第三章 提取和分离

第三章DNA的提取与纯化基因工程需要三种不同的DNA:

总DNA

质粒DNA

噬菌体DNA学习内容：制备细胞总DNA培养、搜集细菌细胞制备细胞提取物DNA纯化、浓缩从其他生物中提取总DNA质粒DNA提取根据分子大小分离根据结构分离质粒扩增提取噬菌体DNA噬菌体的培养制备非溶源性噬菌体收集噬菌体从λ噬菌体中纯化DNA纯化M13DNAFigure3.1

ThebasicstepsinpreparationoftotalcellDNAfromacultureofbacteriaBasicSteps1.制备总DNA

基本步骤：1)收集细菌细胞2)打碎细胞，释放内容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩1.1培养、搜集细菌细胞

两种类型的细菌培养基的成分：M9培养基：

Na2HPO4(6.0)KH2PO4(3.0)NaCl(0.5)NH4Cl(1.0)MgSO4(0.5)Glucose(2.0)CaCl2(0.015)LB培养基：Yeastextract(5)NaCl(10)1.1培养、收集细菌细胞37°C，150-250rpm达到最大浓度2-3×109cell/ml,600nm下的OD值，1OD相当于0.8×109cell/mlFigure3.2EstimationofbacterialcellnumberbymeasurementofopticaldensityFigure3.3

Harvestingbacteriabycentrifugation1.2制备细胞提取物

利用溶菌酶、EDTA或两者结合。溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。EDTA络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解DNA酶的活性。一般溶菌酶或EDTA足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入SDS。

Figure3.4

Preparationofacellextract.PreparationofacellextractFigure3.5Removalofproteincontaminantsbyphenolextraction.◆

PurificationofDNAfromacellextract1.制备细胞总DNA1.4DNA的浓缩与浓度测定最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。260nm下测定吸光度，1OD相当于50μg双链DNA/ml。A260/A280=1.8，<1.8表示含有酚或蛋白质,>2说明有RNAFigure3.6CollectingDNAbyethanolprecipitation.◆ConcentrationofDNAsamplesFigure3.7TheCTABmethodforpurificationofplantDNA◆

PlantDNA(CTAB法)十六烷基三甲基溴化铵Figure3.8

Theuseofananion-exchangechromatographyresininDNApurification.阴离子交换层析法2质粒DNA提取质粒DNA的大小（8%）。DNA的构造

Alkalinedenaturation

Ethidium

bromide（溴化二氨乙苯啡啶）-caesium

chloride（氯化铯）densitygradientcentrifugation2质粒DNA提取2.1根据分子大小提取质粒DNAsphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。问题：裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA质粒分子非常大时，将与染色体DNA共沉淀Figure3.9Preparationofaclearedlysate.Sphaeroplast残壁细胞2质粒DNA提取2.2根据分子构造提取碱裂解法基本原理：在非常窄的pH范围内，非螺旋化的DNA会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解液中加入氢氧化钠，调pH值至12.0~12.5,破坏氢键，使DNA变性。加入酸，变性的细菌DNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。另外一个优点，利用SDS（十二烷基磺酸钠）（Sodiumdodecylsulfate，SDS），裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白质和RNA。Figure3.10Twoconformationofcirculardouble-strandedDNA.Twoconformationofcirculardouble-strandedDNAFigure3.11Plasmidpurificationbythealkalinedenaturationmethod.Alkalinedenaturation2质粒DNA提取2.2EB—CsCl密度梯度离心法在大离心力条件下，形成梯度，生物大分子形成条带。条带的位置取决于其浮力密度。最上部是蛋白质，中间是DNA，下部是RNA。Figure3.12

CsCldensitygradientcentrifugation.CsCldensitygradientcentrifugation2.2EB—CsCl密度梯度离心法EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。Figure3.13PartialunwindingoftheDNAdoublehelixbyEtBrintercalationbetweenadjacentbaseparirs.EBEB如何与DNA结合?Figure3.14PurificationofplasmiodDNAbyEtBr-CsCldensitygradientcentrifugation如何分离质粒DNA？2质粒DNA提取2.3质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如氯霉素，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。Figure3.15Plasmidamplification●

PlasmidamplificationInhibitorofproteinsynthesis:Chloramphenical,12h,3噬菌体DNA的制备

当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。

然而获得大量的噬菌体DNA是一个障碍。每ml菌液可以获得1010λ噬菌体，但只能产生500ngDNA。3噬菌体DNA的制备3.1噬菌体的培养

自然培养的噬菌体是溶源性的。要获得大量的细胞外λ噬菌体，必须经过诱导培养使所有的λ噬菌体都进入裂解周期，使细胞死亡释放λ噬菌体。

3.1噬菌体的培养大部分实验室都使用cI突变的温度敏感突变体。cI基因可以使噬菌体保持整合状态，突变后转变成溶菌性的。在cIts突变体中，cI基因在30°C条件下正常表达，在42°C时，不能正常表达，产生溶菌性。Figure3.17

Inductionofaλclts

lysogen（溶原菌）bytransferringfrom30℃to42℃LysogenicλphageAt30℃,cltsgeneproteinworks,Keeplysogeny（溶原性）:At42℃,cltsgeneproteindoesnotwork,produceextracellular

phage（细胞外抗菌素）.Figure3.18Achievingtherightbalancebetweencultureageandinoculumsizewhenpreparingasampleofanon-lysogenicphageNon-lysogenic

λphage（Lytic)由于缺失修饰，大多数基因工程载体属于此类型。3噬菌体DNA的制备3.3收集噬菌体

噬菌体颗粒非常小，所以只有高速离心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可以收集λ噬菌体，重新溶解在少量的溶液中。3噬菌体DNA的制备3.4从λ噬菌体中纯化DNA

PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌DNA。这些组成部分可以通过梯度离心去掉。除去CsCl后可以获得纯净的λ噬菌体。然后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。Figure3.19Collectionofphageparticlesbypolyethylene（聚乙烯）glycol（乙二醇）(PEG)precipitation

CollectionofphageparticlesPurificationofλphageFigure3.20PurificationofλphageparticlesbyCsCldensitygradientcentrifugation.3.5纯化M13DNA

每ml菌液可以获得1012的噬菌体。这意味着少量的培养物可以获得大量的噬菌体，如5ml或更少。由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解物的问题，也不需要CsCl梯度离心。Fi