动物胚胎移植的原理及操作程序（动物繁殖技术课件）

胚胎移植的原理胚胎移植

胚胎移植又称受精卵移植，俗称“借腹怀胎”，是指将受精卵或早期胚胎移植到受体动物输卵管或子宫角内，通过受体动物的妊娠而孕育出后代的技术。

胚胎移植

供体：经过超数排卵提供卵母细胞、受精卵或早期胚胎的动物。供体决定移植后代的遗传持性，在动物繁殖生产或育种工作中，供体通常为优良品种或优秀个体，或特定目的的动物种类或个体。胚胎移植

受体：接受不同来源胚胎移植的动物。受体动物只影响其体质发育，一般为生产性能一般的品种或个体。胚胎移植（图片来源于网络）

动物胚胎移植从19世纪后期的尝试距今已有100多年的历史。实验生物学阶段；家畜试验阶段；生产应用阶段。胚胎移植概况1978年我国首次牛胚胎移植成功1982年我国首次牛冷冻（常规）胚胎移植成功胚胎移植概况充分发挥优良母畜的繁殖潜力，加快品种改良和育种的进程加快特定品种扩群速度保护遗传资源诱发肉畜怀双胎，提高生产效率代替种畜引进满足防疫需要和克服不孕为发育生物学和其他胚胎生物技术提供研究手段胚胎移植的意义生理学基础母畜发情后的生殖生理变化特性早期胚胎发育与营养供应特性母体的妊娠识别与妊娠免疫学特性胚胎遗传特性的稳定性胚胎移植的原理

胚胎移植的价值原则：胚胎移植技术只适用于提高优良品种、优秀个体或具有特殊用途的母畜的繁殖效率，要考虑供体的种用价值或经济价值，通过胚胎移植迅速提高优良品种或优秀个体后代数量，提高群体生产性能和畜牧养殖效益。胚胎移植的原则移植前后所处环境的一致性分类学上的一致性：供体和受体的亲缘关系比较近，一般要求是同种。生理学上的一致性：保证供体和受体的发情同步化，一般要求相差不超过24h。解剖学上的一致性：移植胚胎的部位要与胚胎在供体动物的生理部位一致。胚胎移植的原则

（1）胚胎收集的期限：胚胎采集和移植的期限(胚胎的日龄)不能超过周期黄体的寿命.最迟要在周期黄体退化之前数日进行。因此，胚胎采集多在发情配种后的3~8d内进行，受体也在相同时间接受移植。胚胎移植的要求胚胎移植的要求

（2）胚胎的质量：移植的胚胎必须经过严格的质量鉴定，确认形态完整、发育正常，才能移植给同期发情受体。同时，在操作中须避免胚胎受到物理、化学、微生物等任何不良因素的影响而危及胚胎的存活和发育能力。胚胎移植的要求（3）对场地、设备和技术的要求：胚胎移植应配备能满足工作要求的无菌手术室、胚胎无菌操作室及其附属设施等基本条件，以及消毒灭菌、动物保定、胚胎操作或保存（培养）设备等基本设备。在胚胎移植前，须制订详细的操作程序，并严格按照程序操作。胚胎移植的操作程序供体选择

供体应该是良种母畜，最好是青壮年母畜，具备遗传优势，生产性能或经济价值高，谱系清楚，健康无病，营养良好，体质健壮。

经产母畜应在生殖机能恢复正常后方可作为供体。受体选择

受体母畜可选用非优良品种的个体，但要求体格健壮，营养状况良好，处于未孕状态，无生殖系统疾病。青年母畜和经产母畜均可作为胚胎移植受体。

在一般情况下，难以找到足够数量的自然发情母畜作受体，所以多采用对受体母畜进行同期发情处理。同期发情利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜发情周期的过程，使之在预定的时间内集中发情，以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法，也称同期发情。超数排卵在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵。供体的超数排卵（图片来源于网络）供体的发情鉴定与配种

结束超数排卵处理后，密切观察供体的发情征状，每天早、中、晚至少观察3次。为了获得较多发育正常的胚胎，应根据育种的需要，使用活率高、密度大的优质精液，输精次数增加到2~3次，两次输精间隔为8~10h。胚胎的采集

