微生物工程原理复习

11、微生物工程：是以微生物为主体，应用生物科学，特别是微生物学的理论和方法，结合现代工程技术手段，改良、加工、繁殖微生物，以获取微生物体本身或某些代谢产物等有用物质，为人类生产、生活服务为目的一2、初级代谢产物：是微生物代谢产生的，并是微生物生长繁殖所必需的代谢产物。它们的生源和生物合成过程在各种微生物体内基本相同。3、次级代谢产物：是微生物在生长的稳定期合成具有特定功能的代谢产物，与菌体的生长繁殖无明确关系，它们的生物合成具有特异性。生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。5、转化产品：是利用微生物细胞中的一种或多种酶，作用于某化合物的特定部位(基团),使之转变为结构类似但具有更高经济价值的的另一种化合物6、组成酶：是细胞固有的酶，它们的合成与环境无关，随菌体形成而合成，在菌体内的含量相对稳定。是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。8、诱导剂：能促进诱导酶产生的物质称为诱导剂，它可以是该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或是9、阻遏：在某代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物的生成，这种现象称为酶合成的阻遏。特点：同时阻止合成途径中所有酶的合成。11、分解代谢产物阻遏：指细胞内同时存在两种以上可利用底物(碳源或氮源)时，利用快的那种底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。12、同工酶：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有13、代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，有可能使代谢朝着人们希望的方向进行，即为代谢指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤缺陷(酶缺失),从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养过程中外源补加该营养物质才能生长的突变株。无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用(代谢)后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺。从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等19、有机氮源：是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。19、前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。20、产物促进剂：是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。如酶的在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或正常代谢的某一中间产物积累起来。22、碳氮比(C/N):碳元素总量与氮元素总量的比例。实际中常用碳源与氮源的比值表示。23、灭菌：采用物理和化学方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程，称为灭菌。2细胞而不能杀死芽孢。25、除菌：用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。26、防腐：利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。27、种龄：是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。29、连续培养：是指以一定的速率向发酵液中添加新鲜培养基的同时，以相同的速率流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定不变，使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法。30、发酵热：就是发酵过程中产生的热量减去散失的热量即净热量。31、(1)呼吸强度(QO2):(2)摄氧率(r):单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1。(3)临界氧浓度(C临界)C临界：指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。是微生物进行某种生理活动时，对环境中氧浓度的最32、染菌：发酵过程中感染了对正常发酵有影响的“杂菌”。所谓“杂菌”,是指在发酵培养中除了生产菌以外的其他微生物。1、微生物工程的定义：微生物工程是以微生物为主体，应用生物科学，特别是微生物学的理论和方法，结合现代工程技术手段，改良、加工、繁殖微生物，以获取微生物体本身或某些代谢产物等有用物质，为人类生产、生活服务为目的一是将传统的发酵技术与现代的基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、代谢工程、生物信息工程、化学工程和计算机控制等新技术结合并迅速发展的现代发酵技术。2、微生物工程与传统的发酵工程的区别：31)微生物工程所利用的生物，除传统微生物外，还包括“工程微生物”、动植物细胞或“工程细胞”;2)强化了上游的基础研究；3)自动化程度逐步提高；4)生产规模更大；5)上、中、下游各个环节的衔接更趋合理1)、原料来源广，价格低。