微生物的生长与控制

第七章微生物的生长与控制主要内容:介绍微生物生长发育的规律及生长繁殖条件的控制；微生物生长的测定方法，同步培养和连续培养的方法。重点细菌的典型生长曲线及其在生产中的应用；同步培养和连续培养。5/8/20241微生物的生长与控制7.1微生物的分离纯化方法（1）稀释倒平皿法（2）平皿划线法（3）稀释涂布法（4）选择培养基分离法（5）单细胞挑取法（6）利用环境条件控制法5/8/20242微生物的生长与控制5/8/20243微生物的生长与控制5/8/20244微生物的生长与控制5/8/20245微生物的生长与控制7.2微生物生长的测定 细胞数量的测定 细胞生物量的测定细胞数量的测定（1）直接测定法（2）菌落计数法（3）比浊法（4）液体稀释培养计数法5/8/20246微生物的生长与控制在细胞数量测定的时候，样品往往先经处理，如打碎、稀释、浓缩等。液体稀释培养计数法适用于测定一个在混杂的微生物类群中不占优势，但却具有特殊生理功能的类群，如能分解纤维素、硝化、硫化、自生固氮等。它须通过该生理功能的表现来判断该微生物的存在和大概数量。5/8/20247微生物的生长与控制 纤维素分解菌的最大或然数法稀释度 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8试验管数5 5 5 5 5 5反应管数5 5 5 4 1 0

五次重复测数统计表 数量指标 近似值 数量指标 近似值10010-110-2 10010-110-20 1 0 0.18 5 0 02.31 0 0 0.20 5 10 3.33 1 0 1.1 5 4 0 134 1 0 1.7 5 41 17

纤维素分解菌数量=17×105个5/8/20248微生物的生长与控制（B）生物量的测定 （1）细胞干重法 （2）总氮量测定法 （3）DNA含量测定法 （4）代谢活性法5/8/20249微生物的生长与控制7.3微生物纯培养的群体生长规律微生物的生长曲线：以菌数的对数值或生长速度为纵坐标，以培养时间为横坐标作图所得曲线。菌数对数值培养时间对数期稳定期 衰亡期0适应期总菌数活菌数5/8/202410微生物的生长与控制（1）适应期又称延迟期，细菌的数目保持不变，甚至稍有减少。分裂迟缓，代谢活跃。适应期的长短与微生物的种类、菌龄、生长状态与接种前后的环境条件有关。在生产实践中，为了缩短适应期，常采用的措施有：选择生长繁殖快的菌种，加大接种量，选择菌种活力旺盛时期(对数期)接种，减小环境差。5/8/202411微生物的生长与控制（2）对数期菌数对数增长，活力旺盛，个体形态和生理特性比较稳定一致。细菌的代谢活性最强，繁殖一代需要的世代时间最短，而且稳定。此期适宜接种和基本代谢的研究。细胞数目 20 21 22 23 24～2n X2=X1.2n

lgX2=lgX1+n

lg2繁殖代数 n=3.3(lgX2-lgX1)5/8/202412微生物的生长与控制 t2-t1世代时间G= nt2:细菌数目为X1时的培养时间t1:细菌数目为X2时的培养时间例:某菌正处于对数期，在60分钟时取样，测菌数为100/ml，在159分钟时取样，测菌数为10000/ml，求它的世代时间。 159–60G= 3.3(lg10000-lg100)=99÷3.3(4-2)=15分钟5/8/202413微生物的生长与控制（3）稳定期细菌活力下降，世代时间延长，部分细菌停止分裂繁殖，新细菌的增加和老细菌的死亡数量趋向平衡，活菌总数保持相对的稳定，培养液中活菌数达到最大值。这是因为营养物质的消耗；代谢产物的积累；环境温度、pH值、氧化还原电位改变，不利于微生物的生长造成的。稳定期的细菌开始形成储藏物质和积累代谢产物，开始形成芽胞，它是积累代谢产物的重要阶段，适宜收获菌体。5/8/202414微生物的生长与控制（4）衰亡期死亡菌数急剧增加，新增菌数较少，活菌数构成的生长曲线开始下滑，总菌数较稳定。此期的菌形态多产生畸形，大小不一，生理特性也多出现混乱现象。这是因为营养、代谢产物、环境等生存条件进一步恶化造成的。衰亡期适宜收获代谢产物和芽胞，也是生产上选种和育种的好时期。5/8/202415微生物的生长与控制二次生长在培养液中同时存在两种均能为微生物利用的主要营养物质时，微生物将首先利用其中较易利用的营养物质开始生长，进入稳定期后微生物经短暂的适应后将利用第二营养物质再次开始新的对数期增长并进入稳定期，从而表现为二阶段式的双峰生长曲线。5/8/202416微生物的生长与控制葡萄糖耗尽乳糖耗尽活菌数

