食品微生物第十三章食品微生物学检验

食品微生物第十三章食品微生物学检验第一节食品卫生细菌学检验总则食品卫生细菌学检验的一般流程：取样准备取样送检样品处理检验报告第2页,共79页，2024年2月25日，星期天第一节食品卫生细菌学检验总则一、几个基本概念：

（1）批（lot)：一批产品中或特定阶段或时间内代表相同质量样品的单元数。

（2）代表性样品（representativesample):指能够代表一个批的样品，而不仅代表其中的一部分。第3页,共79页，2024年2月25日，星期天确定整批产品的取样点；建立能够代表整个产品特征的取样方法；选择样本的大小；规定取样频率。获得代表性样品的四个条件第4页,共79页，2024年2月25日，星期天

采样工具、相应材料及器皿要求无菌。二、取样准备工作采样原则：进行微生物检测的样品要具有代表性；要达到无菌操作要求。第5页,共79页，2024年2月25日，星期天采样工具和试剂：

（1）开启容器的工具剪刀、开罐器、钳子及其它所需工具。工具用双层纸包装灭菌（湿热：121℃15～30min或170℃2h干热），通常可在干燥洁净的环境中保存两个月，超过两个月后要重新灭菌。二、取样准备工作第6页,共79页，2024年2月25日，星期天（2）样品移取工具无菌的铲子、勺子、取样器、镊子、刀子、金属试管和棉拭子等。（3）标记工具能够记录足够信息的标签纸（不干胶标签纸），油性或不可拭檫记号笔或铅笔。二、取样准备工作第7页,共79页，2024年2月25日，星期天（4）取样容器灭菌的广口瓶或细口瓶、预先灭菌的聚乙烯袋（瓶）、金属试管或其他类似的密封金属容器。

采样时，最好不要使用玻璃容器，以防在运输中破碎造成取样失败。二、取样准备工作第8页,共79页，2024年2月25日，星期天（5）样品运输工具便携式冰箱或保温箱。运输工具的容量应足以放下所取样品。二、取样准备工作

使用保温箱或替代容器（如泡沫塑料）时，应将足够量的预先冷冻的冰袋放在容器四周，以保证运输过程中容器内的温度。第9页,共79页，2024年2月25日，星期天（6）防护用品保护生产环节、原料和成品不会在取样过程中被污染，同样也保护样品不被污染；

主要的防护用品有：事先消毒、灭菌或一次性使用的的工作帽、口罩、雨鞋和手套等。二、取样准备工作第10页,共79页，2024年2月25日，星期天（7）消毒剂

75%乙醇，中等浓度（100mg/L）的次氯酸钠溶液或其他类似效果的消毒剂。二、取样准备工作第11页,共79页，2024年2月25日，星期天三、样品采集3.1样品种类大样：一整批样品;中样：从样品各部分取得的混合样品，定型包装及散装食品均采样250g;样品小样：分析用样品，又称为检样，一般为25g；第12页,共79页，2024年2月25日，星期天3.2采样方法3.2.1液体样品的采集将样品充分混匀，无菌操作开启包装，用100ml无菌注射器抽取，放入无菌容器。3.2.2半固体样品的采集无菌操作开启包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。三、样品采集第13页,共79页，2024年2月25日，星期天三、样品采集（3.2采样方法）3.2.3固体样品采集大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位取样，应兼顾表面和深度，注意样品的代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器；样品是固体粉末，应边取样边混合。第14页,共79页，2024年2月25日，星期天3.2.4冷冻食品的采样

大块冷冻食品应用无菌刀具或无菌手锯从不同部位取样；也可用无菌钻头钻取碎样品，放入无菌容器。三、样品采集（3.2采样方法）第15页,共79页，2024年2月25日，星期天3.2.5生产工序监测采样

（1）车间用水自来水样从车间各水龙头采取，汤料从车间容器不同部位用100ml无菌注射器抽取。

（2）车间空气采样将5个直径为90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿5min，然后盖上平板盖送检。三、样品采集（3.2采样方法）第16页,共79页，2024年2月25日，星期天（3）车间台面、用具及加工人员手的监测

