蛋白质的分析

WesternBlotting蛋白质的分析1实验目的了解Westernblotting的原理及其意义，掌握Westernblotting的操作方法。应用Westernblotting技术分析鉴定经SDS分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。

2实验原理

蛋白质样品经

SDS电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜）上，以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体和酶标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中培育，显出谱带，即可检测出样品中的特异组分。

3操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳。2．载手套切2－4张定性滤纸和一张PVDF膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。在膜的一（左）角作一记号（或剪角），依次序浸入100％甲醇10秒，去离子水5分钟，然后与滤纸和海绵（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。4“夹心饼”的制作（1）4.次序：负极（黑孔板）－>纤维垫->1－2张滤纸->凝胶->PVDF膜->1-2张滤纸->纤维垫->正极板（白孔板）－>扣上吊扣－>插进转膜槽中。

5“夹心饼”的制作（2）+_PVDF膜凝胶滤纸纤维垫6电转移按上示意图，接上电源（凝胶一边接负极，PVDF膜一边接正极），恒流电泳2小时，电流为：膜面积(cm2)x2mA。关闭电源，将膜取出，置塑料盒中用丽春红S染色约5分钟，回收丽春红S，然后用蒸馏水洗去背景染料显色，室温稍干燥后观察蛋白带所在位置，然后用TBST浸泡几次，完全洗去丽春红S染料。

7封闭与杂交6.将膜放入塑料盒中，加入20mL封闭液，置脱色摇床中缓慢摇动，室温1小时或4℃（层析冷柜）封闭过夜。〈三〉靶蛋白与第一抗体结合7．弃去封闭液，用TTBS稀释试剂B（1：1000），取5～10mL加入盒中，室温平缓摇动温育1小时。然后尽量回收抗体溶液，-20℃保存，可重复使用。用TBST室温洗膜3次，每次10min－15min。

8杂交与显色8.用TBST稀释试剂C（1：1000），混匀后加入盒中，每张膜约5－10mL,室温摇1小时；9.尽量回收二抗，－20ºC保存；将膜用TBST洗4次，每次10－15min.;将膜用TBS洗15min.,配制DAB显迹液，将膜放入显色，随时观察带的出现；蒸馏水洗膜；绍晾干膜，拍照。保存膜于密闭的朔料袋中。9试剂1.

转移缓冲液：2.9g甘氨酸（39mmol/L），5.8gTris碱（48mmol/L），0.37gSDS（0.037%），200ml甲醇（20%），定容至1,000mL；每组用量约500mL。2.

封闭液：5%脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，溶于TBST溶液中；由试剂盒提供（BlockingSolutionVW)3.

丽春红S（Ponceaus）染液：0.5g丽春红S溶于1mL冰乙酸中，加水至100mL；4.

TBST洗膜液：TBS缓冲液含1%Tween-20；高压灭菌后室温保存。10试剂5．

DAB，试剂盒提供,用前用100mMTris-HCl(pH7.5)配成5mg/mL。反应液配方(5mL)：100mMTris-HCl,pH7.52.5mL

5mg/mLDAB0.5mL30%H2O22.5uLddH2O2mL6．TBS:100mMTris-HCl,0.9%