主要是农副产品，不需精制2)、微生物在自然界密发广基的多细施源丰富3)、反应条件温和，能耗少，生物转化反应专一性强，产品的转化率高，生产过程安全。4)、微生物发酵代谢途径多样化，产品多样化。5)、微生物繁殖速度快，发酵时间短，可以缩短生产周期，提萨诵备利用成本。6)、微生物发酵过程是一个纯培养过程，发酵过程需防止杂菌污染。从广义上讲，由三部分组成：上游工程、生物反应过程、下游工程。\接种(1)培养基的制备；(2)无菌空气的制备；(3)菌种与种子扩大培养；(4)发酵培养；发酵罐(5)发酵产品下游加工过程；(6)微生物过程废弃物的处理(废气、废渣、废水)灭菌定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的产品的发酵工业，包括单细能韵酵姆辅藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速囊量体段，代稳定期广但具有更高经济价值的的另一种化合物。微生物生物转化包括有脱氢、氧化、羟化、缩合、脱羧、氨化、脱氨、同分异构等催化反应。转化反应的底物不是微生物细胞的产物，而是外源物质，微生物仅在其分子上进行加工。最古老的转化反应：乙醇转化为乙酸的醋酸发常见生物转化产品：甾体、抗生素、前列腺素。(一)微生物工业产品类型菌体酶制剂转化产品机能利用初级代谢产物、次级代谢产物、基因工程外源蛋白酵母发酵、菌体蛋白(单细胞蛋白)发酵4保藏菌种保藏菌种斜面活化扩大培养-主发酵产物下游处理成品碳源、氮源、无机盐等营养物质空气空气净化处理无菌空气无菌空气种子培养基灭菌天然菌种的生产性能较低，都需经过精心选育，才能达到工业生产的要求。用于工业生产的菌种，通常应符合以下基本要求(1)具备高产目的产物的能力(2)生长繁殖能力强，有较高的生长速率，发酵周期短。(3)具备较低的工业发酵原料成本，能利用价格便宜、来源广泛的农副产品原材料。(4)培养要求不高，培养条件易于控制。(5)发酵过程不产生或少产生非目标副产物。(6)具备稳定的遗传特性，不易退化和变异，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。(7)菌体不是病源微生物，不产生有害生物活性物质或毒素。选择生产菌种应注意的因素(1)原料方面：广，转化率高；(2)产物方面：目的产物含量高，副产物少； (3)菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定(4)设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。(培养条件易，周期短，需氧量小，抗污染能力强)生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。①同时诱导：即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖加入到E.coli培养基中后，即可同时诱导出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶和半乳糖苷②顺序诱导：即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分15、酶合成的阻遏：在某代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物的生成，这种现象称为酶合成的阻遏。末端产物阻遏：常普遍存在与氨基酸、核苷酸生物合成途径中。(1)末端代谢产物阻遏：由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的阻遏产物末端代谢产物阻遏。特点：同时阻止合成途径中所有酶的合成。对直线式反应途径来说，未端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏止，例如精氨酸的生物合成途径。对分支代谢途径来说，情况较为复杂。每种未端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。而代谢途径分支点前的酶则受所有分支途径末端产物的共同阻遏。末端代谢产物阻遏在微生物代谢调节中有着重要的作用，它保证了细胞内各种物质维持适当的浓度。当微生物已合成了足量的产物，或外界加入该物质后，就停止相关酶的合成，而缺乏该物质时，又开始合成有关的5分分造(2)分解代谢产物阻遏指细胞内同时存在两种以上可利用底物(碳源或氮源)时，利用快的那种底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。这种阻遏并不是快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起，因此称为分解代谢物阻遏。16、为什么大肠杆菌出现生长阻遏(二次生长)?有人将大肠杆菌培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上，发现该菌可优先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗尽后才开其原因是葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成，这一现象称葡萄糖效应。由于这类现象在其他代谢中普遍存在，后来人们把类似葡萄糖效应的阻遏统称为分解代谢物阻遏。17、(1)酶活性的激活前馈激活：底物对酶活性的促进作用。(2)酶活性的抑制①竞争性抑制②反馈抑制：代谢途径中末端产物过量抑制该途径初期的酶的活性。(一)直线式代谢途径的反馈控制对于只有一个末端产物的途径，当末端产物达到一定浓度时，就会反馈控制该代谢途径。