用板孔5cm2的无菌采样板及5支无菌棉签擦拭25cm2面积。若所采表面干燥，则用无菌稀释液或无菌生理盐水湿润棉签后擦拭；若表面有水，则用干棉签擦拭；擦拭后立即用无菌剪刀剪入盛样容器。三、样品采集（3.2采样方法）第17页,共79页，2024年2月25日，星期天3.2.6食物中毒微生物检样的取样当怀疑发生食物中毒时，应及时收集可疑中毒源食品或餐具等；同时收集病人的呕吐物、粪便或血液等。三、样品采集（3.2采样方法）第18页,共79页，2024年2月25日，星期天3.2.7人畜共患病原微生物检样的取样当怀疑某一动物产品可能带有人畜共患病原体时，应结合畜禽传染学的基础知识，去病原体最集中、最易检出的组织或体液送检验室检验。三、样品采集（3.2采样方法）第19页,共79页，2024年2月25日，星期天三、样品采集3.3采样数量

根据不同的食品种类，采样数量有所不同，详见下表：检样种类采样数量备注粮油粮：按三层五点采样法进行（表、中、下三层）油：重点采取表层及低层油每增加1万吨，增加1个混合样肉与肉制品生肉：取屠宰后两腿内测肌肉或背最长肌250g/只（头）脏器：根据检样目的而定光禽：每份样品一只各种样品的采样数量第20页,共79页，2024年2月25日，星期天三、样品采集（3.3采样数量）检样种类采样数量备注肉与肉制品熟肉制品：酱卤肉、烧烤肉及灌肠取样250g；熟食干制品：肉松、肉干、肉脯、其它熟食干制品等，取250g乳与乳制品鲜乳：250ml稀奶油、奶油：250g干酪：250g酸奶：250g(ml)消毒、灭菌乳：250ml全脂炼乳：250g奶粉：250g乳清粉：250g每批样品按千分之一采样，不足千件者抽250g各种样品的采样数量（续表）第21页,共79页，2024年2月25日，星期天各种样品的采样数量（续表）检样种类采样数量备注水产品鱼、大贝壳类：每个为一件（不少于250g)小虾蟹类，鱼糜制品（鱼丸、虾丸等），即食动物性水产干制品，腌醉制生食动物性水产品、即食藻类食品，每件样品均取250g冷冻饮品冰棍、雪糕：每批不得少于3件，每件不得少于3支冰淇淋：250g食用冰块：每件样品取250g班产量200000支以下者，一班为一批三、样品采集（3.3采样数量）第22页,共79页，2024年2月25日，星期天检样种类采样数量备注饮料瓶（桶）装饮用纯净水：原装1瓶（不少于250g）瓶（桶）装饮用水：原装1瓶（不少于250g）茶饮料、碳酸饮料、低温复原果汁、含乳饮料、乳酸菌饮料、植物蛋白饮料、果蔬汁饮料：原装1瓶（不少于250ml）可可粉固体饮料：原装1瓶或1袋（不少于250g）茶叶：罐装取1瓶（不少于250g），散装取250g各种样品的采样数量（续表）三、样品采集（3.3采样数量）第23页,共79页，2024年2月25日，星期天各种样品的采样数量（续表）检样种类采样数量备注调味品酱油、醋、酱等：原装1瓶（不少于250g）袋装调味品：原装1袋（不少于250g）水产调味品：鱼露、蚝油、虾酱、蟹酱等原装1瓶（不少于250g或250ml）糕点、蜜饯、糖果等糖果、糕点、饼干、面包、巧克力、淀粉糖（液体淀粉糖、麦芽糖饮品、果葡糖浆等）、蜂蜜、果冻、食糖等每件样品采取250g或250ml三、样品采集（3.3采样数量）第24页,共79页，2024年2月25日，星期天各种样品的采样数量（续表）检样种类采样数量备注蛋品巴氏消毒全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片：每件采样250g巴氏消毒冰全蛋、冰蛋黄、冰蛋白：每件采样250g皮蛋、糟蛋、咸蛋等：每件采样250g一日或一班生产为一批，检验沙门氏菌按5%抽样，但每批不少于3个检样糕点、蜜饯、糖果等糖果、糕点、饼干、面包、巧克力、淀粉糖（液体淀粉糖、麦芽糖饮品、果葡糖浆等）、蜂蜜、果冻、食糖等每件样品采取250g或250ml三、样品采集（3.3采样数量）第25页,共79页，2024年2月25日，星期天各种样品的采样数量（续表）检样种类采样数量备注罐头可采用下述方法之一：1.按杀菌锅抽样（1）低酸性罐头食品杀菌冷却后抽样2罐，3kg以上大罐每锅抽样1罐（2）酸性食品罐头每锅抽1罐，一般一个班的产品组成一个检验批，各锅的样罐组成一个样批组，每批每个品种取样基数不得少于3罐产品如按锅分堆放，在遇到由于杀菌操作不当引起问题时，也可按锅处理三、样品采集（3.3采样数量）第26页,共79页，2024年2月25日，星期天各种样品的采样数量（续表）检样种类采样数量备注罐头2.按生产班（批）次抽样（1）取样数为1/6000，尾数超过2000者增取1罐，每班（批）每个品种不得少于3罐（2）某些产品班产量大，则以30000罐为基数，取样数为1/6000；超过30000罐以上的按1/20000；尾数超过4000罐者增取1罐（3）个别产品量过小，同品种同规格可合并班次为一批取样，但并班总数不超过5000罐，每个批次样数不得少于3罐产品如按锅分堆放，在遇到由于杀菌操作不当引起问题时，也可按锅处理三、样品采集（3.3采样数量）第27页,共79页，2024年2月25日，星期天四、送检4.1送检原则：

