染色体畸变和微核检测质量控制规范标准征求意见稿

ICS11.100CCSC5751/TQualitycontrolspecificationfortestsofchromosomeaberrationandmicronucleusIDB51/TXXXX—XXXX II 12规范性引用文件 13术语和定义 14实验室资质要求 35实验室基本要求 36染色体畸变检测操作流程的质量控制 57微核检测操作流程的质量控制 7附录A（规范性）实验室质量管理体系性文件 9附录B（规范性）本标准使用说明 DB51/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省卫生健康委员会提出、归口并解释。本文件起草单位：四川省疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院（华西第四医院）、核工业四一六医院、四川省科学城医院、德阳市人民医院。本文件主要起草人：凌攀、何玲、赵芹弘、张钊、高艺莹、方堃、张静、徐志红、吴苹、陈曦阳、曾珍、赵仪、王晓凤、杨柳莹、葛芾显、孙国康。1DB51/TXXXX—XXXX染色体畸变和微核检测质量控制规范本文件规定了电离辐射致人体外周血淋巴细胞染色体畸变和微核检测中应具备的实验环境、实验室资质、人员能力、检测流程、标本管理、结果分析等质量控制要求。本文件适用于放射工作人员职业健康检査、医疗和公众辐照的辐射防护监测、以及核与辐射医学应急中的生物剂量估算。产前筛查、外周血核型分析等细胞遗传性疾病染色体检查标本接种、培养、收获等相关操作技术可参照执行。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBZ98放射工作人员健康要求及监护规范GBZ169职业性放射性疾病诊断程序和要求GBZ/T248放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价GBZ/T328放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞微核检测方法与受照剂量估算标准GB19489实验室生物安全通用要求GB/T28236染色体畸变估算生物剂量方法GB/T42060医学实验室--样品采集、运送、接收和处理的要求WS/T442临床实验室生物安全指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1染色体畸变chromosomalaberration正常染色体在受到物理（如电离辐射）、化学或生物因素作用下发生的数目和结构上的异常。染色体畸变是电离辐射作用的敏感指标之一。[来源：GBZ/T248-2014，3.5]3.2微核micronucleus由于基因组DNA损伤导致细胞分裂后期滞后的染色体断片、一个或多个染色体不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞质中形成直径小于主核的三分之一且完全与主核分开的圆形或椭圆形小核。2DB51/TXXXX—XXXX[来源：GBZ/T328-2023，3.2]3.3微核细胞micronucleuscell如采用常规培养微核法，指胞质中含有微核的转化淋巴细胞；如采用CB微核法，指胞质中含有微核的双核淋巴细胞。[来源：GBZ/T328-2023，3.5]3.4常规染色体培养法routinechromosomemethod在培养液中加入植物血凝素（PHA），淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，使细胞分裂停止在中期。经低渗、固定、制片和染色，分析染色体分裂相的方法。3.5外周血染色体核型分析peripheralbloodchromosomalkaryotypeanalysis一个体细胞中的全部染色体按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像就称为核型(karyotype)。