末端产物的反馈阻遏一般是阻止该途径所有酶的合成；末端产物抑制一般是抑制该途径第一个酶的活性(二)分支代谢途径的反馈控制在有两种或两种以上的末端产物的分支代谢途径中，调节方式较为复杂。其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用，分支代谢的反馈调节方式有多种。(1)同工酶反馈控制(2)协同反馈抑制在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用。若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶不产生或产生很小的抑制作用。苏氨酸脱氨酶弱的独立控制作用。当所有的末端产物同时过量时，苏氨酸脱氨酶并亮氨酸a-酮丁酸并亮氨酸a-酮丁酸-(反馈抑制:同途径中的第一个酶起抑制作用，而且各种末端产反馈抑制:同途径中的第一个酶起抑制作用，而且各种末端产(图8图8.5异亮氨酸合成途径中的直线式反馈抑制物过单时，力能得还任中的第1时打甲引计o工业发酵的目的就是大量的积累人们所需要的微生物代谢产物。在正常的生理条件下，微生物总是通过其代谢调节系统最经济地利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料，也不积累中间代谢产物。人为地打破微生物的代谢控制体系，有可能使代谢朝着人们希望的方向进行，即为代谢的人工控6目前，人工控制代谢主要通过遗传学和生物化学的方法来实现。19、次级代谢产物的特征：(1)次级代谢产物一般在菌体生长后期合成(2)次级代谢产物合成时常伴随菌体形态或生理学上的变化(3)次级代谢产物具种属特异性(4)次级代谢产物酶的专一性低(5)次级代谢产物的合通过改变微生物的遗传物质可以从根本上打破微生物原有的代谢控制机制。(一)营养缺陷型突变株的应用营养缺陷型突变株：指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤缺陷(酶缺失),从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养过程中外源补加该营养物质才能生长的突变株。由于其在合成途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累，因此，它就解除了终产物的反馈调节，使得某一中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累。(1)在直线途径上积累某一中间产物(2)在分支途径上积累某一中间产物或另一末端产物(二)抗反馈突变株的应用抗反馈突变株：指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼而有之的菌株。在这类菌株中，反馈调节已经解除，因此能大量积累末端产物。末端产物结构类似物筛选：未突变者不长，突变为抗性的，可以产生菌落。(末端产物结构类似物能起到相同的抑制作用，但不能被菌体利用。)(三)组成型突变株筛选诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。■筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。①添加诱导酶合成的抑制物②交替培养法③显色反应法21、发酵培养基的成分及来源作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分，提供合成目的产物所必须的碳成分来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃等氮源主要用于构成菌体细胞物质(氨基酸，蛋白质、核酸等)和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。选择无机氮源：无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用(代谢)后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。]满足菌体生长2、有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。三、无机盐7无机盐的生理功能>酶的组成成分或酶的激活剂，构成酶的最大活性>作为某些细胞结构物质的组成成分>维持细胞结构的稳定性>调节细胞渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等>作为某些自养微生物的能源。·优良溶剂；(物质进出细胞)如：高比热；高汽化热，高沸点；冰的密度小于水等，保证生命活动的正常进行。其质量对产品质量影响很大。(1)碳分解代谢阻遏现象(特别是葡萄糖效应)(2)发酵初期pH的变化：微生物降解碳水化合物过程中，会出现大量的中间有机酸，如果供氧不足，中间有机酸不能完全氧化，积累在细胞中，会使发酵液的pH下降。1)有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质2)有些产物会受氮源的诱导和阻遏3)有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力1)根据微生物的特点选择培养基；2)根据发酵方式选择培养基；3)从生产实践和科学试验的不同选择培养基；4)从经济效应方面考虑选择培养基。25、培养基按其生产用途可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。(1)孢子培养基：能使菌体迅速生长，产生较多的孢子；供菌体繁殖孢子的一种固体培养基。要求：能使菌体生长快，产生孢子数量大、质量好，且不会引起菌种变异。特点：C、N源不宜多，否则只长菌丝，少长或不长孢子；无机盐浓度要适当控制，否则会影响孢子的颜(2)种子培养基是满足菌种生长的培养基。