时间 大肠杆菌的二次生长曲线5/8/202417微生物的生长与控制7.4连续培养当微生物培养物进入对数期或稳定期后，连续供给其新鲜培养液，同时不断地移出多余的培养体和代谢产物，从而使微生物始终处于较适宜的条件下生长繁殖，这种方式叫连续培养。连续培养因性质和目的不同分为：恒浊连续培养 恒化连续培养5/8/202418微生物的生长与控制（1）恒浊连续培养通过光电装置自动测定并调节加入培养液的流速来保持培养物浊度恒定的培养方法。它可以实现微生物的高速生长，并提供大量形态与生理特征一致的细胞。在发酵工业中，为了获得大量菌体及与菌体平行的代谢产物时，往往采用此法。5/8/202419微生物的生长与控制（2）恒化连续培养控制加入培养液的流速恒定，使培养室中营养物质的浓度保持恒定，从而保持微生物恒定的生长速率。一般找一种微生物必需的营养物质作为限制因子，通过控制限制因子的流速恒定即可。常用的限制因子有氮源如氨基酸、氨，碳源如葡萄糖、麦芽糖及生长素，无机盐等。恒化连续培养多用于微生物的科研与教学中。5/8/202420微生物的生长与控制恒浊连续培养恒化连续培养5/8/202421微生物的生长与控制7.5环境条件对微生物生长的影响环境条件影响着微生物的生长繁殖和代谢。环境条件的改变可以对微生物的生长产生促进、抑制作用或导致微生物的死亡、变异等。环境条件也直接影响着微生物代谢产物的改变。反过来微生物可以适应环境或抵抗环境的改变，对环境产生反作用。影响微生物生长的环境条件主要有物理、化学和生物因素，常包括：温度、水分、pH、O2、Eh、辐射和化学药剂等。5/8/202422微生物的生长与控制（1）温度温度对微生物生长和代谢有很大影响。不同微生物生长的温度范围在-12～100oC根据微生物生长的温度范围不同，可将微生物分为： 低温型微生物 高温型微生物 中温型微生物5/8/202423微生物的生长与控制oC微生物的生长温度类型5/8/202424微生物的生长与控制致死温度超过微生物的最高生长温度可引起微生物的死亡，在其它条件固定时，超过微生物最高生长温度越多，杀死微生物的时间越短。在一定条件下和一定时间内(通常为10分钟内)，杀死微生物的最低温度称为致死温度。如白喉杆菌10分钟内的致死温度为56oC，大肠杆菌10分钟内的致死温度为60oC。在致死温度下，杀死微生物所需的最短时间称为致死时间。5/8/202425微生物的生长与控制巴氏消毒法引起环境中大多数污染菌死亡的温度都在60oC以内，所以为了不影响食品的营养和风味，多采用在较低的致死温度下，稍长于致死时间的消毒方法，如63～66oC

