精液的稀释与保存

娄底职业技术学院李继仁精液的稀释与保存课时教学计划教学目标：使学生了解精液稀释液配制及精液稀释的方法。了解精液保存的三种方法。教学内容：1）精液稀释；2）精液的保存教学重点：稀释液配制与稀释方法；猪精液的常温保存；牛精液的冷冻保存。教学难点：稀释倍数的计算；冷冻保存精液的原理教学方法：讲授与讨论、播放视频带着问题学精液稀释液的成分有哪几类？各有什么作用？配制精液稀释液的水，要使用什么样的水？配制精液稀释液的药品可以用工业纯吗？精液稀释液中加入卵黄，起什么作用？精液稀释时是将精液倒入稀释液中吗？精液常温保存的温度是多少？低温保存的温度是多少？低温保存时是要快速降温还是要缓慢降温？为什么？冷冻保存精液的稀释液为什么要加入甘油？稀释后为什么要放置2~4小时后再冻结？液氮有哪些理化特性？液氮罐的使用要注意哪些问题？5.4精液稀释精液稀释是向精液中加入适宜于精子存活的稀释液。精液稀释的目的有两个：1）扩大精液容量，从而增加输精头数，提高公畜利用率；2）延长精子的保存时间及受精能力，便于精液的运输，使精液得以充分利用。精液稀释液的成分及作用1）营养剂：常用的营养物质有葡萄糖、果糖、乳糖、奶和卵黄。主要提供营养以补充精子生存和运动所消耗的能量。2）稀释剂：主要用于扩大精液容量，各种营养物质和保护物质的等渗溶液都具有稀释精液、扩大容量的作用，只不过其作用有主次之分而已。一般单纯用于扩大精液量的物质多采用等渗氯化钠、葡萄糖、果糖、蔗糖和奶类等。3）保护性物质（1）缓冲物质：常用的有柠檬酸钠、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾等。精液在保存过程中，随着精子代谢产物如乳酸和二氧化碳的积累，PH值会逐渐降低，超过一定的限度时，会使精子发生不可逆的变性。因此，为防止精液保存过程中的PH值变化，常加入一些缓冲剂。（2）防冷抗冻物质：在精液的低温和冷冻保存中，必须加入防冷抗冻剂以防止精子冷休克和冻害的发生。常用的防冷剂有：卵黄和奶类。（3）抗冻物质：常用的抗冻剂有：甘油、二甲亚砜、Tris（三羟甲基氨基甲烷）。（4）抗菌物质：主要有：青霉素、链霉素和氨苯磺胺、林肯霉素、卡那霉素、多黏霉素和恩诺沙星等。主要是抑制细菌生长繁殖，延长精子存活时间。（5）非电解质和弱电解质：可以降低精液的电解质浓度，减少电解质对精液保存的不良作用。常用的非电解质和弱电解质有：各种糖类、氨基乙酸、甘氨酸等。（6）其它添加剂：主要作用于改善精子外在环境的理化特性，以及母畜生殖道的生理机能，以利于提高受精机会，促进受精卵的发育。常用的有：