将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为外周血染色体核型分析。3.6常规培养微核法routinemicronucleusmethod采用微量全血培养法培养淋巴细胞，培养体系中无需加入松胞素-B，培养结束后经低渗、固定、制片和染色进行观察和分析微核的方法。3.7胞质分裂阻断微核法（CB微核法）cytokinesis-blockmicronucleusmethod在培养的淋巴细胞完成第一次有丝分裂前，向培养体系中加入松胞素-B，阻滞胞质分裂，培养结束后经低渗、固定、制片和染色，只计数和分析双核淋巴细胞中微核的方法。[来源：GBZ/T328-2023，3.4]3.8放射工作人员radiationworker受聘用全日、兼职或临时从事放射工作的任何人员。[来源：GBZ98-2020，3.1]3.93DB51/TXXXX—XXXX放射工作人员职业健康监护occupationalhealthsurveillanceofradiationworker为保证放射工作人员上岗前及在岗期间都能适任其拟承担或所承担的工作任务而进行的医学检查及评价。其主要包括职业健康检查和职业健康监护档案管理等。[来源：GBZ98-2020，3.2]3.10核与辐射应急nuclearandradiationemergency指的是由核链式反应或链式反应产物的衰变所产生的能量或辐射照射已造成或预计将造成危害的应急。[来源：WS/T827-2023，3.3]3.11质量控制qualitycontrol为达到质量要求所采取的作业技术和活动。[来源：GB/T19000-2016/ISO9000:2015，3.3.7]4实验室资质要求4.1实验室至少每2年参加一次职业健康检查质量控制管理机构组织的实验室间比对，并进行实验室能力分析评估。对不合格的考核结果进行原因分析并采取整改或纠正措施，并对相关人员进行针对性培训。文件记录留档保存。4.2实验室有健全的质量管理体系，规章制度、质量手册、程序性文件、操作规则、记录等应符合附录A的规定，并处于受控状态，能有效反映管理体系运行状况并持续改进其有效性。5实验室基本要求5.1设施环境5.1.1细胞培养室用于实验的前期准备、标本接种、外周血淋巴细胞培养，面积在10m2及以上，培养箱不可与其他检测项目实验共用。5.1.2制片室用于试剂的配置、染色体和微核标本片的制备及染色，面积在10m2及以上，应配备通风装置、防护眼镜、面屏、温湿度仪、洗眼淋浴装置等。5.1.3阅片室需配置光学显微镜，有条件的实验室可增配摄像系统、染色体核型和微核自动分析系统，配备专门的标本片储存柜。5.1.4试剂储存室需配备消防设备和报警装置。化学品的使用方法、储存数量以及储存方式需符合《危险化学品安全管理条例》、《易制毒化学品管理条例》等相关法规要求。依据化学品的种类及潜在危害，配备独立的易腐蚀、易燃、易制爆化学品试剂柜，试剂柜需连接通风装置。5.1.5依据仪器设备运行、实验操作、试剂及耗材存储、样品和标本片保存等温湿度要求，制定环境条件（含温、湿度）控制规定并做好记录，需有环境条件失控时的处置措施和记录。5.2安全防护4DB51/TXXXX—XXXX5.2.1实验室生物安全防护满足GB19489和WS/T442要求，张贴安全标识，有应急处置方案。5.2.2医疗废弃物处理应按《医疗废物管理条例》、《医疗卫生机构医疗废物管理办法》及《危险化学品安全管理条例》处置。5.3仪器设备5.3.1主要仪器设备参照GBZ/T248附录C.2要求。生物安全柜可替代超净工作台，用于细胞接种。新增纯水系统，其出水水质达到双蒸水标准，用于试剂配制。离心机可放置10mL和15ml尖底离心管。5.3.2选配仪器设备：负压移液装置/真空吸液器、电子天平、染色体和/或微核自动扫描分析系统、自动细胞收获仪、自动制片机、自动染片机、自动接种仪。5.3.3仪器设备管理要求5.3.3.1建立仪器设备管理档案，并有标准操作规程。