魏培海仪器分析高效液相色法

关于魏培海仪器分析高效液相色法

高效液相色谱法的特点

1.高压：对流动相施加高压，使其迅速地通过色谱柱液；

2.高效：分离效率大高，甚至可实现手性分离；

3.高灵敏度：采用高灵敏度的检测器;4.速度快：与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法所需的分析时间较少，一般少于1h；

5.应用范围更广。第2页,共79页，星期六，2024年，5月HPLC与经典LC的比较经典液相色谱高效液相色谱

常压或减压

填料颗粒

柱效低

分析速度慢

色谱柱只用一次

不能在线检测

高压，15~35MPa

填料颗粒小，2~50μm

柱效高,n>30000块/m

分析速度快

色谱柱可重复多次使用

能在线检测第3页,共79页，星期六，2024年，5月HPLC与GC的比较相同点：具分离和分析功能，均可以在线检测。

不同点：

分析对象GC：适于能气化、热稳定性好、沸点较低的样品，不适于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品。占有机物的20%。HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，适于溶解后能制成溶液的样品；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品。占有机物的80%以上。第4页,共79页，星期六，2024年，5月流动相GC：流动相为惰性气体，如H2、N2、He、Ar；组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。HPLC：流动相为液体；流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度，增加了额外因素，如流动相极性、pH值、不同比例的两种或两种以上液体的配比。流动相种类较多，选择余地广。第5页,共79页，星期六，2024年，5月

GC：加温操作。

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。操作条件第6页,共79页，星期六，2024年，5月本章教学内容高效液相色谱仪

；液相色谱中的固定相和流动相；液相色谱法的主要类型

。第7页,共79页，星期六，2024年，5月本章知识目标熟悉液相色谱法的分离原理、分析对象；熟悉液相色谱仪的基本构造；熟悉液相色谱中的固定相、流动相类型，掌握其选择方法；了解液相色谱法中常用的检测器类型和结构。第8页,共79页，星期六，2024年，5月本章能力目标

能根据基团频率判断官能团的存在；能掌握用液相色谱仪进行样品组分的分离和定量方法

。第9页,共79页，星期六，2024年，5月第一节高效液相色谱仪第10页,共79页，星期六，2024年，5月第11页,共79页，星期六，2024年，5月第12页,共79页，星期六，2024年，5月第13页,共79页，星期六，2024年，5月主要部件：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。辅助装置：脱气机、梯度洗脱装置、自动进样装置、数据处理系统。组成部件第14页,共79页，星期六，2024年，5月基本流程第15页,共79页，星期六，2024年，5月第16页,共79页，星期六，2024年，5月一、高压输液系统

包括：由贮液瓶、高压泵、脱气机、梯度洗脱等装置。第17页,共79页，星期六，2024年，5月1．溶剂脱气装置作用：防止溶解在溶剂（流动相、试样）中的N2、O2进入检测器而使噪声剧增。脱气方式：氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱气等。第18页,共79页，星期六，2024年，5月2．高压泵作用：输送流动相。无脉动或脉动极小，保证输出的流动相具有恒定的流速。要求：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等。第19页,共79页，星期六，2024年，5月第20页,共79页，星期六，2024年，5月作用：分离过程中改变流动相的组成

，使所有峰都获得最佳分离效果，分析时间缩短。基本方式：高压梯度、低压梯度。2．梯度洗脱第21页,共79页，星期六，2024年，5月高压梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。第22页,共79页，星期六，2024年，5月低压梯度

：一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。如双元梯度、四元梯度等。第23页,共79页，星期六，2024年，5月二、进样系统进样方式：隔膜注射器进样停留进样阀进样自动进样器进样第24页,共79页，星期六，2024年，5月1．隔膜注射器进样

色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。优点：装置简单、价廉、死体积小。缺点：是允许进样量小，重复性差，只能用于低压系统(<10MPa,压力高了，密封垫会泄漏)。第25页,共79页，星期六，2024年，5月2．停留进样

