生物制药 习题答案

第一章绪论一、生物技术药物分为哪些类型？应用重组DNA技术制造的多肽、蛋白质类基因药物来自动物、植物和微生物的天然生物药物合成与部分合成的生物药物二、生物技术药物的特性分子结构复杂具有种属特异性治疗针对性强，疗效高稳定性差基因稳定性免疫原性体内的半衰期短受体效应多效应和网络性效应检验的特殊性三、生物技术制药的特征是什么？高技术高投入长周期高风险高收益

第二章基因工程制药基因工程技术生产药品的优点有哪些？利用基因工程技术可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障。可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。利用基因工程技术可以发现和挖掘更多的内源性生理活性物质。利用基因工程和蛋白质工程对生理活性物质进行修饰和改造，提高药效价值。利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。基因工程药物制造的主要程序有哪些？分离目的基因，目的基因与载体连接构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌发酵，目的基因表达产物的分离纯化，产品的检验利用基因工程生产蛋白质或多肽首先需要得到其基因，制备目的基因常用的方法有哪些？目的基因来源于原核细胞，可选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因。目的基因来源于真核细胞，常用的方法有：反转录法：为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可以从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA,以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录生成该蛋白质mRNA互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶Ⅰ作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。反转录PCR：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA第一链（不需要合成cDNA第二链），再以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。化学合成法利用逆转录法获得目的基因的基本过程mRNA的纯化从表达目的基因的细胞中提取总RNA，用寡聚脱氧胸苷(dT)纤维素柱从总RNA中提取纯化mRNA。cDNA的合成以mRNA为模板，利用逆转录酶合成cDNA第一链，再用DNA聚合酶合成cDNA的双链。cDNA克隆利用合适的连接方法，将产生的双链cDNA片段插入到合适的载体中。构建cDNA文库将cDNA于载体连接的重组体转入大肠杆菌中，产生的克隆群体为cDNA文库。从cDNA文库中筛选目的基因得到cDNA文库后，通常采用核酸探针杂交法和免疫反应鉴定法从数以万计的DNA片段中筛选出目的基因。宿主菌的选择 目的基因获得后，必须在合适的宿主菌中表达，才能获得目的产物。宿主菌应满足以下要求：具有高浓度、高产量、高产率；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行重组DNA技术；产物容易提取纯化。 基因表达的宿主细胞分为两大类，第一类是原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。真核基因在原核细胞中表达所用的表达载体必须具备哪些条件？载体能够独立的复制；具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记,且克隆位点应在启动子序列后，以便外源基因表达；具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA酶识别；具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录；具有很强的终止子，使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因；所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。七、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？1.外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接相关2.外源基因的表达效率：A、启动子的强弱：目的基因插入表达载体强启动子的下游，增加基因的表达水平B、核糖体结合位点的有效性C、SD序列和起始密码的间距D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码子3.表达产物的稳定性4.细胞的代谢负荷5.工程菌的培养条件八、真核基因在大肠杆菌中表达的形式有哪些？1.以融合蛋白的形式表达药物基因真核基因在大肠杆菌中表达的一种简便方法是使其表达为一种融合蛋白的一部分，这种融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。2.以非融合蛋白的形式表达药物基因非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。3.分泌型表达蛋白药物基因外源蛋白的分泌表达是通过将外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游而实现的。九、质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒的不稳定性？工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。结构不稳定：外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。选择合适的宿主菌选择合适的载体施加选择压力分阶段控制培养控制培养条件固定化十、用于分离纯化的技术应满足哪些要求？技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；选择性要好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离出来，达到较高的纯化倍数；收率要高；两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。十一、分离纯化常用的色谱分离方法有哪些？它们的原理是什么？ 分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，优点是具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。常用的色谱分离技术有离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤层析、高效液相层析等。离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离目的。疏水层析是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离。亲和层析是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力而达到分离纯化目的。凝胶过滤层析是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。十二、分离纯化工艺应遵循哪些原则？具有良好的稳定性和重复性；尽可能减少组成