5.3.3.2按要求对仪器设备进行检定或校准、期间核查。5.3.3.3建立仪器设备使用、维护保养及维修记录。5.3.3.4冰箱，恒温水浴箱（锅）和恒温培养箱每日进行温度监测和记录。5.3.3.5纯水系统按要求监测记录水质指标。5.4试剂5.4.1试剂可在无菌条件下自行配制或正规厂家采购，每批采购试剂应有验收记录。试剂按存放要求固定储存，试剂重新配置或更换批号、生产商时，需在使用前进行试剂验证。5.4.2主要试剂包括：淋巴细胞培养基、低渗液、固定液、秋水仙素、瑞氏-吉姆莎染液、松胞素-B。5.4.3淋巴细胞培养基：染色体畸变分析选用≥5mL/瓶的培养基，微核分析选用≥3mL/瓶的培养基。按生产商说明书规定保存，使用前一天取出37℃复融，不可反复冻融使用。更换生产商或批次的培养基均需对至少两个血液样本进行验证实验，并有实验记录。5.4.4低渗液：0.075mol/L的氯化钾低渗液按计划需要量配制，并保持37℃,实验后剩余低渗液建议丢弃，若长菌变质不可使用。5.4.5固定液：固定液需在用前新鲜配制，其分析纯甲醇：冰醋酸体积比=3:1，实验间隙需加盖或套膜密封常温存放。实验中操作人员宜佩戴防护眼镜、面屏，同时保持实验室通风换气。实验后剩余固定液按照国家相关标准要求处理。5.4.6秋水仙素：冷藏避光保存，其培养基终浓度参照GBZ/T248要求，注意个人防护，避免实验人员直接接触。5.4.7瑞氏-吉姆萨染液：染色前配制新鲜染液，染色液与缓冲液配制体积比例控制在1：10~1:13之间。6-10月份染色时间为8min，11月-次年5月份染色时间为12min。5.4.8松胞素-B储存液：松胞素-B储存液应避光保存，将松胞素-B溶于二甲基亚砜中，浓度为2mg/mL，-20℃储存，用前融化，生理盐水稀释，加入培养基后的终浓度为6μg/mL。5.5人员5.5.1检测技术人员应取得初级及以上职称，有专业技术培训证明（染色体畸变和微核检测进修学习证书）及考核记录，有视觉障碍的人员不能从事此工作。5.5.2专业知识和检验技术能力要求5.5.2.1掌握以下专业知识：5DB51/TXXXX—XXXXa)放射工作人员职业健康监护和职业病诊断相关法律、法规和标准，如《中华人民共和国职业病防治法》、《职业健康检查管理办法》、放射工作人员健康要求及监护规范（GBZ98）、放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价（GBZ/T248）、放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞微核检测方法与受照剂量估算标准（GBZ/T328）等；b)实验室基本管理条例、生物安全知识、危化品管理办法；c)电离辐射生物效应的基础知识。5.5.2.2具备以下技术能力：a)样本接收、储藏、登记程序；b)外周血淋巴细胞染色体畸变及微核实验的基本原理及标准操作程序，常用试剂的配制；c)外周血样本的染色体畸变和微核分析，显微镜摄影、坐标记录及使用规范符号记录染色体畸变类型和微核情况，准确、及时完成报告；d)仪器设备的使用、维护/保养、检定/校准及期间核查；e)标本片、原始记录、档案、图像等资料的保存。5.5.3技术人员的考核5.5.3.1实验室技术人员每年进行能力考核，制片评级合格率为100%，阅片准确率≥90%。5.5.3.2技术人员按规定参加职业健康检查质量控制管理机构组织的实验室间比对。5.5.3.3离岗6个月以上再上岗时，或程序、技术有变更时，应对技术人员进行再培训，经考核合格后方可继续上岗。6染色体畸变检测操作流程的质量控制6.1实验标准操作规程染色体畸变实验标准操作按照GBZ/T248和GB/T28236的规定。普通载玻片应脱碱处理，使用实验室常用的次强酸清洁液浸泡玻片24小时，流水充分冲洗后在用蒸馏水冲洗三遍，置于95%乙醇中浸泡12小时，取出放烘箱中烤干或自然风干。制片时，使用0℃-4℃冰水预冷的载玻片。