目的是为下一步发酵提供数量较多，强壮而整齐的种子细胞。一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。最后一级种子培养基成分最好能接近发酵培养基。(3)发酵培养基目的：使接种菌丝生长并能高效表达，获得高的发酵产量，同时组分尽可能单一，以保证高的得率。要求：营养丰富完全，有利于产物合成；不能大量加入快C、快N源，应和慢C、N源相结合；在产物分泌期间，pH稳定；加入适量合成所需的物质，如前体等，进行定向发酵；采用中间补料，以提高发酵单位；原料的考虑-成本问题在大规模生产时，原料应该价廉易得，还应有利于下游的分离提取工作。干热灭菌法。火焰灭菌法。电磁波、射线灭菌法。湿热灭菌法。化学药剂灭菌法。过滤除菌法27、湿热灭菌包括：高压蒸汽灭菌法；煮沸灭菌法；间歇灭菌法；巴氏灭菌法。28、湿热灭菌原理：就是直接用高温蒸汽灭菌。蒸汽在冷凝时释放出大量潜能，并且蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。湿热灭菌的效果：取决与致死温度和致死时间。8致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间。热阻：微生物在某一特定条件下(一定的温度、加热方式等)的致死时间。相对热阻：指在相同条件下两种微生物热阻的比值。将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。不耐热的液体培养基、血清、维生素、氨基酸及气体等物的灭菌多用此法除菌。过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。在一定温度下，微生物的受热死亡符合单分子反应动力学即微生物的热死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成(1)营养成分的保持湿热灭菌时，微生物被热死的同时，培养基的营养成分也遭到了一定的破坏。特别是氨基酸和维生素。在热的作用下某些营养成分还可能因受热而相互之间发生反应，造成培养基中原有营养成分的数量变化，因而影(2)微生物的耐热性细菌芽孢的热阻较大，灭菌所需要的时间取决于把细菌芽孢减少到所规定数目的时间。同时一个细菌只能形成一个芽孢，故把培养基中细菌和芽孢数之和作为计算依据比较合理。对微生物的耐热性影响很大从而改变细胞的生理反应，促使其死亡。所以培养基的pH越低，所需的时间也越短。(4)培养基成分高浓度的有机物会包于细胞周围，形成一层薄膜，影响热的传入。而高浓度的盐类、色素则削弱其耐热性，(5)泡沫泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，杀死其中的杂菌。因此灭菌时需要加入适量的消泡剂。(6)颗粒颗粒小，容易灭菌，颗粒大，则难灭菌。对于含有少量较大颗粒及粗纤维的培养基，可用粗滤的方法(不应影响培养基质量)予以除去，培养基结块会造成培养基灭菌的不彻底，必须注意。(1)过程包括：升温、保温和冷却三阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%。(2)培养基的预热的目的：1)防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温度过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释；2)防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。(3)、分批灭菌的注意事项1)各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。2)排气量不宜过大，以节约蒸汽3)灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。4)在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。2、连续灭菌(又称连消)将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。9连续灭菌分批灭菌灭菌灭菌1)各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。2)排气量不宜过大，以节约蒸汽3)灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。4)在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。*使用前一定预热!目的：(1)防止直接导入水蒸气时由于培养基与蒸汽的温差过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释(2)防止直接导入水蒸气所造成的泡沫急剧上升而引起物料外溢。(1)配料预热罐：将配制好的料液预热到60~70°C,以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生(2)连消塔：用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度(126~132°C);(3)维持罐：使料液在灭菌温度下保持5~7min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够(4)冷却管：使料液冷却到40~50°C后(冷水喷淋),输送到预先灭菌过的罐内。连续灭菌常见工艺流程-连消塔式连续灭菌流程-喷射加热式连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程好气性发酵中需要大量无菌空气，但空气绝对无菌是很难做到的，也是不经济的，只要使在发酵过程中不至于造成染菌而出现“倒罐”现象，这就是通风发酵对无菌空气的要求。