停止流动相流动后再进样，以防止泄漏，可用于高压。缺点：重新升压后会产生不稳，保留时间和峰形重复性比较差。第26页,共79页，星期六，2024年，5月3．阀进样

结构和作用原理与气相色谱中所用的六通阀相同。

优点：进样准确，重复性好，适用于定量分析，更换不同体积的定量管，可调整进样量。第27页,共79页，星期六，2024年，5月第28页,共79页，星期六，2024年，5月4．自动进样

由计算机自动控制定量阀，按预先编制好的程序进行进样。优点：可自动完成几十或上百个样品的分析。在进行大量样品的分析时，使用自动进样器操作可节省大量人力和时间。缺点：装置成本高。第29页,共79页，星期六，2024年，5月第30页,共79页，星期六，2024年，5月三、色谱柱组成：包括柱管和固定相两部分。柱管材料通常采用优质不锈钢，柱长一般为5~40cm，内径为1~6mm

。第31页,共79页，星期六，2024年，5月

色谱柱的两端有烧结不锈钢或多孔聚四氟乙烯过滤片，以防止柱内的填料流出。填充好固定相后的柱子有方向性，在使用时，应使流动相的方向与柱子管外箭头标的方向一致。第32页,共79页，星期六，2024年，5月四、检测器检测器类型最高灵敏度（g/mL）温度影响流速影响用于梯度洗脱紫外光度(UV)选择性5

10-10低无可以示差折光(RI)通用性5

10-7有无不可荧光(FD)选择性10-12~10-9低无可以红外吸收(IR)选择性~10-7低无可以极谱选择性10-10~10-9有有困难电导选择性10-9有有不可质谱通用性~10-8无无可以第33页,共79页，星期六，2024年，5月1．紫外检测器

应用最广：适于约有70％的样品。

灵敏度高：线性范围大：死体积小：（1mm×10mm，8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感。分类：固定波长型、可调波长型和二极管阵列检测器。特点：第34页,共79页，星期六，2024年，5月固定波长：254nm或280nm

固定波长紫外检测器第35页,共79页，星期六，2024年，5月可调波长紫外检测器第36页,共79页，星期六，2024年，5月第37页,共79页，星期六，2024年，5月二极管阵列检测器第38页,共79页，星期六，2024年，5月第39页,共79页，星期六，2024年，5月第40页,共79页，星期六，2024年，5月2．荧光检测器

工作原理：利用某些试样具有荧光特性进行检测。特点：高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；第41页,共79页，星期六，2024年，5月第42页,共79页，星期六，2024年，5月3．示差折光检测器工作原理：折光指数与组成有关，连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；特点：通用型检测器；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。分类：偏转式、反射式和干涉型三种。第43页,共79页，星期六，2024年，5月偏转式：它是基于折射率随介质中的成分变化而变化，如入射角不变，则光束的偏转角是流动相(介质)中成分变化的函数。因此，测量折射角偏转值的大小，便可得到试样的浓度。第44页,共79页，星期六，2024年，5月第45页,共79页，星期六，2024年，5月第二节液相色谱中的固定相和流动相一、液相色谱固定相二、液相色谱流动相第46页,共79页，星期六，2024年，5月一、液相色谱固定相1．按固相材料的刚性程度分类刚性固体

硅胶：用于液固色谱的固定相，液相色谱的担体，化学键合固定相基质材料。

硬质凝胶聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成的多孔颗粒：只应用在离子交换色谱和凝胶色谱中。第47页,共79页，星期六，2024年，5月2．按固相填料的疏松程度分类薄壳型微珠载体（表面多孔型）构成：30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶、多孔氧化铝或分子筛等，形成壳形结构。特点：①多孔层厚度小、孔浅、柱效高；②分配过程在载体表面进行，出峰快；③颗粒大，装柱容易，适于常规分析