①酶类：如过氧化氢酶能分解精子代谢过程中产生的过氧化氢，β-淀粉酶具有促进精子获能，提高受胎率的作用。②激素类：如催产素、PGE等可促进母畜生殖道蠕动有利于精子运行而提高受胎率。③维生素类：如维生素B1、B2、B12、C、E等，具有改善精子活率，提高受胎率的作用。稀释液配制配制时要注意下列事项：①配制稀释所使用的一切用具必须彻底洗涤干净，严格消毒；②所用蒸馏水或去离子水要新鲜，药品要求用分析纯或化学纯，配制的稀释液要严格消毒；③使用的鲜奶需经过滤后在水浴（92-95℃）中灭菌10分钟，卵黄要取自新鲜鸡蛋，搅拌要充分；④药物称量要准确，要用分析天平；⑤抗生素、酶类、激素类、维生素等添加剂必须在稀释液冷却至室温时，方可加入。氨苯磺胺可先溶于少量蒸馏水（用量计入总量）中，单独加热至80度，溶解后加入稀释液。⑥稀释液要求现配现用，保持新鲜，且要严格消毒。稀释倍数和稀释方法1）稀释倍数确定精液以稀释液进行适宜的稀释可以延长精子的存活时间，但稀释倍数超过一定限度，精子的存活即会随着稀释倍数的提高而逐渐下降，以致影响受胎率。精液适宜稀释倍数与家畜种类和稀释液种类有关。确定稀释倍数应根据原精液的质量，尤其是精子的活率和密度、每次输精所需的精子数、稀释液的种类和保存方法来确定。一般牛4~6倍，猪1~3倍，兔3~5倍，羊2~4倍、鸡1~2倍、犬1~3倍。稀释倍数计算：精液稀释倍数=原精液的精子密度×输精剂量×输精时精子活率/输精要求的有效精子数。分装袋（支）数=采精量×稀释倍数÷输精剂量例：有一头种公猪，一次采得鲜精200ml，经检查精子的活力为0.8，精子的密度为2亿，预计在2天内输精，保存后活力不低于0.6，输精剂量为每袋80ml，要求输精时有效精子数不少于20亿个。问：本次采得的精液能稀释多少倍，能分装多少袋？稀释倍数=2×0.6×80÷20=4.8（倍）分装袋数=200×4.8÷80=12（袋）2）稀释方法（1）精液经检查合格后应立即进行稀释，越快越好；（2）稀释时，稀释液的温度和精液的温度必须调整一致，以30-35℃为宜；（3）稀释时，将稀释液沿精液瓶或插入的灭菌玻璃棒缓慢倒入，防止剧烈震荡；（4）若作高倍稀释，应先低倍后高倍，分次进行稀释；（5）稀释后精液立即进行分装（一般按一头母畜的输精量）保存。稀释液和精液的温度必须调整一致将稀释液沿精液瓶缓慢倒入精液中5.5精液保存精液保存的目的是为了延长精子的存活时间，便于运输，扩大精液的使用范围。现行精液保存的方法按保存的温度分为三种。常温保存（15~25℃）低温保存（0~5℃）冷冻保存（-79~-196℃）前两者保存温度都在0℃以上，以液态形式短期保存，故称液态精液保存。后者以冻结形式作长期保存，故称冷冻精液保存，牛的冷冻精液在生产中被广泛应用。常温保存保存温度在15-25℃，允许温度有一定的变动幅度，所以亦称变温保存或室温保存。常温保存所需设备简单，便于普及推广，特别适宜于猪的全份精液保存。1）原理精子的活动在弱酸性环境中受到抑制，能量消耗降低，一旦PH值恢复到中性左右，精子又可复苏。常温利于微生物的生长，因此，还必须加入抗菌素，此外，加入必要的营养物质及隔绝空气等有益于精液保存。2）稀释液猪精液的稀释液配方：葡萄糖5克，柠檬酸钠0.3克，乙二胺四乙酸二钠0.1克，蒸馏水100毫升，青霉素1000单位，链霉素1000微克。常用的猪、马、绵羊精液常温保存稀释液配方表见教材。现在市场有商品稀释粉出售。3）保存方法一般是将稀释后的精液装瓶密封，用纱布或毛巾包裹好，置于15-25℃温度中避光存放。①一般保存在17±0.5℃恒温箱中，每隔12h翻转一次。②旱井保存法：建一个室内旱井，里面不积水，应干燥。一般用空心水泥管，直径30公分，高4米左右，底部封死。可使温度维持在15-20℃，而且夏冬温度变化不大。③水井保存法：精液用蜡封好以后，用绳子吊入水井4-6米深处，温度可维持在10-18℃，而且变化幅度不大。④地窖保存法：在地势较高处，挖一个2-3米地窖，温度可保持在20℃左右。猪的精液常温保存原理与稀释液配制技术猪的精液稀释与保存低温保存1）原理精液稀释后缓慢降温至0-5℃保存，利用低温来抑制精子的活动，降低代谢和能量消耗，抑制微生物生长，以达到延长精子存活时间的目的。当温度回升后，精子又恢复正常代谢机能并维持其受精能力。为避免精子发生冷休克，在稀释液中添加卵黄、奶类等防冷物质，并采用缓慢降温的方法。2）低温保存技术①降温处理：稀释后的精液，为避免精子发生冷休克，须采取缓慢降温方法，从30℃降至5-0℃，每分钟下降0.2℃左右为宜，整个降温过程大约需1-2小时完成。将分装好的精液瓶用纱布或毛巾包缠好，再裹以塑料袋防水，置于0-5℃低温环境中存放，也可将精液瓶放入30℃温水的容器内，一起置放在0-5℃中，约经1-2小时，精液温度即可降至0-5℃。②保存方法：最常用的方法是将精液放置在冰箱内保存，也可用冰块放入广口瓶内代替；或者在广口瓶里盛有化学致冷剂（水中加入尿素、硫酸铵等）的凉水内；还可吊入水井深处保存。③升温处理：低温保存的精液在输精前要进行升温处理。升温的速度对精子影响较小，故一般可将贮精瓶直接投入30℃温水中即可。牛羊马驴精液低温保存稀释液配方见教材。冷冻保存概念：用精液冷冻稀释液对精液进行稀释，并按照一定的工艺对精液进行降温，在超低温（-79℃或-196℃）条件下长期保存精液的方法（过程）。优点：冷冻保存解决了精液长期保存的问题，使精液不受时间、地域和种畜生命的限制。1）精液冷冻原理精子在冰点下贮藏时，精子中的水分重新按几何图形成冰晶。冰晶是造成精子死亡的主要原因。冰晶只有在一定的温度范围内即0--60℃才能形成，如在降温过程中能以极快的速度越过这个温度区，则会使水分子来不及形成冰结晶而造成水分子无次序地排列形成均匀的团块，即玻璃化，玻璃化不会出现原生质脱水，不致损害细胞的结构。玻璃化是可逆性不稳定的，当缓慢升温再经过冰结晶温度区域时，玻璃化又先变为冰晶化再变为液化，所以精液解冻时也要快速升温。加入甘油冷冻保护剂可减缓结晶、降低危险温区上限，防止冷冻过程中形成大冰晶。2）冷冻精液的冷源冷冻精液的冷源有干冰（即固态CO2