不同类型的发酵，由于菌种生长活力、繁殖速度、培养基成分和pH值及发酵产物等不同，对杂菌抑制的能力不同，因而对无菌空气的无菌程度要求(四)过滤除菌当空气流过介质时，上述五种除菌机理同时起作用，不过气流速度不同，起主要作用的机理也就不同。当气流速度较大时，除菌效率随气流流速的增加而增加，此时惯性冲击起主要作用；当气流速度较小时，除菌效率随气流流速的增加而降低，此时扩散起主要作用；当气流速度中等时，可能是截留起主要作用。如果空气流速过大，除菌效率又下降，则是由于已被捕集的微粒又被湍动的气流夹带返回到空气中。●介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达(1)设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。(2)设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。(3)保证进口空气清洁度，如加强生产场地卫生管理，正确选择进风口，加强空气压缩前的预处理。(4)降低进入空气过滤器的空气相对湿度，如使用无油润滑的空气压缩机，加强空气冷却和去油，提高进入过两级冷却、加热除菌流程；冷热空气直接混合式空气除菌流程；高效前置过滤空气除菌流程；利用热空气加热1)两级冷却、加热除菌流程特点：两次冷却、两次分离油水、适当加热，能充分地分离油水。可适应各种气候条件，能充分地分离油水，使空气达到低的相对湿度下进入过滤器，以提高过滤效率，尤其2)冷热空气直接混合式空气除菌流程特点是可省去第二次冷却后的分离设备和空气加热设备，流程比较简单，利用压缩空气来加热析水后的空茄子瓶斜面培养摇瓶液培养砂土孢子斜面孢子固体培养基培养实验室种子制备阶段种子罐培养生产车间种子制备阶段冷冻干燥孢子发酵罐46、影响种子质量的因素1)培养基a、有利于孢子的发育和菌体的生长b、营养成分要尽可能接近发酵培养基c、原材料质量的控制：原材料质量波动引起种子质量不稳定。原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不同(微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量)。2)种龄a、种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。b、种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。c、原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。3)接种量接种量=一b、接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足；接种量过少，延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌。c、以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据，接种量的大小直接影响发酵周期。d、通常接种量，细菌1~5%,酵母菌5~10%,霉菌7~15%,有时20~25%。过大过小都不好，最终以实践定。4)温度：应控制在最适生长温度范围5)nH值：应控制在最话生长温度范围菌体生长所需的临界氧浓度。表的关系Ks—底物亲和常数，等于处限制性底物残留浓度S表征微生物对底物的亲和力，两者成反比Ks—底物亲和常数(也称半饱和速度常数，表示微生物对底物的亲和力，mol/m3;①当S较高时，(对数期满足S>>10Ks),此时，μ=μm`,此时S↓,μ↓北生长速率μ与营养物的关系为线性关系。(图中a段)北生长速率μ与营养物的关系为线性关系。(图中a段)(图中b段)(图中b段)但往往存在基质抑制现象，生长受到抑制(图中C段)51、产物形成动力学根据发酵时间过程分析，微生物生长与产物合成存在以下三种关系：①产物形成速率与细胞生长速率有密切联系，合成的产物通常是分解代谢的直接产物。②如葡萄糖厌氧发酵生成乙醇，好氧发酵生成中间代谢产物。③一般来说在这种类型的发酵生产中，控制好最佳生长条件就可获得产物合成的最适条件。(2)部分生长偶联型(3)非生长偶联型●产物形成速率只与细胞积累量有关，细胞生长时无产物，细胞停止生长后则有大量产物积累。这种产物●在这一类型的发酵中，起初是微生物的初级代谢和菌体生长，而没有产物的合成。此时，营养物质的消●当培养基中的营养物质消耗尽、微生物的生长停止以后，产物才开始通过中间代谢大量合成。●即产生该类产物的微生物，其生长期和生产期在时间上是完全分开的。多数次生代谢产物的发酵属这种类型，如各种抗生素和微生物毒素等物质的生产。●产物的形成只与发酵液中的菌体浓度有关，而微生物的生长速率对它无直接影响。对于这一类型发酵，只要能保证获得足够高浓度的生物量，就可以获得高速率的产物合成。所谓补料分批发酵，有时又称流加发酵。是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法。补料分批培养的优点：与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点为：①可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧的矛盾。②避免培养基积累有毒代谢物。适用范围：补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸及高聚物等的生产。