尽可能保持检样原有的物理和微生物状态，不要因送检过程而引起微生物的增多或减少。第28页,共79页，2024年2月25日，星期天四、送检4.2送检时一般采取的措施

（1）无菌方法采样后，所装样品的容器要尽可能密封，以防止环境中的微生物进一步污染；

（2）送检样品不得加入任何防腐剂；第29页,共79页，2024年2月25日，星期天四、送检（4.2送检时一般采取的措施）

（3）进行微生物学检验的样品，送达实验室要越快越好，一般不应超过3h；若路途遥远，可将不需要冷冻的样品保持在1～5℃环境中送检，可采用冰桶等装置；若需保持在冷冻状态（如已冻结的样品），则需将样品保存在泡沫料隔热箱内，箱内可置干冰，使温度维持在0℃以下，或采用其他冷藏设备。第30页,共79页，2024年2月25日，星期天四、送检（4.2送检时一般采取的措施）

（4）水产品因含水分较多，体内酶活力较旺盛，易于变质。采样后应在3h内送检，在送检途中一般都应加冰保存。

（5）对于某些易死亡病原菌检验的样品，在运送过程中可采用运送培养基。如进行空肠弯曲菌等菌检样的送检，可插于Cary-Blair运送培养基中送检。第31页,共79页，2024年2月25日，星期天四、送检（4.2送检时一般采取的措施）(6)检样送检时还要标注适当的标记，填写微生物学检验特殊要求的送检申请单。如：样品描述、采样者姓名、采样日期、采样并送检的目的及原因等。第32页,共79页，2024年2月25日，星期天五、样品处理5.1液体样品液体样品：指黏度不超过牛乳的非黏性食品。可直接用灭菌吸管准确吸取25ml样品加入225ml蒸馏水或生理盐水及有关增菌液中，制成1∶10稀释液。第33页,共79页，2024年2月25日，星期天五、样品处理（5.1液体样品）

吸取前要将样品充分混合，在开瓶、开盖等打开样品容器时，一定要注意表面消毒，无菌操作。用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖打开。第34页,共79页，2024年2月25日，星期天