6.2标本采集、运送和保存要求6.2.1宜采集空腹血，血样采集应在所有放射性检查之前，质量保证遵循GB/T42060的要求。6.2.2血液样本运输和保存的最佳温度是18℃-24℃。6.2.3样本采集后应尽早接种，无法立刻接种的样本，可接种到含植物血凝素培养基后于4℃-20℃保存，存放时间不超过72小时；或30℃-37℃保存，存放时间不超过24小时。6.2.4每份样本有唯一编号，编码规则由各实验室制定。6.3染色体培养收获过程的质量控制6.3.1中老年人、疑似受到意外照射和/或淋巴细胞低于正常值人员的血液标本宜多份平行培养或适当延长培养时间。6.3.2在37℃水浴箱（锅）中低渗时间30min。6.3.3冰醋酸凝固点较高（16.6℃),使用前应注意放置温度，防止冰醋酸凝固。6.3.4二次固定后，若离心后上清液颜色较深或仍有浑浊，可增加根据情况增加固定次数，直到上清液清晰。6DB51/TXXXX—XXXX6.3.5制备的染色体悬液若不能立即滴片，可保存在-20℃（长期）或4℃（短期）冰箱。在制片前，需重新加入新鲜配制的固定液，混匀离心制备成悬液滴片。6.3.6滴片时，环境温度控制在18℃-26℃,相对湿度控制在30%-70%。6.3.7滴片后，标本片用酒精灯外焰固定，若标本片着火，应立即吹灭。6.3.8染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇或乙醇适当脱色。6.4染色体标本片质量评估6.4.1中期分裂细胞的筛选6.4.1.1人工显微镜阅片时，按显微镜载物台刻度坐标，在低倍镜下按顺序扫描全片，挑选计数分析的中期细胞。中期细胞选择应符合以下条件：a)染色体分散良好，染色体无紧缩成团；b)染色体形态舒展，长度适中，无过度细长或短粗。6.4.1.2低倍镜下找到合适的中期细胞后，在油镜下对中期分裂细胞进行核型分析。不宜做核型分析的中期细胞：a)着丝粒数目少于45或多于47个；b)在同一细胞内染色体过于分散，不能在一个油镜视野内观察到；c)染色体重叠太多，轮廓不清楚；d)染色体没有处于有丝分裂中期，即染色质没有螺旋化；e)同一条染色体的两条染色单体间距离过大。6.4.2染色体标本片评级：a)优秀：每张标本片中能检出不少于200个合格中期分裂细胞；b)合格：每张标本片中能检出100~200个合格中期分裂细胞；c)不合格：每张标本片中少于100个合格中期分裂细胞，应重新制片。6.4.3自动分析系统采集和分析染色体分裂相质量评估与人工分析要求一致。6.5染色体畸变分析的质量评估6.5.1畸变类型及表示符号应符合以下要求：a)畸变类型及表示符号见GBZ/T248，主要观察染色体型畸变，分析计数ace、dic、r和pic等非稳定性染色体畸变，以及明显的非对称性的t和del等稳定性染色体畸变；b)伴随dic、r、pic的ace，记录为dic(l)、r(l)或者pic(n-1)，n代表着丝粒数目。非伴随的ace，则另计为一个畸变（+ace）；c)如无ace伴随的dic，r或pic记录为dic(0)，r(0)或pic(0)；d)染色单体型畸变如染色单体断裂(ctb)、裂隙(g)，染色单体互换（cte），如三射体（tr）和四射体(qr）等超过5%需报告。6.5.2原始记录要求：a)人工摄像或者仪器拍照畸变细胞图像，图片能完整展现一个细胞的染色体全貌；b)原始记录内容包括样本编号、细胞坐标、畸变类型等信息完整，清晰准确，修改规范；c)自动扫描分析系统拍摄的异常分裂相需在普通显微镜定位，并记录坐标；d)原始记录的格式参见GBZ/T248。6.5.3分析要求：7DB51/TXXXX—XXXX分析100个中期分裂细胞,发现1个及以上双着丝粒体、着丝粒环、三着丝粒体、多着丝粒体、稳定性染色体畸变，或3个以上无着丝粒体畸变，若被检者接触过放射因素，可直接计算此100个分裂相的畸变率；若被检者没有接触过放射因素，需增加分析100个细胞分裂相，计算此200个中期分裂细胞的染色体畸变率，并按GBZ/T248要求进行结果评价。