Ff=3

ηdv

当Fc=Ff时(1/6)

d3(ρp−ρm)ω2X

=3

ηdv

v=(1/18η)[d2(ρp−ρm)ω2X]Fc：离心力；Ff：摩擦力：d：球形粒子直径；η：流体介质粘度；ρP：粒子密度；ρm：介质密度；v：粒子移动速度从上式可知，粒子沉降速度与粒子直径平方、粒子密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子沉降速度也增加，将此式代入上项沉降系数公式中，则S表示式也可表示为：

①当ρP＞ρm，则S＞0，粒子顺着离心场方向沉降。②当ρP＝ρm，则S＝0，粒子抵达某一位置后抵达平衡。③当ρP＜ρm，则S＜0，粒子逆着离心场方向上浮。

2d第107页5.沉降系数与物质相对分子质量:

由沉降系数依据Svedberg公式能够计算出物质相对分子质量：

Mr=RTS20,w/[D20,w(1-γρ)]Mr：相对分子质量；

D20,w：以20℃水为介质时颗粒扩散系数；

R:气体常数；

T：绝对温度；

S20,w：以20℃水为介质时颗粒沉降系数；

γ：偏比容，等于溶质粒子密度倒数；

ρ：溶剂密度。

第108页6.沉降时间（sedimentationtime，Ts）:

在实际工作中，经常需要在已经有离心机上把某一个溶质从溶液中全部沉降分离出来，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可到达目标。假如转速已知，则需确定分离某粒子所需时间。依据沉降系数（S）式可得积分得X2:离心转轴至离心管底内壁距离；X1:离心转轴至样品溶液面之间距离，将（t2－t1）用Ts表示：其中

(lnXmax−lnXmin)/ω2

为一常数，称k常数或k值。第109页7.K值（kfactor）:

K值是用来描述在一个转子中，将粒子沉降到离心管底效率。也就是溶液到达澄清一个指数，所以也叫“cleaningfactor”。标准上，K值愈小，粒子沉降到离心管底需要时间愈短。通常，离心机转子说明书中提供K值，是在最大转速下所计算出来数值。若未到达最大转速，可用下试计算K值：

利用此公式预估离心时间，对水平式转子最适合；对固定角式转子而言，实际时间将比预估时间短一些。第110页二.离心机主要结构和类型：离心机可分为工业用离心机和试验用离心机。试验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离样品容量比较大，分析性离心机普通都带有光学系统，主要用于研究纯生物大分子和颗粒理化性质，依据待测物质在离心场中行为（用离心机中光学系统连续监测），能推断物质纯度、形状和相对分子质量等。分析性离心机都是超速离心机。第111页1.制备性离心机可分为三类:

低速离心机

:最大转速6000rpm左右，最大相对离心力近6000×g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离。可用水平转头，角度转头，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于搜集易沉降大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机碳刷易磨损，转速是用电压调压器调整，起动电流大，速度升降不均匀，普通转头是置于一个硬质钢轴上，所以准确地平衡离心管及内容物就极为主要，不然会损坏离心机。第112页

高速离心机：最大转速为0-25000rpm（r/min），最大相对离心力为89000×g，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，通常配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、普通都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生热量，离心室温度能够调整和维持在0-40oC，转速、温度和时间都能够严格准确地控制，并有指针或数字显示。通惯用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、蛋白质硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。第113页第114页

超速离心机：大于30×103r/min，最大离心力600,000g，有驱动和速度控制系统，温度控制系统，真空系统（降低摩擦）。新式有微处理机（按编定程序运转，自动计算速度和时间）。有40各种不一样容量和性能转头给用户选择。离心容量由几十毫升至2升，分离形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许误差要小于0.1克。超速离心机出现，使生物科学研究领域有了新扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到亚细胞器得到分级分离，还能够分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。第115页