-79℃）和液氮（-196℃）。液氧（-183℃）易爆炸，不安全。液氦（-269℃）制做成本高。液氮是以空气为原料，经压缩、冷却分离出的液化氮。氮是无色、无味、无毒的气体。在一个大气压下，当温度降到-196℃时，氮气即变为液态。在-195.8℃时沸腾气化（使空气中的水份冷冻而形成白色气雾），变成气体时有强大制冷能力。气化的膨胀率为680倍，因此液氮罐盖塞要防止密闭，以防内压增大而爆炸。液氮气化，会使室内氧气相对不足，因此放置液氮的工作室应通风良好。液氮无杀菌能力。比重(0.808kg/L)。3）液氮容器液氮容器用于贮存冷冻精液和贮存、运输液氮。液氮容器分为开放式和密闭式两种。在制作和贮存冷冻精液中常用开放式液氮容器。液氮罐有大中小不同的规格。液氮罐结构包括：

外壳、内槽、真空夹层、颈管、盖塞、提简、外套。液氮罐应该具有绝热性能好、坚固耐用、使用方便等特点。使用中要防止撞击、倾倒、定期刷洗保养。液氮罐的构造液氮罐的构造液氮及液氮罐的使用4）冷冻精液的剂型冷冻精液的剂型亦称包装方法、分装方法。目前广泛应用的剂型有细管型、安瓿型和颗粒型三种，它们各有利弊。细管型有0.25、0.5、1.0ML三种容量，是目前国外比较流行的包装方法。细管型冷冻效果好；剂量标准化，不易受污染，标记鲜明；体积小；适于机械化生产。但如封口不好，解冻时易破裂；须有装封、印字等机械设备。

5）冷冻保存稀释液冷冻精液稀挥液的成分一般应含有低温保护剂（卵黄、奶液）、抗冻保护剂（甘油等）、维持渗透压物质（糖类、柠檬酸钠）、抗生素及其他添加剂。冷冻精液的稀释液根据配制要求和稀释的需要，将其分别配制，以便于使用。冷冻精液的稀释液见教材。①基础液将糖类、盐类等可通过高温消毒的药品，成批量地配制成溶液，用瓶装密封保存。②I液根据每次采精所需要的稀释液虽，在基础液中加入一定量的卵黄和抗冷剂等配制成I液，用作精液的第一次稀释。③Ⅱ液取需要量的I液，按照比例加入经灭菌处理的甘油等冷冻保护剂，配制成含甘油的Ⅱ液，用作精液的第二次稀释。6）冷冻精液制作步骤（以细管冷冻精液为例）①精液品质检查，活率达0.7以上。②等温Ⅰ液初步稀释（稀释倍数为终倍数一半）。③纱布包裹放冰箱冷藏室经1~1.5h缓慢降温至0~5℃。④用Ⅱ液进行等体积等温度（0~5℃）稀释。⑤在原温度环境下放置2～4h，使甘油充分渗透进入精子体内（平衡）。⑥以长为25～133mm，存量为0.25或0.5m1的各种颜色的聚氯乙烯复合塑料细管，通过吸引装置将平衡后的精液进行分装，用聚乙烯醇粉末、钢珠或超声波静电压封口。⑦支架距液氮面2~2.5㎝，细管置液氮蒸气上冷冻5~7min。⑧抽样2～3支进行检测，合格的进行包装、标记（包装上须明确标明公畜品种、编号、生产日期、精子活率及数量），最后浸入液氮中保存。冷冻精液制作7）冷冻精液的储存储存精液时，液氮罐应放置在于燥凉爽、通风和安全的专用室内。内专人负责，每隔5～7d检查一次液氮容量。当剩余液氮为液氮罐容量的2／3时，须及时补充。同时要经常检查液氮罐的状况，如发现罐外壳有小水珠、挂霜或发现液氮消耗过快时，说明液氮罐的保温性能有问题，应及时更换。每次入库或分发，耗损的冷冻精液数量，月结算一次。进行长期储存的冷冻精液，每隔半年左右须抽样检查精子活率，如发现有异常情况应