54、连续发酵：所谓连续培养，是指以一定的速率向发酵液中添加新鲜培养基的同时，以相同的速率流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定不变，使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法。1)提供了一个微生物在恒定状态下高速生长的环境，可以有效地延长微生物的指数生长期；2)在恒定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物质浓度、产物浓度、pH值，以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速率。1)高效：减少分批培养中每次清洗、装料、灭菌、接种、放罐等的操作，从而减少了非生产时间，提高生产效率和设备的利用率。2)节约：节省了大量的人力、动力、水和蒸汽，且使水、电、汽的负荷均匀合理。3)自动化程度高：便于使用各种仪表实现自动化控制，降低劳动强度。4)可维持稳定的操作条件，使产率和产品质量比较稳定；1)长周期连续发酵易发生微生物菌种变异，导致菌种退化。2)开放的系统和长周期发酵，易造成染菌。长时间的连续发酵中对发酵设备和空气净化系统的无菌要求更高。不能保持长时间的无菌操作是导致连续发酵失败的主要原因。3)新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合，流出液中可能有未被利用的营养物质，降低了营养物质的利用率。对于某些原材料价格昂贵的产品，由于连续发酵对基质利用率较低，往往造成生产成本的增加。4)丝状菌体易附着在器壁上以及在发酵液中结团，造成连续操作的困难。d、连续发酵的模式：全混式、活塞流式(管道非均匀混合连续发酵)。1)微生物所处的环境是不断变化的。2)可进行少量多品种的发酵生产。3)发生杂菌污染能够很容易终止操作。4)当运转条件发生变化或需要生产新产品时。易改变处理对策。5)对原料组成要求较粗放。◆温度控制◆pH值控制(1)影响酶反应速度微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的。温度是保证酶活性的重要条件，是发酵正常进行、获得产品的重要保证。一定范围内，随温度升高反应加快。常用温度系数Q10表示：温度每升高10℃,反应速率增加2-3倍。酶的最适温度：在一定范围内，反应速度达到最大时的温度。超过最适温度，酶蛋白变性，酶的催化活力下降。(2)改变产物合成方向金色链霉菌同时产生金霉素和四环素。当温度低于300C时，合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。(3)影响微生物的代谢调控机制近年来发现温度对代谢有调节作用。在低温20℃,氨基酸合成途径的终产物对第一个酶的反馈抑制作用比在正常生长温度37℃的更大。故可考虑在抗生素发酵后期降低发酵温度，让蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早些，从而使发酵代谢转向(4)影响发酵液的理化性质温度还影响基质溶解度、发酵液的黏度、氧和CO2在发酵液中的溶解度等。●发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。●所谓发酵热就是发酵过程中产生的热量减去散失的热量即净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢生物热：微生物生长繁殖过程中的产热影响生物热的因素：(1)菌种(2)培养基(3)发酵时间(4)发酵类型搅拌热：机械搅拌造成的摩擦热蒸发热：被通气和蒸发水分带走的热量辐射热：发酵罐罐体向外辐射的热量显热：空气流动过程夹带着的热量)发酵一生物T搅拌一蒸发一显一辐射(1)pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻(2)pH值影响细胞膜的透性。pH值影响微生物细胞膜所带电荷的状态，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄。(3)pH值影响培养基某些成分的解离，从而影响微生物对这些物质的吸收和利用。◆pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。◆例如黑曲霉在pH2～3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。◆谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。(5)pH还会影响某些产物的稳定性。pH对微生物培养的不同阶段的影响不同1)基质代谢培养基中的营养物质的代谢，是引起pH变化的主要原因。引起pH原因原因C/N比过大，供氧不足，有机酸积累，引起pH下降碳源的种类：快速利用碳源，有机酸积累多，会引起pH下降；生理酸性物质被利用后pH会下降氮源的利用：培养基中的NH4+被利用后pH下降C/N比过小，氨基酸用作碳源，释放氨基氮，引起pH上升。尿素、氨水加入过多，尿素被分解成NH3+,pH上生理碱性物质被利用后pH会上升2)产物形成某些产物本身呈酸性，使发酵液pH下降。如有机酸类产物的产生使pH下降。某些产物本身呈碱性，使发酵液pH上升。如红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。3)菌体自溶发酵后期，由于菌体自溶，引起发酵液的pH上升。4)杂菌污染在发酵过程中，如果污染了产酸菌，会引起发酵液的pH异常下降。如果污染了噬菌体，由于菌体裂解，会引起发酵液的pH异常升高。1)调节好基础培养基的pH。首先要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的比例，使发酵过程中pH的变化在合适范围内。培养基配好后必须调节好初始pH。另外，培养基的灭菌前后pH可能会发生改变，需要特别注意。