。第48页,共79页，星期六，2024年，5月全多孔型载体

构成：硅胶、氟化铝或硅藻土的微粒凝聚而成多孔球体。特点：颗粒较细，整个微粒全部是多孔性物质，表面积大，负荷量大。适合于复杂混合物分离和痕量分析。第49页,共79页，星期六，2024年，5月第50页,共79页，星期六，2024年，5月3．化学健合固定相

通过化学键的方式把有机分子结合到载体表面，形成一种新型固定相。它可以避免因机械涂布固定液，导致在色谱分离中使固定液流失的缺陷。第51页,共79页，星期六，2024年，5月化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：第52页,共79页，星期六，2024年，5月第53页,共79页，星期六，2024年，5月第54页,共79页，星期六，2024年，5月时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。第55页,共79页，星期六，2024年，5月第56页,共79页，星期六，2024年，5月化学键合固定相的特点（1）传质快：表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长：化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好：可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱。第57页,共79页，星期六，2024年，5月二、液相色谱流动相（1）称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。1.液相色谱流动相的特性第58页,共79页，星期六，2024年，5月①合适的溶解力与极性。②化学稳定性要好，与固定相和被测组分不发生化学反应。③与检测器相匹配。④溶剂的纯度要高。一般使用色谱纯试剂。⑤溶剂的流动性要好，黏度要低。2.流动相应满足以下要求第59页,共79页，星期六，2024年，5月3.流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙腈、水。第60页,共79页，星期六，2024年，5月第三节液相色谱法的主要类型

一、液-固吸附色谱二、液-液分配色谱三、离子交换色谱四、离子色谱五、离子对色谱六、排阻色谱第61页,共79页，星期六，2024年，5月一、液-固吸附色谱

固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂；

基本原理：组分在固定相吸附剂上吸附与解吸；主要适用范围：相对分子量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。第62页,共79页，星期六，2024年，5月

分离机制：

各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开

第63页,共79页，星期六，2024年，5月吸附系数

Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质及温度有关。吸附平衡

Xm+nYa→Xa+nYm

第64页,共79页，星期六，2024年，5月二、液-液分配色谱

固定相与流动相均为液体（互不相溶）基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：亲水性固定液—疏水性流动相疏水性固定液—亲水性流动相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。第65页,共79页，星期六，2024年，5月正相色谱——固定液极性>流动相极性分离顺序：极性小的组分先出柱；极性大的组分后出柱。分离对象：适于分离极性组分反相色谱——固定液极性<流动相极性分离顺序：极性大的组分先出柱；极性小的组分后出柱。分离顺序：适于分离非极性组分第66页,共79页，星期六，2024年，5月三、离子交换色谱

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂流动相：阴离子离子交换树脂作固定相—酸性水溶液

阳离子离子交换树脂作固定相—碱性水溶液基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应，基于组分与离子交换剂之间亲和力的差异进行分离。应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。第67页,共79页，星期六，2024年，5月选择性系数

注：Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关固定离子可交换离子待测离子

以阳离子离子交换为例：

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+第68页,共79页，星期六，2024年，5月第69页,共79页，星期六，2024年，5月四、离子色谱

传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。第70页,共79页，星期六，2024年，5月1.离子色谱法原理

离子色谱法：以离子交换树脂为固定相，以电解质溶液为流动相，用于分离阴阳离子。离子色谱中，应用最为广泛的的检测器为电导检测器。为消除流动相中强电解质背景离子对检测器的干扰，常设置一个抑制柱，称为双柱型离子色谱法或化学抑制型离子色谱法。第71页,共79页，星期六，2024年，5月2.离子色谱法基本装置离子色谱连续抑制装置图

(以测定阴离子为例)第72页,共79页，星期六，2024年，5月分离分析Br-为例分离柱上发生离子交换：NaOH洗脱：分离柱上流出Na+

（大量）

、Br-、OH-（大量）抑制柱上发生离子交换：进入检测器：H2O、HBr第73页,共79页，星期六，2024年，5月

双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),