胚胎的采集:在超数排卵动物发情配种后一定时间把受精卵或早期胚胎从超排配种动物的生殖道中冲洗出来，并收集在器皿内。

冲洗时必须考虑排卵时间、配种时间，根据发育阶段确定胚胎的具体位置，才能得到较高的收集率。胚胎的采集

胚胎采集方法：

（1）胚胎手术法：适用于羊、猪和其他中小动物；

（2）胚胎非手术法：适用于牛、马等大动物；

（3）胚胎离体生殖道回收法：小鼠、大鼠等实验动物。123畜别排卵时间发育速度2细胞4细胞8细胞桑葚胚囊胚期进入子宫牛发情结束后10~12h1~1.52~2.52.5~34~67~83~3.5绵羊发情开始后24~30h1~1.51.5~22~2.53~45~73~4猪发情开始后35~45h1~1.52.5~33~44~55~62~2.5兔交配后10~11h11~1.51.5~22.53~43~4排卵时间和胚胎发育速度123胚胎的采集手术法：通过手术操作直接从雌性动物输卵管或子宫角回收受精卵或不同发育阶段早期胚胎。

优点：回收胚胎的数量较多

缺点：操作复杂，易引起输卵管粘连，严重造成不孕。123胚胎的采集从子宫角顶端冲洗输卵管：牛、羊、兔从输卵管伞处冲洗输卵管：猪、马从子宫角上端向基部冲洗（张忠成，2004.家畜繁殖学）123胚胎的采集非手术法：

指借助胚胎非手术回收器械，经阴道和子宫颈回收子宫角胚胎的方法。该方法简单易行，对生殖器官伤害程度小。123（图片来源于网络）胚胎的采集123胚胎的采集胚胎离体生殖道回收法：

先将动物处死，分离输卵管或子宫角，在离体条件下采集输卵管内受精卵和早期卵裂阶段胚胎，或子宫角内不同发育阶段胚胎。123（图片来源于网络）胚胎的采集子宫角分离输卵管分离胚胎检查和鉴定

胚胎的检查和鉴定：在体视显微镜下，从回收的冲胚液中检出胚胎，经过胚胎净化处理和形态质量鉴定，选出符合胚胎移植或科学研究要求的胚胎，并对其质量和活力进行评定（或等级分类）。胚胎检查胚胎的检查：

（1）非手术法：收集回收液，静置后用缓慢吸除上部液体，或者在滤网之上吸去上部冲胚液，将最后剩余的50毫升左右回收冲胚液、倒入大检卵杯中，用胚胎吸管吸去液体表面泡沫后在体视显微镜下检出胚胎。胚胎检查胚胎的检查：