一般灭菌后在基础培养基中加入维持pH稳定的物质(如CaCO3)或具有缓冲能力的试剂(如磷酸缓冲液等)2)通过补料调节pH在补料与调pH没有矛盾时采用补料的方法调pH,效果比较明显。不仅可以调节pH,还可以根据发酵过程中碳氮消耗的需要及时补充碳氮源。通过调节补糖速率，调节空气流量来调节pH已比较成功地采用补料的方法来调节pH值，如氨基酸发酵采用流加尿素的方法，特别是次级代谢产物抗生素发酵，更常用此法。这种方法，既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的。3)加酸碱调pH:当补料与调pH发生矛盾时，加H2S04或NaOH来调节pH。4)采用联合控制pH值的方式：在实际生产中，可以采用多种pH控制的方式进行联合控制发酵液的pH。pH控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段考察对pH的要求。在pH控制中还要采用合适的调节方法。63、氧的溶解特性：被好氧性微生物吸收消耗，并直接参与生长代谢过程，可视为一种营养性底物；气体和溶液接触一定时间后，气体分子在气-液二相中的浓度，就会达到动态平衡，此时溶解到溶液中的气体分子数等于逸出溶液的气体分子数；随着温度升高，气体分子运动加快，使饱和浓度下降；气体在不同性质的溶液中的溶解度是不同的，通常浓度越高，溶解度越低；气相中氧浓度增加，溶液中溶氧浓度亦随之增加，必要时可向发酵液中通入纯氧以提高溶氧。(1)菌种和菌龄：旺盛时耗氧大，衰老耗氧小。同种类的微生物的需氧量不同，一般为25～100mmol02/(L·h),同一种微生物的需氧量，随菌龄和培养条件不同而异。菌体生长和形成代谢产物时的耗氧量也往往不同。(2)培养基的成分和浓度显著影响耗氧营养丰富，菌体生长快，耗氧大；浓度高，耗氧大；补料耗氧大。(3)发酵条件最适条件下发酵耗氧大；排除有毒代谢产物有利于菌体的摄氧量。

作为环境因素对微生物反应有直接影响；

被好氧性微生物吸收消耗，并直接参与生长代谢过程，可视为一种营养性底物。气体和溶液接触一定时间后，气体分子在气-液二相中的浓度，就会达到动态平衡，此时溶解到溶液中的气体分子数等于逸出溶液的气体分子数。若外界条件不变，气体在溶液中的浓度就不再随时间而变化，此浓度为饱和1)温度随着温度升高，气体分子运动加快，使饱和浓度下降。2)溶液的性质溶质种类：气体在不同性质的溶液中的溶解度是不同的溶质浓度：通常浓度越高，溶解度越低3)氧分压在系统总分压小于5个大气压的情况下，氧的溶解度与总压和其他气体的分压无关，只与氧分压成直线相关，C*=PO2/H气相中氧浓度增加，溶液中溶氧浓度亦随之增加，必要时可向发酵液中通入纯氧以提高溶氧。66、发酵液中氧的传递方程(双膜理论)氧气的溶解过程是一个由气相进入液相的过程，为实现这一过程，氧气需要跨过由气-液界面构成的屏障，在界面的一侧有气膜，另一侧为液膜，氧的溶解需要经过这两层膜才能实现。因此，根据这一模型建立起来的培养物处于充裕的通气情况下，N>r,C,会逐渐接近C*,氧传递速率渐小；而处于不充裕的通气情况下，N<r,C,下降趋于0,氧传递速率最大。K₁·α也称为“通气效率”,用来衡量发酵罐的通气状况，K,·α高，表示通气富裕，低则表示贫乏。(1)引起溶氧异常下降的原因污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗；菌体代谢发生异常，需氧要求增加。某些设备或工艺控制发生故障或变化。如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢；消泡剂加入过多。影响供氧的工艺操作，如停止搅拌、闷罐等。(2)引起溶氧异常升高的原因主要是耗氧出现改变，如菌体代谢异常，耗氧能力下降；污染烈性噬菌体。在发酵过程中，在已有设备和正常发酵条件下，每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己的规律。(1)发酵前期●菌体大量繁殖，摄氧率出现高峰，需氧量超过供氧量，使溶氧浓度明显下降，出现一个低峰。●过了生长阶段，需氧量有所减少，溶氧浓度经过一段时间的平稳或随之上升后，就开始形成产物，溶氧(2)发酵中后期●对于分批发酵，溶氧浓度变化比较小。菌体已进入静止期，呼吸强度变化不大。●若外界补料，溶氧的变化随补料时的菌龄、补入物质的种类和剂量不同而不同。如：补糖，则摄氧率增加，溶氧浓度下降。(3)发酵后期：由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升。一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升。实验室中，通过摇瓶机往复运动或偏心旋转运动供氧；中试规模和生产规模的培养装置采用通入无菌压缩空气控制菌体的比生长速率，使发酵液的溶氧浓度比临界溶氧浓度略高一点的水平，是控制最适溶氧的重要方法。最适菌体浓度的控制方法：通过控制基质浓度。如利用溶氧的变化自动控制补糖速率，间接控制供氧速率和pH值，实现菌体生长、溶氧和pH值三位一体的控制体系。70、控制溶氧的工艺手段(1)改变通气速率(增大通风量):增大KLa值。注意，过分增大通气速率会产生副作用，如泡沫生成、罐温(2)改变搅拌速度：转速较低时，增大搅拌速度对提高溶氧浓度有明显作用；当转速很高时，再增大搅拌速度起不到调节作用，反而打碎菌丝体，使菌体自溶并减少产量。(3)改变气体组成中的氧分压(4)改变罐压：提高C*。不是十分有效(5)改变发酵液的理化性质：如加消沫剂、补加无菌水、改变培养基的成分等血红蛋白、烃类碳氢化合物(煤油、石蜡等)、含氟碳化物。(1)影响推动力(c*-cr)的因素①温度：温度升高，氧的溶解度降低，可在不影响菌体生长和产物合成情况下，采取降低温度的措施。②电解质浓度：电解质浓度大，氧的溶解度低③溶剂：氧在有机溶剂中的溶解度比水中大。