《非洲马瘟诊断技术gbt+21675-2022》详细解读

《非洲马瘟诊断技术gb/t21675-2022》详细解读contents目录1范围2规范性引用文件3术语和定义4缩略语5生物安全措施6临床诊断contents目录7样品采集与处理8实验室诊断9综合判定附录A(规范性)病毒分离相关溶液的配制附录B(资料性)核酸检测用引物、探针序列信息contents目录附录C(规范性)核酸检测相关溶液的配制附录D(规范性)酶联免疫吸附试验相关溶液的配制011范围本标准规定了非洲马瘟的诊断技术，适用于马属动物的非洲马瘟诊断。适用于疑似感染非洲马瘟病毒的马属动物的实验室诊断。适用于对非洲马瘟疫情的监测和防控。1.1适用对象0102041.2诊断方法本标准包括了非洲马瘟的病毒学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断等多种方法。病毒学诊断主要通过病毒分离、鉴定和动物接种试验等方法进行。血清学诊断主要通过检测血清中的非洲马瘟病毒特异性抗体进行。分子生物学诊断主要通过PCR等核酸扩增技术进行病毒核酸检测。03本标准详细规定了非洲马瘟的诊断标准，包括疑似病例、确诊病例和疫情判定的标准。疑似病例主要根据临床症状和流行病学史进行判断。确诊病例需满足实验室检测结果阳性，并结合临床症状和流行病学史进行综合判断。疫情判定主要根据疫情发生地区、病例数量、传播速度等因素进行综合评估。010203041.3诊断标准022规范性引用文件0102文件范围及目的引用本文件的目的是为了统一和规范非洲马瘟的诊断方法，提高诊断的准确性和可靠性，为非洲马瘟的防控提供技术支撑。本文件规定了非洲马瘟诊断技术的术语和定义、诊断原则、诊断方法、判定规则和诊断试剂的制备及检验要求。GB/TXXXX-XXXX动物疫病诊断术语和定义01引用标准及文件GB/TXXXX-XXXX动物疫病诊断样品采集、保存及运输技术规范02GB/TXXXX-XXXX动物疫病实验室检验通则03非洲马瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法（附录A）04非洲马瘟病毒抗体ELISA检测方法（附录B）05010203非洲马瘟由非洲马瘟病毒引起的马属动物的一种急性或亚急性虫媒病毒病，以发热、皮下水肿和病毒血症为特征，严重时伴有组织和器官出血，马属动物中马最易感，病死率可高达95%。实时荧光RT-PCR一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。ELISA酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。术语和定义033术语和定义非洲马瘟是一种由非洲马瘟病毒引起的马属动物的急性或亚急性虫媒病毒病，主要通过库蠓属等吸血昆虫叮咬传播，临床症状主要为发热、皮下水肿和病毒血症，严重时伴有组织和器官出血，马属动物中马最易感，病死率可高达95%，骡驴次之。非洲马瘟虫媒病毒为一群节肢动物媒介病毒，分别归类于披膜病毒科，黄病毒科，布尼亚病毒科和沙粒病毒科的病毒，归类于披膜病毒科的主要有乙型脑炎病毒、登革病毒和森林脑炎病毒。虫媒病毒实时荧光RT-PCR方法实时荧光RT-PCR方法是一种核酸检测技术，它通过实时检测PCR扩增过程中产生的荧光信号来定量或定性地检测目标核酸。这种方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已广泛应用于病毒、细菌等病原体的检测。血清学检测方法是一类基于抗原抗体反应的检测方法，通过检测血清中的特异性抗体来诊断疾病。常用的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合试验（CF）等。这些方法在非洲马瘟的诊断中也具有一定的应用价值。血清学检测方法044缩略语英文全称Africanhorsesickness中文全称非洲马瘟解释非洲马瘟是一种由非洲马瘟病毒引起的马属动物的急性或亚急性传染病。4.1AHS英文全称Africanhorsesicknessvirus中文全称非洲马瘟病毒解释非洲马瘟病毒是引起非洲马瘟的病原体，属于呼肠孤病毒科环状病毒属。4.2AHSV英文全称GuoBiao/TuiJian中文全称国家标准/推荐解释GB/T是指推荐性国家标准，"T"在此读"推"。推荐性国标是指生产、交换、使用等方面，通过经济手段或市场调节，而自愿采用的国家标准。4.3GB/T4.4诊断技术解释诊断技术是指用于检测和确认非洲马瘟病例的各种方法和手段，包括临床诊断、病理学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断等。这些技术在《非洲马瘟诊断技术GB/T21675-2022》标准中有详细的规定和说明。055生物安全措施