（2）手术法：由于使用的冲胚液总液体量较少，可以直接将集卵杯或将其他容器收集的回收液倒入检卵杯，在体视显微镜下检出胚胎。

（3）离体生殖道法回收胚胎：直接将表面皿放置在镜下检出胚胎。胚胎鉴定胚胎的鉴定：

（1）形态学法：观察胚胎的形态、卵裂球的形态、卵裂球的大小与均匀度、色泽、细胞密度与透明带间隙以及细胞变性等情况，将胚胎进行质量分级。

根据胚胎的形态特征将胚胎分为A（优）、B（良）、C（中）、D（劣）四个等级，只有A和B级胚胎可以用于鲜胚保存和远距离运输。A级B

级C

级D

级胚胎分级胚胎鉴定（图片来源于网络）级别标准A级胚胎发育阶段与胚龄一致，形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明带适中，无游离的细胞和液泡（或很少），变性细胞比例<10%。B级胚胎发育阶段与胚龄基本一致，轮廓清晰，分裂球大小基本一致，色调和透明带及细胞密度良好，可见到一些游离的细胞和液泡，变性细胞比例10%~30%。C级胚胎发育阶段与胚龄不太一致，轮廓不清晰，色调变暗，结构较松散，游离的细胞和液泡较多，变性细胞比例30%~50%。D级有碎片的胚胎，细胞无组织结构，变性细胞占胚胎大部分，约75%。其中，A、B、C级胚胎为可用胚胎，D级为不可用胚胎。胚胎分级标准胚胎鉴定胚胎的鉴定：（2）荧光活体染色法：将二醋酸荧光素（FDA）加入待鉴定的胚胎中，培养3~6min，活胚胎显示荧光，死胚胎无荧光。（3）测定代谢活性法：即通过测定胚胎的代谢活性，鉴定胚胎的活力。其方法是将待鉴定的胚胎放入含有葡萄糖的培养液中，培养1h后，测定葡萄糖的消耗量，每培养1h消耗葡萄糖2~5μg以上者为活胚胎。胚胎的保存

胚胎的保存是指将胚胎在体内或体外正常发育温度下，暂时贮存起来而不使其活力丧失；或将其保存于低温或超低温情况下，使细胞处于新陈代谢和分裂速度减慢或停止，一旦恢复正常发育温度，又能继续发育。

目前，哺乳动物胚胎的保存方法有常温保存、低温保存和超低温冷冻保存。胚胎的保存（1）常温保存：将胚胎置于15~25℃的培养液中保存。这种温度下胚胎能保存24h，随时间的延长其活力下降，此方法只能做短暂的保存和运输。（2）低温保存：将胚胎置于0~10℃保存，此时，胚胎卵裂暂停，代谢减慢。这种方法使细胞的某些成分特别是酶处于不稳定状态，保存时间较短。但低温保存操作简便，设备简单，适宜野外应用。（3）超低温保存:将胚胎置于超低温环境中（-196℃）保存，其新陈代谢及发育暂时完全停止，但仍具有活力，一旦解冻、移植即可产生后代。其最大的优点是胚胎可以长期保存，而对其活力无影响。胚胎移植

手术法移植：在受体腹部做一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体的发育状况，根据胚胎的发育阶段，用注射器或移植管将胚胎注人排卵卵巢同侧子宫角上端或输卵管壶腹部内，然后迅速复位、缝合。胚胎移植

非手术法移植:将一只手伸入直肠，先检查黄体位于哪一侧及其发育情况然后握住子宫颈(如同直肠把握输精操作)，另一只手将装有发育正常胚胎的移植器经阴道、子宫颈、子宫体最后插入与黄体同侧的子宫角内，将胚胎注入。羊的胚胎移植供体羊的选择

供体羊：供体羊应具备遗传优势在育种上应选择生产性能高、经济价值大的母羊作为供体;供体羊应具备良好的繁殖能力，即没有遗传缺陷和其他生殖疾病，发情周期正常，发情症状明显;供体羊应营养良好，健康无病。年龄在2.5～6岁以内为宜。

受体羊的选择

受体羊：受体羊应选1~3岁的杂交一代或当地母羊，胎次为1~3胎，体格接近供体羊，体重30kg以上，具有正常的发发情周期，无繁殖障碍，无传染病，膘情中上等。羊的同期发情

同期发情：在同一天内用孕激素处理，同时放置阴道栓，作用9~12天，供体与受体的发情时间相差不超过一天。

可使用药物：孕激素或前列腺素。羊的同期发情阴道栓（图片来源于网络）供体羊的超数排卵

应用超排技术使羊每次排卵增加，常用的激素有FSH、LH、PMSG、hCG、PGF2α和孕激素等。

超排方案：FSH+PG法

CIDR+FSH+PG法

供体羊的配种（图片来源于网络）自然交配人工输精胚胎收集

（1）胚胎手术物品准备：在羊胚胎手术回收前，按照胚胎移植主要设备、器材与药品、试剂目录准备所需物品，尤其是羊胚胎回收手术器械和专用器材。胚胎收集（图片来源于网络）胚胎收集（2）手术动物准备：对胚胎手术回收母羊，应做好手术准备工作。包括术前饥饿、检查卵巢反应、手术部位剃毛、麻醉与保定、手术部位皮肤消毒和覆盖固定手术创巾。胚胎收集（图片来源于网络）胚胎收集