实际发酵过程中也可通过合理添加有机溶剂来降低水的极性从而增加氧的溶解度。④氧分压：增加分压可提高氧的溶解度。方法一是提高空气总压，方法二是提高氧分压。(2)影响K₁a的因素作用：打散气泡，增大气液接触面；形成涡流，延长气泡在液体中停留时间；形成湍流，减小气泡外的液膜阻力；使培养液中的成分分布均匀，细胞均匀悬浮，有利于营养物的吸收和代谢物的分散。但是搅拌转速并非越大越好，过度强烈的搅拌会有很多不利作用。发酵罐中装有多孔分布器和单孔分布器，在气流速度很低时，多孔分布器有较高的通气效率。但两者的区别随着气流速度的增加而逐渐减少。可能是低气流时多孔分布器可形成更大的传递面积，而当通气量增大时，单孔分布器能更大的增加发酵④发酵液的性质发酵液的性质特别是黏度、pH、极性、表面张力、离子浓度、菌体浓度等，都会影响气泡的大小、稳定表面活性剂(如消泡剂)使Kta下降；离子强度大使K₁a增加；菌体浓度增加使K₁a下降。发酵过程中添加糖、花生饼粉等营养物质、前体或无菌水、消泡剂等均可改变培养液的理化性质。⑤发酵罐的径高比(1)使反应器的装填系数减少；(2)造成大量逃液，导致产物的损失；(3)泡沫“顶罐”有可能使培养基从搅拌的轴封渗出，增加了染菌的机会。(4)影响了搅拌的正常进行，妨碍了微生物的呼吸。(5)由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期微生物随泡沫漂浮，使微生物生长的环境发生了变化，影响了微生物群体的效果，增加了微生物群体的不均一性。(6)使微生物提早自溶。(7)为了控制泡沫，需加入消泡剂，对产物的提取不利。①调整培养基中的成分，或改变某些物理化学参数，或者改变发酵工艺；②采用机械消泡或消泡剂消除泡沫的形成。利用机械强烈振动或压力的变化，促使泡沫破裂。有罐内消泡和罐外消泡两种方法。罐内消泡：靠罐内消泡浆转动打碎泡沫。罐外消泡：将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或利用离心力消除泡沫。该法优点：节省原料，不需引入外来物质(如消泡剂),减少染菌机会，不会增加下游工段的负担。缺点：消泡效果不理想，不能从根本上消除泡沫成因，仅可作为消泡的辅助方法。利用外界加入消泡剂，使泡沫破裂。常用消泡剂的种类染菌：发酵过程中感染了对正常发酵有影响的“杂菌”。所谓“杂菌”,是指在发酵培养中除了生产菌以77、发酵异常：菌体生长速度缓慢，过早衰老；耗糖速度慢；pH过高或过低；溶氧水平异常；尾气CO2含量变化异常；泡沫过多；发酵产物含量异常下跌；发酵液粘度异常增加等；菌体浓度过高或过低.。判断发酵是否染菌可从以下三方面进行：无菌试验；显微镜检查；生理生化指标的变化。1)种子培养期染菌由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中营养丰富，几乎没有抗生素(产物)或只有很少抗生素(产物)。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。2)发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。3)发酵中期染菌发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。4)发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，且破坏性较大，可以提前放罐。(1)大批发酵罐染菌：系统问题如发生在发酵前期，可能是种子带杂菌或连消设备引起的灭菌不彻底。如发生在中后期，且所污染的杂菌类型相同，则可能是空气过滤系统的问题，特别是总过滤器长期没有检查，受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底。(2)部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底。中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的。(3)个别发酵罐连续染菌和偶然染菌：不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、设备渗漏、分过滤器失效。(1)发酵早期染菌可能是从种子中带入，或由于培养基灭菌不彻底，或设备有“死角”,清洗不干净而染菌。(2)发酵中后期染菌可能是无菌空气或中间补料带入杂菌，或发酵设备渗漏，以及操作不合理逐渐侵入杂菌而造成的，一般不耐热性芽抱杆菌：可能是由于原料中原有的芽孢未能杀灭，或者死角或灭菌不彻底。球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的，或者设备渗漏。浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌):发酵罐的冷却管或夹套渗漏霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格，空气系统.噬菌体：很可能是空气系统，特别是在大风天气后。(1)设备渗漏设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖渗漏和其它设备渗漏等。加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。(3)种子带菌种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。(4)灭菌不彻底培养基灭菌不彻底：夹生、假压、泡沫过多、蒸汽压力波动。(5)技术管理不善技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，在发酵过程中，如果工艺操