5.1实验室生物安全实验室应建立严格的生物安全管理制度，确保实验人员遵守生物安全规定，防止非洲马瘟病毒的传播和扩散。实验室应配备符合生物安全要求的设施和设备，如生物安全柜、高压灭菌器等，以确保实验操作的安全性。实验人员应接受生物安全培训，了解非洲马瘟病毒的危害和传播途径，掌握正确的实验操作方法和个人防护措施。03样本接收实验室应具备相应的生物安全防护措施，确保样本的安全处理和检测。01样本采集应使用符合生物安全要求的采样器具，避免交叉污染和病毒扩散。02样本运输应使用符合生物安全要求的包装和运输方式，确保样本在运输过程中不发生泄漏和污染。5.2样本采集与运输安全相关部门应建立非洲马瘟疫情监测体系，及时掌握疫情动态和流行趋势。发现非洲马瘟疑似病例时，应按照法律法规的规定及时报告，并采取紧急控制和扑灭等强制性措施。疫情监测和报告应遵循保密原则，确保疫情信息不泄露，维护社会稳定和公共卫生安全。5.3疫情监测与报告066临床诊断年龄与性别不同年龄和性别的马属动物均可感染，但幼龄动物通常更易感。地区与季节非洲马瘟主要在非洲大陆流行，但也可传播到其他地区。本病一年四季均可发生，但通常在温暖、潮湿的季节更为严重。马属动物非洲马瘟主要感染马、驴、骡等马属动物，其中马最易感，骡、驴次之。6.1易感动物病马出现高热、呼吸困难、咳嗽、流泡沫样鼻液等症状。严重病例可见前腿分开站立，头颈伸直，鼻孔扩张，呼吸极度困难。肺型症状病初发热，退热前出现特征性水肿，常见于头部、颈部和舌部。晚期可见结膜和舌腹侧出血点，最终因心力衰竭而死亡。心型症状兼具肺型和心型的症状，病情更为严重，死亡率更高。混合型症状6.2临床症状123主要病变在肺部，可见肺充血、水肿和出血。气管和支气管内有大量黄色浆液和泡沫，肺门淋巴结肿大。肺型病理变化主要病变在心脏，可见心内膜和心包膜有出血点和出血淤斑，心肌变性和坏死。水肿部位皮下组织胶样浸润。心型病理变化兼具肺型和心型的病理变化，病变更为广泛和严重。混合型病理变化6.3病理变化根据临床症状和病理变化可做出初步诊断，但确诊需要进行实验室检测。实验室检测包括病毒分离、血清学检测和分子生物学检测等方法，可检测病毒抗原、抗体或核酸等指标。临床判定应结合流行病学、临床症状、病理变化和实验室检测结果进行综合分析和判断。6.4临床判定077样品采集与处理疑似感染非洲马瘟病毒的马属动物，在出现发热、皮下水肿等临床症状时采集样品。采样时间全血、血清、血浆、脾脏、淋巴结等组织样品。采样种类无菌操作采集血液样品，组织样品应采集病变明显的部位，避免污染。采样方法样品应低温保存并尽快送检，运输过程中应避免反复冻融和污染。样品保存与运输7.1样品采集血液样品处理组织样品处理核酸提取与检测病毒分离与鉴定7.2样品处理全血样品经离心分离血清或血浆，用于病毒分离、核酸检测或抗体检测。采用适宜的核酸提取方法提取样品中的病毒RNA，进行反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等核酸检测。组织样品应研磨成匀浆，经离心处理取上清液，用于病毒分离、核酸检测或病理学检查。将处理后的样品接种于易感细胞，观察细胞病变效应（CPE），并采用中和试验等方法鉴定病毒。088实验室诊断

8.1病原分离和鉴定采样与处理从疑似感染非洲马瘟的马属动物身上采集血液、脾脏、肺脏等组织样本，进行无菌处理。病毒分离将处理后的样本接种于易感细胞系，如马胎肾细胞、马肺细胞等，观察细胞病变效应（CPE），并通过传代培养分离病毒。病毒鉴定采用电子显微镜观察病毒粒子形态，结合血清学试验和分子生物学方法进行病毒鉴定。利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，将病毒RNA反转录为cDNA，再通过PCR扩增特定基因片段，从而检测非洲马瘟病毒。原理根据非洲马瘟病毒基因组序列，设计特异性引物，用于扩增病毒核酸片段。引物设计提取样本RNA，进行反转录和PCR扩增，观察扩增结果并进行分析。操作步骤8.2RT-PCR方法原理使用通用型非洲马瘟病毒核酸检测试剂盒和实时荧光定量PCR仪。试剂与设备操作步骤按照试剂盒说明书进行操作，包括样本处理、核酸提取、PCR扩增和结果分析等步骤。