30分钟或70oC15分钟。高温灭菌法湿热蒸气灭菌：121oC，30分钟。干热灭菌：160～170oC，1～2小时。5/8/202426微生物的生长与控制对一种微生物来说：超过它的最高生长温度可杀死它采用它的最适生长温度可培养它低于它的最低生长温度可保存它5/8/202427微生物的生长与控制（2）氢离子浓度即pH值。同样pH值可影响微生物的生长和改变微生物的代谢产物。pH值对微生物的影响主要作用于：影响细胞膜电荷和养料吸收影响代谢过程中酶的活性改变环境中养料的可给性和有害物质的毒性5/8/202428微生物的生长与控制环境中微生物可生存的pH值范围在1～11之间，具体到每种微生物而言： 细菌最适pH值在6.5～7.5之间。 放线菌最适pH值在7.5～8之间。 酵母菌、霉菌适合于pH5～6的酸性环境。因为微生物在生长过程中的代谢产物可以改变环境中的pH值，所以在培养微生物时，培养基不但要调节pH值，还要选择适合pH值的缓冲。如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。 5/8/202429微生物的生长与控制（3）通气条件对微生物生长的影响好氧性微生物，在培养时必须保证通气条件良好。实验室中通常采用震荡培养或摇瓶培养，发酵生产中多采用通入无菌空气和搅拌等方法供氧。厌氧性微生物，在培养时必须隔绝空气，通常采取的措施有：用焦性没食子酸吸收氧气、抽真空、加盖覆物以及密闭容器等，或采用厌氧培养箱、发酵罐等。5/8/202430微生物的生长与控制（4）氧化还原电位(Eh)对微生物的影响它是表示环境中氧化剂和还原剂相对强弱的一个物理量，是可以用伏特计来测量的电位值。环境中氧分压越高、pH值越低、氧化性物质越多，Eh也越高；反之则Eh越低。以pH=7时的电极为0值，完全富氧的环境Eh可达最高为+0.82伏，完全富氢的环境Eh可达最低为-0.42伏。5/8/202431微生物的生长与控制Eh对微生物的影响是：主要影响微生物细胞内各种酶的活性，同时也影响细胞内的呼吸作用。好氧性微生物细胞内的氧化酶系统要求有较高的Eh值，低了则不能催化；厌氧性微生物细胞内的一些脱氢酶系，只能在Eh值较低的环境中活动。一般好氧性微生物在Eh+0.1以上可生长,0.3～0.4为最适;厌氧性微生物只能在+0.1以下生长;兼厌氧性微生物在+0.1以上进行有氧呼吸,在+0.1以下进行发酵作用。5/8/202432微生物的生长与控制厌氧性微生物由于体内的酶系统不能适应较高的氧化还原电位，所以一般在有氧的条件下不能生长，但是，如果在培养基中加入一定量的还原物质，如胱氨酸、半胱氨酸或巯基醋酸钠等，同样接触空气，有些厌氧性微生物就能生长。5/8/202433微生物的生长与控制（5）水分和渗透压对微生物的影响水是微生物必需的营养物质，但水能不能被利用，还需看溶液中水的可给性。水活度：指相同温度下，密闭容器中，溶液的蒸气压比上纯水的蒸气压。 Ps Aw= Pw自然界中，微生物能生长的水活度范围在0.7～0.99之间,一般来说细菌在0.9～1.0,酵母菌和霉菌在0.9～0.95之间。5/8/202434微生物的生长与控制渗透压：低渗溶液一般对菌体影响不大，但对原生质体可造成破坏；高渗溶液则能抑制大多数微生物的生]长（耐渗性微生物除外）。所以通常用盐或糖加工蔬菜、肉类和水果等来保存它们。干燥缺水的环境会抑制微生物的生长，甚至导致微生物的死亡，一般微生物的营养体对干燥敏感，但芽胞或霉菌、放线菌的孢子较耐干燥，所以通常用沙土管法来保存有孢子的菌种，真空冻干法可保存细菌、病毒、立克次氏体等，干燥法还可保存食品。