如何理解测序蜂图

测序峰图测序方法 现代DNA序列测序可分为一二三代。一代测序第一代测序技术包括链终止法和化学降解法，其主要特点是以待测DNA为模板，根据碱基互补规则采用DNA聚合酶体外合成新链。由于新链中渗入了带有标记的碱基类似物，可用于制备末端带有标记的DNA单链。这些末端带有标记的DNA单链是一个群体，在凝胶电泳时可以形成彼此仅差一个碱基的梯形条带。根据末端碱基的特有标记可以读取待测DNA的序列组成。链终止法（Sanger法） 反应分别在4个试管中进行，每一试管中都含有：待测的DNA单链片段，作为模板；DNA聚合酶；序列已知且与模板3'端互补的引物；四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)；四种双脱氧核苷酸中的一种，作为DNA链合成的末端终止剂。在适当条件下进行互补链的合成，由于新掺入的核苷酸只能同新生链3’端的-OH连接，而2’,3’-双脱氧核苷三磷酸核糖基的2’,3’位-OH的氧已脱掉，失去了和后来的核苷酸连接的可能性，这时碱基的掺入就有两种可能性：dNTP掺入新生链，使链继续延伸。2’,3’-ddNTP掺入，使新生链的合成终止。由于两者掺入的几率不同，就形成一套长度不一的DNA片段。最后通过A、T、G和C四组反应的凝胶电泳放射自显影图谱，即可读出所测样品互补链的核苷酸序列。引自Molecularbiology5引自Molecularbiology5thedition,Weaver引自ThemethodsofDNAsequencing,WestOneServices 要求测序时使用的DNA聚合酶不能有5’-3’外切酶活性（可将新合成DNA链的5’-末端除去核苷酸而改变链的长度）、3’-5’外切酶活性（可将错配的碱基除去，再补上正确配对的核苷酸）。这两种活性会产生干扰条带。引自引自《基因组学第三版》，杨金水荧光染料标记物在Sanger法中的应用 目前已发现具有不同荧光色彩的标记化合物，可将其分别与指定的ddNTP结合，如ddATP标记绿色荧光，ddCTP蓝色荧光，ddTTP红色荧光，ddGTP黑色荧光。这四种标记的ddNTP混合加入到一个反应中，聚合链终止反应完成后，可以获得末端分别带有A、C、T和G的DNA单链。毛细管电泳 带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其分配系数不同进行高效、快速分离的电泳技术。引自引自互动百科引物问题(YM)：引物合成不纯或降解特征：序列一开始就出现移码现象处理方法：重新合成引物再测序结合问题(JH) 特征：（1）一开始就是双峰，在某一点终止或从头到尾双峰可能原因：模板上有2个或2个以上以上引物结合位点、模板或引物不纯。处理方法：重新制备样品或设计特异引物测序夹峰：模板量高特征：峰图中两峰之间夹有小杂峰，一般不影响主峰的读取，在信号图中表现为反应信号过高。处理方法：直接或稀释重跑，降低模板量测序宽峰可能原因：模板不纯或POP7胶中有气泡处理方法：重跑底峰不干净特征：信号图中基线不齐或信号弱可能原因：模板纯度不好，有杂质；模板量偏低或反应进行不充分处理办法：重新纯化或重送样；加量重做或重送样引物峰及引物二聚体峰特征：在20-30、40-60bp碱基处有高信号的峰形成，之后信号可能衰减。处理方法：重新合成引物或重新设计引物测序。引物形成二聚体致使反应无信号干扰峰（染料峰）和酒精峰特征：4个干扰峰固定出现在30、40、70、110bp附近。处理方法：重新测序降解峰特征：在220、450bp附近G碱基降解，峰型扩散。处理方法：若不影响碱基判读不安排调整，否则安排重新测序。重复序列（CF）特征：单碱基或两个以上碱基重复出现，导致后续峰图可能移码或乱峰。处理方法：因重复未测到的序列，建议加测反向补拼。高GC（GC）特征：序列局部碱基GC富集，之后可能信号衰减，峰图变乱。回文结构及其他结构（JG）特征：信号衰减或中断，峰图变乱。处理方法：最好选用GC优化程序。无信号特征：峰图表现为杂乱无章。形成原因：引物和模板不能正常结合反应，包括漏加，加错，有影响结合或影响反应因素。处理方法：菌液用通用引物测无信号的安排重新摇菌、自带引物