6.5.4复核要求：a)自动分析系统识别到染色体畸变的细胞分裂相时，技术人员需在显微镜下通过调整细准焦螺旋对分裂相辨认判定；b)分析结果应由至少两名技术人员核查确认。6.5.5对本年度体检染色体图片抽检，制片评级合格率应为100%。6.6报告质量评估要求6.6.1报告的格式参见GBZ/T248，内容合理，并包含足够信息。多着丝粒体报告为（n-1）个双着丝粒体，n为着丝粒数目。6.6.2报告采取检测者、复核者双人签字。6.6.3应在体检结束之日起30个工作日内出具报告。6.7标本玻片、电子图片、原始记录、报告和档案的存放要求6.7.1有专门存放标本玻片、原始记录、报告等标本资料记录的储存柜和存放点，有专门的电子储存设备用于储存电子图片，且专人管理。6.7.2所有的档案按档号排放于档案柜,档案柜编顺序号存放于档案库房,每天对库房温湿度进行监控并做好登记,还需做好防盗、防火、防水、防潮、防尘、防虫、防霉工作,定期查阅,以防毁损丢失。6.7.3标本玻片存放期限为10年，原始记录和图片等资料长期储存，并建立电子档案，血样标本冷藏保存一周。6.7.4实验室保证标本资料的完整性并为用人单位及受检者保密。7微核检测操作流程的质量控制7.1实验标准操作规程微核实验标准操作规程参见GBZ/T328，实验室视情况选择常规培养法或CB微核法。普通载玻片应脱碱处理，符合6.1要求。7.2标本采集、运送和保存要求符合6.2要求7.3微核培养收获过程的质量控制7.3.1低渗时，加入37℃预温的低渗液，吹打力度适中，混匀后应立即加入新鲜配制的固定液，防止淋巴细胞膜破裂；7.3.2固定后，若上清液浑浊或颜色较深，应重复固定直至上清液清晰；7.3.3制片时，根据细胞团块大小预留0.2mL-0.4mL液体制片，从适当高度滴片使细胞悬液打散均匀布满于洁净干燥载玻片。8DB51/TXXXX—XXXX7.4微核标本片质量评估7.4.1淋巴细胞的筛选7.4.1.1人工显微镜下阅片时，按显微镜载物台刻度坐标，在低倍镜下按顺序扫描全片，寻找转化的单核淋巴细胞（常规培养微核法）或双核淋巴细胞（CB微核法）。7.4.1.2可分析淋巴细胞的判定标准可分析的转化单核淋巴细胞的细胞核有完整核膜，细胞质边界或细胞膜应完整，并与相邻细胞的细胞质边界明显区分。双核淋巴细胞判定应符合GBZ/T328中6.2的要求。7.4.2微核标本片的评级：a)合格：每张标本片能检出不少于1000个转化淋巴细胞；b)不合格：每张标本片少于1000个转化淋巴细胞，应重新制片。7.4.3自动分析系统采集和分析微核标本片质量评估与人工分析要求一致。7.5微核分析的质量评估7.5.1高倍镜下微核判定，需符合GBZ/T328中6.3的要求。7.5.2人工摄像或者仪器拍摄微核细胞，在原始记录上记录样本编号、微核细胞显微镜坐标，记录要求符合6.5.2。原始记录格式参见GBZ/T328附录B.1。7.5.3复核要求：a)自动分析系统识别的微核，需要技术人员在显微镜下确认后方可报告；b)分析结果应由至少两名技术人员核查确认。7.5.4对本年度体检微核图片抽检，制片评级合格率应为100%。7.6报告的质量评估7.6.1报告的格式参见GBZ/T328，内容合理，并包含足够信息。7.6.2报告采取检测者、复核者双人签字。7.6.3应在体检结束之日起20个工作日内出具报告。7.7标本玻片、电子图片、原始记录、报告和档案的存放等7.7.1标本玻片、电子图片、原始记录、报告和档案的存放应符合6.7.1要求。7.7.2档案存放地点的环境和档案管理要求符合6.7.2要求。7.7.3标本玻片存放期限为2年，原始记录和图片等资料长期保存，并建立电子档案，血样标本冷藏保存一周。7.7.4实验室保证标本资料的完整性并为用人单位及受检者保密。9DB51/TXXXX—XXXX（规范性）实验室质量管理体系文件以下文件可根据检测机构具体情况进行补充或合并表A.1实验室质量管理体系性文件DB51/TXXXX—XXXX表A.1实验室质量管理体系性文件（续）（根据标准化操作规检测记录：应记录患者信息、标本检测结果、检测日期与时间、温