5/8/202435微生物的生长与控制（6）辐射对微生物生长的影响辐射是能量以电磁波的方式通过空间传递的一种形式，它包括无线电波、红外线、可见光、紫外线、X射线、r射线、α射线和β射线等。红外线：是光合细菌的能源。可见光：是蓝细菌、藻类的能源。紫外线：有杀菌和诱变作用。5/8/202436微生物的生长与控制紫外杀菌杀菌能力最强的波段在265-266nm之间，这是核酸的最大吸收峰波段。紫外线可作用于DNA，导致相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，引起微生物变异或死亡；它也可激发空气中的氧变为臭氧，放出氧化能力很强的新生态氧产生杀菌作用。但紫外线的穿透力差，因此只能用于空气及物质表面的消毒。光复活作用：经紫外线杀死的微生物在可见光作用下，可以激活DNA修复酶，修复损伤，从而使微生物复活的作用。有些酶也有暗修复能力。5/8/202437微生物的生长与控制电离辐射：包括X射线、r射线、α射线和β射线等。电离辐射的波长短、能量大，能使被照射的物质分子发生电离作用产生游离基，游离基能与细胞内的大分子化合物作用使之变性失活，导致细胞变异或死亡。一般低剂量的电离辐射（如500伦琴），可以促进微生物的生长，或诱发变异，高剂量（如10万伦琴）则可引起微生物的死亡。r射线是由60Co发出的高新辐射，电离作用和穿透力都很强，常用于食品灭菌。5/8/202438微生物的生长与控制（7）超声波对微生物的影响超声波是震动频率超过2万Hz的声波。它能通过强烈的震动使细胞破裂，细胞内含物外泄而死亡。超声波的破碎效果与处理功率、频率、次数、时间、微生物类型极其生理状态等因素有关。超声波处理一般应在冰浴上进行并作短时间的多次处理。5/8/202439微生物的生长与控制（8）化学药剂对微生物的影响对微生物有影响的化学药剂主要包括抑菌剂和杀菌剂。抑菌剂：干扰新细胞物质合成和微生物生长繁殖。杀菌剂：破坏微生物的细胞结构或代谢机能。一般来说，许多化学药剂在高浓度下杀菌，低浓度下抑菌，极低浓度下则失去作用或反而表现为生长刺激作用。所以它们对微生物的作用取决于药剂的浓度、作用时间和不同微生物对药剂的敏感性。5/8/202440微生物的生长与控制化学药剂对微生物的影响主要表现为： 破坏细胞结构如：苯酚 干扰细胞的能量代谢如：重金属 干扰细胞的物质合成如：磺胺优良的化学药剂应具备以下性质：作用迅速，抑菌或杀菌范围广，较强的穿透力，易与水混溶，不易受其它物质干扰，不受光、热及其它气候条件的影响，不对应用对象产生有害作用，经济、安全、易生产运输等。5/8/202441微生物的生长与控制有机化学药剂（1）酚及其衍生物主要有苯酚、甲酚、间苯二酚、六氯苯酚等。其作用主要是损坏细胞膜，使蛋白变性。苯酚：2～5%来苏尔(煤酚皂)：3～5%酚系数：待测药剂在规定时间内(10分钟)杀死标准供试菌(金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌)的最大稀释倍数与在相同条件下苯酚的最大稀释倍数的比值。5/8/202442微生物的生长与控制（2）醇类破坏膜结构和使蛋白变性。70-75%为最佳浓度。（3）醛类可使蛋白变性。常用福尔马林是37～40%的甲醛溶液，戊二醛常用2%浓度。（4）酸类能抑制微生物的酶及代谢活性。常用的有苯甲酸、山梨酸、水杨酸、丙酸钙。5/8/202443微生物的生长与控制（5）新型气态有机化学杀菌剂氧化乙烯 CH2—CH2

O它可使微生物蛋白质变性。通常用于空气及器械表面的消毒剂。氧化丙烯 CH3—CH2—CH2

O丙酸内脂 CH2—CH2

O——C=O5/8/202444微生物的生长与控制无机化学药剂主要包括卤化物、重金属、氧化剂、无机酸和碱等。（1）卤化物常用的是碘