采用实时荧光定量PCR技术，通过特异性探针和荧光染料实时监测PCR扩增过程，实现非洲马瘟病毒的快速、灵敏检测。8.3通用型Real-timeRT-PCR方法针对非洲马瘟病毒不同血清型设计特异性引物和探针，通过实时荧光定量PCR技术实现型特异性检测。原理适用于非洲马瘟病毒不同血清型的鉴别诊断和流行病学调查。应用场景与通用型Real-timeRT-PCR方法类似，但需使用型特异性引物和探针。操作步骤8.4型特异性Real-timeRT-PCR方法123采用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术，利用抗原抗体特异性结合反应检测样本中的非洲马瘟病毒抗体。原理使用间接ELISA抗体检测试剂盒和酶标仪等设备。试剂与设备按照试剂盒说明书进行操作，包括样本处理、抗原包被、抗体孵育、酶标二抗孵育、底物显色和结果判定等步骤。操作步骤8.5间接ELISA抗体检测方法03操作步骤与间接ELISA方法类似，但需设置标准品对照和计算阻断率等指标。01原理采用阻断ELISA技术，通过比较样本与标准品对特异性抗原的结合能力来检测非洲马瘟病毒抗体水平。02应用场景适用于大规模血清学调查和疫苗免疫效果评估等领域。8.6阻断ELISA抗体检测方法099综合判定123非洲马瘟的判定应结合流行病学、临床症状、病理变化和实验室检测结果进行综合分析。在疫情监测和排查中，对符合非洲马瘟特征的，应判定为疑似病例。对疑似病例，必须按规定采集病料送指定实验室进行病原学检测，结果阳性的，可判定为确诊病例。9.1判定原则符合非洲马瘟流行病学特点，具有典型临床症状和病理变化的马属动物。疑似病例经实验室病原学检测，结果为阳性者。疑似病例确诊病例9.2判定标准发现疑似病例后，应立即向当地畜牧兽医主管部门报告，并按照相关规定采取隔离、消毒等控制措施。当地畜牧兽医主管部门接到报告后，应迅速组织专家进行现场诊断和流行病学调查，并采集病料送指定实验室进行病原学检测。根据实验室检测结果和现场诊断情况，综合判定是否为非洲马瘟疫情，并按照相关规定采取相应措施。9.3判定流程10附录A(规范性)病毒分离相关溶液的配制试剂和溶剂选择选择高纯度的化学试剂和符合要求的溶剂，以确保溶液的质量和稳定性。配制器具准备准备干净的玻璃器皿、量筒、移液管等配制工具，并进行适当的预处理和灭菌。实验室环境和设备要求确保实验室具备适当的生物安全级别，使用经过认证的洁净工作台和灭菌设备。溶液配制的准备工作按照一定比例将化学试剂A和溶剂混合，加热搅拌至完全溶解，过滤除菌后备用。溶液A的配制溶液B的配制溶液C的配制将化学试剂B加入适量的溶剂中，充分溶解后调节pH值至所需范围，过滤除菌。将化学试剂C和D按一定比例混合，加入适量的溶剂中，加热搅拌至完全溶解，过滤除菌。030201病毒分离相关溶液的配制步骤对配制好的溶液进行质量检测，包括浓度、pH值、无菌性等指标。溶液质量检查将检测合格的溶液分装至适当的容器中，标明名称、浓度、配制日期等信息，并储存于符合要求的温度和环境条件下。溶液储存条件根据溶液的性质和储存条件确定溶液的有效期，并在使用前检查溶液的外观和性状，如有异常应停止使用。同时，使用时应遵循实验室安全规范和操作规程。溶液有效期和使用注意事项溶液配制后的处理和储存11附录B(资料性)核酸检测用引物、探针序列信息03引物使用方法详细说明引物的使用浓度、反应条件等，确保实验操作的规范性和一致性。01引物设计原则根据非洲马瘟病毒的基因组特点，设计特异性引物，确保核酸检测的准确性和灵敏度。02引物种类与序列提供多种引物序列，包括正向引物和反向引物，用于扩增病毒核酸片段。引物序列根据非洲马瘟病毒的特异性序列，设计探针，确保与病毒核酸的特异性结合。探针设计原则提供多种探针序列，包括荧光探针、淬灭探针等，用于实时荧光定量PCR等检测方法。探针种类与序列详细说明探针的标记方法、使用浓度、反应条件等，确保实验结果的准确性和可靠性。探针使用方法探针序列12附录C(规范性)核酸检测相关溶液的配制实验室环境和设备要求确保实验室环境干净、整洁，使用符合标准的生物安全柜和移液器等设备。试剂和耗材准备准备所需试剂，如核酸提取试剂、PCR扩增试剂等，以及相应的耗材，如离心管、吸头等。溶液配制的准备工作按照一定比例混合裂解液成分，确保充分溶解，用于裂解病毒颗粒并释放核酸。裂解液的配制配制适当浓度的洗涤液，用于洗涤核酸提取过程中的杂质和抑制剂。洗涤液的配制核酸提取溶液的配制PCR扩增溶液的配制引物和探针的稀释将引物和探针稀释至适当浓度，以便在PCR扩增过程中使用。PCR反应液的配制按照一定比例