公开课用土壤中分解尿素的细菌的分离与计数省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与记数1/251、了解尿素

尿素是一个由C、H、O、N组成有机化合物，分子式为CO(NH2)2，它是动物体内蛋白质代谢产物，在肝脏中合成后，随尿液排出。

1828年，德国化学家维勒成功经过无机物化学反应合成了尿素。今后，尿素走向工业化并广泛用于农业生产。课题背景2/25课题背景尿素不能直接被农作物吸收。土壤中一些细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、尿素利用3、细菌能分解尿素原因直接原因：能合成脲酶（分解尿素酶）根本原因：含有合成脲酶相关基因3/25两个主要目标：（1）从土壤中分离出能够分解尿素细菌；（2）统计每克土壤样品中终究含有多少这么细菌。课题目标4/25

科学实例：寻找耐高温DNA聚合酶说明：寻找目标菌种时要依据它对生存环境要求，到对应环境中去寻找。筛选原因：因为热泉高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热Taq细菌保留下来。DNA多聚酶链式反应(PCR)是一个在体外将少许DNA大量复制技术，此项技术要求使用耐高温（930C）DNA聚合酶。1966年，布鲁克在美国黄石国家公园一个热泉中发觉了耐热Taq细菌，并分离到耐高温DNA聚合酶。一、筛选菌株耐高温酶耐高温生物体耐高温环境（热泉、火山口）寻找寻找5/252、方法：

试验室怎样筛选菌种人为提供有利于目标菌株生长条件(包含营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其它微生物生长。1、原理：使用选择培养基：允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其它种类微生物生长培养基。依据原理，培养基应怎样配制，才能将分解尿素细菌分离出来？利用以尿素为唯一氮源培养基进行筛选6/251、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物数量。㈡.统计菌株数目：统计每克土壤样品中终究含有多少细菌不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌计数；个体小细菌在显微镜下难以观察；缺点7/252.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成一个菌落是由一个单细胞繁殖而成，即一个菌落代表原先一个单细胞。平板划线法得到菌落稀释涂布平板法得到菌落8/25使用稀释涂布平板法接种，在稀释度足够高培养基中，细菌比较分散，轻易形成单个菌落。

一个菌落起源于样品稀释液中一个活菌

间接计数法（活菌计数法）统计菌落数目每克样品中菌株数=（C÷V)×MC:某一稀释度下平板上生长平均菌落数；V:所用稀释液体积；M:稀释倍数。9/25

注意事项①为了确保结果准确，普通选择菌落数在30——300平板上进行计数。稀释度是不是越高越好？假如稀释度过高，菌落数少于30，计算结果偏低，误差大；假如稀释度过低，菌落数超出300，统计和计算结果都会有误差；②恰当稀释度是成功统计菌落数目标关键。10/25

两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数。从对应稀释倍数为106培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学作法正确吗？假如有问题，错在哪？

甲：没有重复试验（最少涂布3个平板）

乙：其中一个平板计数结果与其它两个相差太大，操作过程可能出现了错误。资料分析：11/25注意事项③为增强试验说服力与准确性，设计试验时，需要涂布最少三个平板作为重复组。④分析试验结果时，要考虑重复组结果是否靠近，假如相差太大，意味着操作有误，需重新试验。⑤为预防培养时间不足造成菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数，选取菌落数稳定时统计作为结果。⑥统计菌落数往往比活菌实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成还是一个菌落12/25计数法直接计数法、平板计数法、比浊法、膜过滤法13/25三、设置对照1、目标：排除试验组中非测试原因对试验结果影响，提升试验结果可信度。对照试验是指除了

被测试

条件外，其它条件都

相同

试验。14/25

利用选择培养基进行尿素分解菌分离过程中，从对应稀释倍数为106培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。1、A同学筛选出150个菌落。

2、B同学筛选出50个菌落。B认为A培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其它含氮物质，因而造成不能分解尿素细菌也能在该培养基中生长。A确认自己操作无误，不一样原因是自己所用土壤样品与其它同学不一样，但因为自己在试验时未设置对照，所以也拿不出能令人信服证据。请你帮助A同学改进试验，提供含有说明了证据。资料分析：15/25小结：经过这个事例能够看出，试验结果要有说服力，对照设置是必不可少。方案一：由其它同学用与A同学相同土样进行试验方案二：将A同学配制培养基在不加土样情况下进行培养，作为空白对照，以证实培养基是否受到污染。结果预测：假如结果与A同学一致，则证实是土样不一样引发；假如结果不一样，则证实A同学操作有误。土样不一样操作有误造成培养基被污染16/25二.试验详细操作

㈠.土壤取样

从肥沃、湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好信封中。◆取土样用小铁铲和盛土样信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源选择培养基。17/25◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不一样微生物采取不一样稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不一样目标：保证取得菌落数在30～300之间、适于计数平板[三]样品稀释18/25为何分离不一样微生物要采取不一样稀释度？测定土壤中细菌总量和测定土壤中能分解尿素细菌数量，选取稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物数量（单位：株/kg）是不一样。比如在干旱土壤中上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为取得不一样类型微生物，就需要按不一样稀释度进行分离，同时还应该有针对性地提供选择培养条件。19/25㈣.取样涂布◆试验时要对培养皿作好标识。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。◆假如得到了2个或2个以上菌落数目在30——300平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落计数，假如同一稀释倍数三个重复菌落数相差较大，表明试验不准确，需要重新试验。20/25㈤.微生物培养与观察培养不一样微生物往往需要不一样培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃温度下培养3～4d。21/25微生物培养与观察22/25在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时统计作为结果，以预防因培养时间不足而造成遗漏菌落数目。23/25利用尿素作为唯一氮源培养基分离出微生物都是能分解尿素微生物吗？思索：

不一定。因为有些微生物能够利用其它微生物代谢产物进行生长繁殖。24/25课题