含有二氧化碳的液体饮料先倒入灭菌的小瓶，覆盖灭菌纱布，轻轻振荡，待气体全部逸出后再进行检验。五、样品处理（5.1液体样品）第35页,共79页，2024年2月25日，星期天五、样品处理5.2固体或黏性液体食品此类样品无法用吸管吸取，可用灭菌容器称取检样25g，加至预热的生理盐水或蒸馏水225ml中，振荡溶解或使用振荡器溶解。尽快检验，从样品稀释到接种，一般不超过15min。第36页,共79页，2024年2月25日，星期天五、样品处理（5.2固体或黏性液体食品）5.2.1固体食品的处理（1）捣碎均质法

将100g或100g以上样品捣碎均匀，从中取25g放入有225ml无菌稀释液的无菌均质杯中，以8000～10000r/min均质1～2min。该方法对大部分食品样品均适用。第37页,共79页，2024年2月25日，星期天（2）剪碎振荡法将100g或100g以上样品剪碎均匀，从中取25g装入带有225ml无菌稀释液和适量直径为5mm左右的玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振荡50次，振幅不小于40cm。五、样品处理（5.2固体或黏性液体食品）第38页,共79页，2024年2月25日，星期天（3）研磨法将100g或100g以上的样品检碎、混匀，取25g放入无菌研钵中充分研磨后在放入装有225ml无菌稀释液的瓶中，盖紧瓶盖后，充分摇匀。五、样品处理（5.2固体或黏性液体食品）第39页,共79页，2024年2月25日，星期天（4）整粒振荡法有完整自然保护膜的颗粒状样品（如蒜瓣、青豆等）可以直接称取25g整粒样品置入带有225ml稀释液和适量玻璃珠的无菌稀释瓶内，盖紧瓶盖，用力快速振荡50次，振幅不小于40cm。五、样品处理（5.2固体或黏性液体食品）第40页,共79页，2024年2月25日，星期天五、样品处理5.2.2冷冻样品的处理冷冻样品在检验前要进行解冻；一般可在0～4℃解冻，解冻时间不得超过18h；也可在45℃以下解冻，时间不超过15min；样品解冻后，无菌称取检样25g，置于225ml无菌稀释液中，制成均匀的1∶10混悬液。第41页,共79页，2024年2月25日，星期天五、样品处理5.2.3粉状或颗粒状样品的处理用灭菌勺或其他适用工具将样品搅拌均匀后，无菌称取检样25g，置于生理盐水中，充分振荡混匀或使用振荡器混匀，制成1∶10混悬液。第42页,共79页，2024年2月25日，星期天六、检验与报告6.1检验检验样品送到实验室后，立即将样品放置于普通冰箱或低温冰箱中，并进行登记，按检样要求积极准备条件进行检验。样品收集后应于36h内检验。第43页,共79页，2024年2月25日，星期天六、检验与报告(6.1检验)主要检验项目(依国标规定):

菌落总数、大肠菌群和致病菌检测；

其中：致病菌检测包括肠道致病菌检验和致病性球菌检验等。第44页,共79页，2024年2月25日，星期天六、检验与报告6.2报告按照检验项目完成各类检验后，应立即填写检验报告单，签名后送主管人员核实签字，加盖单位印章，以示生效，并立即交食品卫生监督人员处理。第45页,共79页，2024年2月25日，星期天六、检验与报告（6.2报告）

实验室必须具有专用冰箱存放样品，对于一般阳性样品，在发出报告后3天（特殊情况可适当延长）方可处理样品；进口食品的阳性样品，需保存6个月，才可处理；对于阴性样品可及时处理。第46页,共79页，2024年2月25日，星期天第二节食品卫生细菌学菌落总数的检验技术一、概论菌落总数：指在被检样品的单位质量（g）、容积（ml）或表面积（cm2)内，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。