（3）手术人员准备：手术人员一般包括术者、手术助手、手术器械助手和胚胎回收专用器材助手，以上人员始终保持无菌状态。主要包括手臂皮肤清洗与消毒、穿戴无菌手术服、口罩、帽子和手术手套。胚胎收集

（4）手术操作：选择适宜的手术切口，用手术刀切开腹壁皮肤及皮下浅层组织，切开和分离各层组织时，避免切断或损伤较大血管，引出子宫角、输卵管和卵巢，回收胚胎，闭合切口。

胚胎回收：输卵管胚胎回收，子宫角胚胎回收。输卵管取胚1.选择合适外径的输卵管胚胎回收管，插入输卵管开口部内2厘米左右，用无齿手术镊子或血管夹固定，防止回收管从输卵管内滑脱。输卵管取胚2.将冲胚液进液针由子宫角前段向输卵管方向插入宫管接合部腔内，捏住子宫角前端针头插入的位置，防止冲胚液注入时倒流入子宫腔。输卵管取胚3.冲胚液进液针固定后，以右手持吸有冲胚液的注射器缓缓推动活塞，使冲胚液经宫管接合部注入输卵管，流经输卵管后再经输卵管胚胎回收管流入集卵容器。输卵管取胚4.一侧输卵管冲洗完毕后，除去器械，检查输卵管和卵巢有无出血，止血并用生理盐水冲洗后，采用类似的操作方法，冲洗另一侧输卵管。

羊的输卵管胚胎回收冲胚液用量为每侧10～15毫升。输卵管取胚

（图片来源于网络）子宫角取胚1.先在子宫角大弯上，避开可见血管，沿子宫角大弯向子宫角尖端方向插入胚胎回收针，确认回收针进入子宫腔后，用套有硅胶管的医用肠钳连同子宫角夹住胚胎回收针。子宫角取胚2.给子宫角注入冲胚液时，先用血管夹夹住宫管接合部靠近输卵管侧，并将冲胚液进液针由从宫管接合部子宫侧约2厘米处向宫管接合部方向插入，使针尖抵达宫管接合部，以左手拇指和食指轻轻固定子宫角前端针头插入的位置

、防止针头滑脱。子宫角取胚3.冲胚液进液针插入后，右手持吸有冲胚液的注射器缓缓推动活塞，冲胚液由子宫角注入宫管接合部管腔，由于宫管接合部靠近输卵管侧被血管夹阻塞，注入的冲胚液会在宫管接合部管腔内转向流入子宫角，并经胚胎回收针及其连接的硅胶管流入集卵容器。子宫角取胚4.一侧子宫角冲洗完毕后，除去器械，检查针孔是否有出血，如有出血、采用按压止血。然后以类似方法冲洗另一侧子宫角。

羊子宫角胚胎回收的冲胚液用量为每侧30～35毫升。子宫角取胚（图片来源于网络）胚胎检查

将盛有冲胚回收液的器皿置于无菌室静置10~20min，吸出上面的冲洗液，将器皿放在体视显微镜观察胚胎的形态和发育情况，收集外形整齐、大小一致、卵裂球分裂均匀、外膜完整的胚胎，吸入细管内备用。胚胎移植

（1）胚胎移植手术前动物和手术人员准备：胚胎移植手术前动物和手术人员准备与胚胎回收手术前动物准备和手术人员准备方法类似。胚胎移植

（2）胚胎移植器械及胚胎的装入：先给移植管内吸入一段胚胎保存液（液段C，该段液体可稍长），紧接着吸入一个气泡，之后连同胚胎吸入第二段保存液（液段B），再吸入第二个气泡，最后再吸入一段保存液（液段A），含胚胎段液体两侧各加一个气泡的方式可防止在移动移植管时丢失胚胎。胚胎移植

（图片来源于网络）A.液段3;B.

含胚胎液段2;

C.

液段1;

D.

移植管细段;

E.

移植管粗段;

F.

硅胶管;

Ｇ.玻璃珠;H.气泡2;

I.