角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角转头。它是由一块完整金属制成，其上有4-12个装离心管用机制孔穴，即离心管腔，孔穴中心轴与旋转轴之间角度在20-40度之间，角度越大分离效果越好。优点是含有较大容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管壁，然后再沿管壁滑向管底，所以管一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”。壁效应轻易使沉降颗粒受突然变速所产生对流扰乱，影响分离效果。2.转头⑴角式转头第116页⑵荡平式转头：这种转头有4或6个自由活动吊桶（离心套管），当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速到达每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心优点是梯度物质可放在保持垂直离心管中，离心时被分离样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离各样品带。其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。第117页第118页⑶区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开顶盖组成，转子桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央进液管泵入，经过这些导管分布到转子四面，转头内隔板可保持样品带和梯度介质稳定。第119页

沉降样品颗粒在区带转头中沉降情况不一样于角式和外摆式转头，在径向散射离心力作用下，颗粒沉降距离不变，所以区带转头“壁效应”极小，能够防止区带和沉降颗粒紊乱，分离效果好，而且还有转速高，容量大，回收梯度轻易和不影响分辨率优点，使超离心用于制备和工业生产成为可能。区带转头缺点是样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。第120页⑷垂直转头：其离心管垂直放置，样品颗粒沉降距离短，离心所需时间也短，适合用于密度梯度区带离心，离心开始时和结束时液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。第121页⑸连续流动转头：可用于大量培养液或提取液浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口转头盖及从属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。

第122页3.离心管离心管主要用塑料和不锈钢制成：塑料离心管惯用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能很好。塑料离心管优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应防止接触强腐蚀性化学药品，如强酸、强碱等。塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：①预防样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性样品时，这点尤其主要。②预防样品挥发。③支持离心管，预防离心管变形。第123页4.分析性离心机分析性离心机使用了特殊设计转头和光学检测系统，方便连续地监视物质在一个离心场中沉降过程。从而确定其物理性质。利用特殊配置数据处理机自动计算s(沉降系数)和Mr。主要用于生物大分子相对分子质量测定，估价样品纯度和检测生物大分子构象改变等。主要产品有美国Beckman企业ModelE及日本日立企业282型。第124页第125页三.离心分离方法选择1.差速离心法：

这是最普通离心法。即采取逐步增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不一样颗粒，在不一样离心速度及不一样离心时间下分批分离方法。此法普通用于分离沉降系数相差较大颗粒。差速离心首先要选择好颗粒沉降所需离心力和离心时间。当以一定离心力在一定离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒沉淀，分出上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒沉淀及含较小和较轻颗粒上清液，如此屡次离心处理，即能把液体中不一样颗粒很好地分离开。此法所得沉淀是不均一，仍杂有其它成份，需经过2-3次再悬浮和再离心，才能得到较纯颗粒。第126页三.离心分离方法选择1.差速离心法：

这是最普通离心法。即采取逐步增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不一样颗粒，在不一样离心速度及不一样离心时间下分批分离方法。此法普通用于分离沉降系数相差较大颗粒。差速离心首先要选择好颗粒沉降所需离心力和离心时间。当以一定离心力在一定离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒沉淀，分出上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒沉淀及含较小和较轻颗粒上清液，如此屡次离心处理，即能把液体中不一样颗粒很好地分离开。此法所得沉淀是不均一，仍杂有其它成份，需经过2-3次再悬浮和再离心，才能得到较纯颗粒。第127页第128页

此法主要因为组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大角式转子。缺点是：须屡次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底颗粒受挤压，轻易变性失活。第129页2.密度梯度离心：又称速率区带离心法。是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离样品铺在梯度液顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。在一定离心力下把颗粒分配到梯度中一些特定位置上，形成不一样区带分离方法。离心后在近旋转轴处（X1）介质密度最小，离旋转轴最远处（X2）介质密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子最小密度，即ρP＞ρm。这种方法是依据分离粒子在梯度液中沉降速度不一样，使含有不一样沉降速度粒子处于不一样密度梯度层内分成一系列区带，到达彼此分离目标。梯度液在离心过程中以及离心完成后，取样时起着支持介质和稳定剂作用，防止因机械振动而引发已分层粒子再混合。此法仅用于分离有一定沉降系数差颗粒（20%沉降系数差或更大）或相对分子质量相差3倍蛋白质。大小相同，密度不一样颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。第130页

