《DNA重组技术的基本工具》课件

1.1DNA重组技术的根本工具能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。一、基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达理论根底DNA是遗传物质的发现DNA双螺旋结构确实立遗传信息传递方式(中心法那么)的认定技术保障基因工程工具的发现和应用

限制性核酸内切酶

DNA连接酶基因载体(如质粒)二、基因工程的诞生提取抗虫基因棉花细胞苏云金芽孢杆菌(有抗虫特征)

普通棉花(无抗虫特征)与运载体DNA拼接，导入(含抗虫基因)

棉花植株(有抗虫特征)基因工程培育抗虫棉的简要过程如何将苏云金芽孢杆菌细胞内的抗虫基因从它的DNA分子中切割下来？如何将切下来的抗虫基因与运载体DNA连接起来？如何将重组的DNA运送到棉花细胞？需要切割DNA的工具〔分子手术刀〕需要连接DNA片断的工具〔分子缝合针〕需要基因转移的工具〔分子运输车〕——限制性核酸内切酶——DNA连接酶——基因载体工具酶思考1、限制性核酸内切酶〔简称限制酶〕能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。含义：主要从原核生物中别离得到来源：磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键

作用部位：有专一性。即一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。作用特点：产生黏性未端

作用结果：三、基因工程的根本工具9限制酶的识别序列有何特点？G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯键3’端5’端3’端5’端EcoRIAAGTTCCTTAAGCTTAAGGAATTC识别GAATTC序列，并在G和A之间切开限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，他们之间碱基正好互补配对，因此称这些片断为黏性末端。AATTGCCTTAAG3’5’3’3’5’5’5’3’SmaⅠCCCGGGGGGCCC识别GAATTC序列，并在G和C之间切开限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。CCCGGGGGGCCCAATTGCCTTAAG3’5’3’3’5’5’5’3’你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的平安。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而到达保护自身的目的。寻根问底1.要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几刀？可产生几个黏性(平)末端？

要切两刀，产生四个黏性(平)末端。2.如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？会产生相同的黏性(平)末端3.如果把具有相同黏性(平)末端的DNA连接起来，又会怎样呢？得到重组DNA讨论CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA2、DNA连接酶三、基因工程的根本工具类型来源功能相同点差异E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第5页“分子缝合针”——DNA连接酶的相关内容，填写下表你能画出经DNA连接酶作用形成的磷酸二酯键吗？E.coliDNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来T4

DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来GCTTAAGCTTAADNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链

连接部位寻根问底：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？双链单链两DNA片段之间的磷酸二酯键将游离的脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接起来

用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要形成几个磷酸二酯键？2个

用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？4个外源基因〔如抗虫基因〕怎样才能运送到受体细胞〔如棉花细胞〕？需要“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体思考3、基因载体〔运载体〕作为运载工具，将外源基因送入受体细胞。作用：条件：⑴能在宿主细胞内自我复制并稳定地保存⑵有一个或多个限制酶切点，可使外源基因插入其中⑶具有某些遗传标记基因，以便进行筛选⑷对受体细胞无害

质粒〔最常用〕、噬菌体和某些动植物病毒种类：三、基因工程的根本工具假设外源基因导入受体细胞后不能复制会怎样？作为载体如果没有限制酶切割位点将怎样？外源基因是否进入受体细胞，你如何去觉察？如果载体对受体细胞有害将怎样？会在细胞增殖中丧失外源的基因不可能插入

如果载体上有遗传标记基因，就可通过标记基因的表达来检测。

将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的外源基因也可能无法表达。思考质粒：裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的根底上进行过人工改造的。运载体的种类：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒质粒

以质粒为载体的DNA

克隆过程小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个至多个限制酶切位点具标记基因质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。假设要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是C1、科学家们经过多年努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是〔〕A.定向提取生物体的DNA分子B.定向地对DNA分子进行“剪切”C.在生物体外对DNA分子进行改造D.定向地改造生物的遗传性状D2、以下说法正确的选项是〔〕A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B.质粒是基因工程中唯一的运载体C.载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D.基因控制的性状都能在后代表现出来C3、人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是〔〕A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测C.增加质粒分子的分子量