气泡1.输卵管移植管装管胚胎移植

（3）胚胎手术移植操作步骤：腹壁切开，引出子宫角、输卵管和卵巢，子宫、卵巢暴露后，检查卵巢上黄体有无和黄体发育情况。胚胎移植手术时，应尽量减轻手术损伤。操作要轻巧，动作要稳妥可靠，避免过度牵拉生殖器官，禁止挤压卵巢。输卵管移植

输卵管移植时，引出黄体侧输卵管，找到输卵管输卵管喇叭口，将吸有胚胎的移植管由喇叭口插入输卵管2～3厘米，轻轻给硅胶管施压，将胚胎注入输卵管。子宫角移植

子宫角移植时，在黄体侧子宫角前1/3处避开血管把胚胎移植针插入子宫角内，摆动针头，确认针头在子宫腔时注入胚胎。胚胎移植

羊的手术法移植胚胎（图片来源于网络）术后护理

术后护理：为了防止术后继发感染，需连续注射抗生素3-7d，最好单独组群，避免应激，给予充足的营养，注意羊舍清洁卫生，并及时做好妊娠诊断，做好保胎防流工作。

妊娠诊断工作：可采取公羊试情法及超声波检查法。牛的非手术法胚胎移植供体牛的选择

供体牛：供体牛应选择健康的良种母牛，具有较高的育种价值、良好的生产性能、稳定的遗传性、旺盛的繁殖机能，而且超排效果较好，年龄选择最好在14月龄至10岁之间。受体牛的选择

受体牛：受体牛可选用非良种个体，要求体型较大、膘情中等，具有正常的发情周期，繁殖性能良好，无繁殖机能和传染疾病。供体牛的同步发情同步发情方法：缩短黄体期的前列腺法（PG法）、延长黄体期的孕酮法。供体牛的超数排卵牛有FSH+PG法和CIDA+FSH+PG法两种；发情后8－13天开始；常用的激素为FSH；注射方法一般是连续4d递减注射,每天2次,间隔12小时（半衰期短）；发情后8－12小时配种，间隔12小时再配种一次。供体牛的超数排卵（图片来源于网络）

配种操作的要求：选择系谱清晰，具有优良性状的种公牛，配种时对母牛外阴部清洗消毒，保持输精枪无菌，选择合适的输精枪和输精部位，输精次数不少于2次。

确定发情时12h后进行第一次人工输精，间隔12h进行第二次人工输精，每次输精的有效精子不少于3×107。供体牛的配种胚胎收集（1）动物准备：

牛的胚胎非手术回收前，需对动物禁食24小时以上，以减轻腹压和瘤胃的压力对非手术回收操作的影响。在冲胚前使其镇静，作尾椎硬膜外局部麻醉，以松弛子宫颈环肌。对外阴进行清洗、消毒，并吸除子宫颈粘液。

胚胎收集

（2）操作步骤：

1.插入子宫角胚胎回收管：术者通过直肠把握，将带有钢芯的子宫角胚胎回收管经过母牛阴道和子宫颈送入一侧子宫角大弯处。再将钢芯稍微向后抽出，再将胚胎回收管送到子宫角大弯前至小弯基部。

胚胎收集2.利用气囊固定子宫角胚胎回收管：利用注射器通过胚胎回收管后端的送气管向回收管前端的气囊慢慢送入空气，一般青年牛充气8～10毫升，经产牛12～15毫升，充气结束后，封闭送气管，抽出钢芯。

胚胎收集

3.子宫角胚胎冲洗：将胚胎回收管的冲胚液通过进液管缓慢向子宫内灌注，再回收冲胚液，反复冲洗，每次冲胚液注入量为30～50毫升，单侧子宫角冲胚液总量为300～500毫升。两侧冲完，向子宫内注入抗菌药物。

子宫角回收的液体较多，可以通过专用胚胎漏斗除去多余的冲卵液，在实体显微镜下进行检卵；

胚胎的质量评定：主要采用形态学方法，优质胚胎才能用于进行胚胎冷冻或移植。胚胎检查