离心管先装在密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质液面上，离心时，因为离心力作用，颗粒离开原样品层，按不一样沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降颗粒逐步分开，最终形成一系列界面清楚不连续区带。沉降系数越大，往下沉降越快，所展现区带会越靠近离心管底。第131页

由ρP＞ρm可知S＞0，所以该离心法离心时间要严格控制，现有足够时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子抵达离心管底之前。假如离心时间过长，全部样品可全部抵达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。离心必须在沉降最快大颗粒抵达管底前结束，样品颗粒密度要大于梯度介质密度。梯度介质通惯用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28kg/cm3和60％。此法是一个不完全沉降，沉降受物质本身大小影响较大，普通是用于分离大小相异而密度相同物质。第132页3.等密度离心：

密度梯度液包含了被分离样品中全部粒子密度，待分离样品铺在预先制备好梯度介质溶液顶上，或先与梯度液混合后装入离心管，离心开始后，当梯度液因为离心力作用逐步形成管底浓而管顶稀密度梯度，与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布。离心时，样品低密度颗粒向上浮起，高密度颗粒向下沉降，一直移动到与它们密度相等等密度点特定梯度位置上，形成不一样区带。第133页

当介质密度大于粒子密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在ρP＞ρm时，则粒子沉降，最终粒子进入到一个与它本身密度相等位置，即ρP＝ρm，此时dx/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份区带，与样品粒子密度相关，而与粒子大小和其它参数无关，所以只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子成带位置。但颗粒大小和形状决定着抵达平衡速度、时间和区带宽度。体系抵达平衡状态后，再延长离心时间和提升转速已无意义，处于等密度点上样品颗粒区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提升转速能够缩短抵达平衡时间，离心所需时间以最小颗粒抵达等密度点（即平衡点）时间为基准，有时长达数日。第134页第135页10十月SWAU第136页

等密度区带离心法所用梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达1.7g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也能够分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。搜集区带方法有许各种:a:用注射器和滴管由离心管上部吸出。

b:用针刺穿离心管底部滴出。

c:用针刺穿离心管区带部份管壁，把样品区带抽出。

d:用一根细管插入离心管底，泵入超出梯度介质最大密度取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分搜集器搜集。

第137页梯度溶液制备:梯度材料选择标准

作为一个理想梯度材料应具备以下几点：①与被分离生物材料不发生反应，即完全惰性，且易与所分离生物粒子分开。②可到达要求密度范围，且在所要求密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH改变较小。③不会对离心设备发生腐蚀作用。④轻易纯化，价格廉价或轻易回收。⑤浓度便于测定，如含有折光率。⑥对于超速离心分析工作来说，它物理性质、热力学性质应该是已知。第138页

上述条件是理想条件，完全符合每种性能梯度材料几乎是没有。基本上符合上述标准梯度材料有：①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且因为价格低轻易制备，是现在试验室里惯用于细胞器、病毒、RNA分离梯度材料，但因为有较大渗透压，不宜用于细胞分离。聚蔗糖：商品名Ficoll，常采取Ficoll-400，也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它粘度却尤其高，为此常与泛影葡萄糖胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞，包含血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。第139页②无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等。氯化铯：是一个离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。因为它是重金属盐类，在离心时形成梯度有很好分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白分离，但价格较高。卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性DNA。③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。第140页④硅溶胶：如Percoll：是商品名，它是一个SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，对生物材料影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下仍是稳定，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。可用于细胞、细胞器和病毒分离。⑤蛋白质：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有机物：如氟代碳等。第141页四.离心操作注意事项

高速与超速离心机是生化试验教学和生化科研主要精密设备，因其转速高，产生离心力大，使用不妥或缺乏定时检修和保养，都可能发生严重事故，所以使用离心机时都必须严格恪守操作规程。超速冷冻离心机:未经过培训和考评