判断食品被污染程度的标志，可为被检样品进行卫生学评价提供依据。第47页,共79页，2024年2月25日，星期天一、概论菌落总数测定方法：平板活菌记数法

a.菌落：由一个单细胞繁殖而成，且肉眼可见的子细胞群体；

b.不同细菌生理特性不同，营养要求及培养条件各异，因此，菌落总数不能区分细菌的种类。第48页,共79页，2024年2月25日，星期天一、概论c.食品样品中的细菌可能以单个、成双、链状、葡萄串状或成堆的形式存在，营养平板上形成的菌落不全部来源于单细胞。因此，平板上所得菌落数不应报告为“活菌数”，而应该以单位质量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位数（colonyformingunits,CFU)报告。第49页,共79页，2024年2月25日，星期天二、细菌菌落总数检验程序检样制成几个适当倍数的稀释度选择2～3个适宜稀释度，各取1ml加入灭菌平皿内每皿加入适量营养琼脂培养（37℃48h）菌落记数报告菌落总数的检验程序第50页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法3.1检样稀释及培养

（1）以无菌操作取检样25g（ml），放于225ml灭菌生理盐水或其他溶液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预放置适量的玻璃珠）或灭菌研钵，经充分振荡或研磨制成1∶10的均匀稀释液。第51页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.1检样稀释及培养）

（2）用1ml无菌吸管吸取1∶10的稀释液1ml，沿管壁徐徐加入含有9ml灭菌的生理盐水的试管内，振荡试管，混合均匀，制成1∶100的稀释液；

（3）另取1ml灭菌吸管，按以上步骤操作程序，做10倍递增稀释液；第52页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.1检样稀释及培养）

（4）根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释液的同时，即以吸取该稀释液的吸管移取1ml稀释液于灭菌培养平皿中，每个稀释度做3个重复。第53页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.1检样稀释及培养）

（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至50℃左右的琼脂培养基注入平皿约15～20ml，并转动平皿，混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内做空白对照。第54页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.1检样稀释及培养）

（6）待琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）℃）恒温培养箱中培养（48±2）h，取出，记数，乘以稀释倍数，即得1ml（g）样品中所含菌落总数。第55页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法3.2菌落记数方法

进行平皿菌落记数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。达到规定培养时间应立即记数，若不可立即记数者，应将平板放置在0～4℃，但不要超过24h。第56页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法3.3菌落记数报告（1）平板菌落数的选择

选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。如有平皿内菌落连成片状，则以无片状菌落生长的培养皿作为该稀释度的菌落记数对象；第57页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）

若片状菌落不到平皿的1/2，而其余菌落分布非常均匀，则可以计算1/2平皿后乘以2的菌落数代表全皿菌落数；若板内有链状菌落生长（即菌落之间无明显界限），一条链视为一个菌落。第58页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）（2）稀释度的选择例次稀释液及菌落两稀释液菌落数之比值菌落总数（个/g或ml)报告方式（个/g或ml)10-110-210-31多不可记16420-1640016000或1.6×104a.应选取平均菌落数在30～300之间的稀释度报告；稀释度选择与菌落数报告方式第59页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）b.若2个稀释度菌落数均在30～300之间，应以二者比值决定。比值≤2，则取其平均值；比值≥2，则取其较小数字。例次稀释液及菌落两稀释液菌落数之比值菌落总数（个/g或ml)报告方式（个/g或ml)10-110-210-31多不可记295461.63775038000或3.8×1042多不可记271602.22710027100或2.7×104稀释度选择与菌落数报告方式第60页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）c.若所有稀释度均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；例次稀释液及菌落两稀释液菌落数之比值菌落总数（个/g或ml)报告方式（个/g或ml)10-110-210-31多不可记560313-313000310000或3.1×105稀释度选择与菌落数报告方式第61页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）d.若所有稀释度均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；例次稀释液及菌落两稀释液菌落数之比值菌落总数（个/g或ml)报告方式（个/g或ml)10-110-210-3127115-270270或2.7×102稀释度选择与菌落数报告方式第62页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）e.若所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告；例次稀释液及菌落两稀释液菌落数之比值菌落总数（个/g或ml)报告方式（个/g或ml)10-110-210-31000-＜1×10＜10稀释度选择与菌落数报告方式第63页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）f.若所有稀释度均不在30～300之间，有的大于300，有的又小于30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。例次稀释液及菌落两稀释液菌落数之比值菌落总数（个/g或ml)报告方式（个/g或ml)10-110-210-31多不可记30512-3050031000或3.1×104稀释度选择与菌落数报告方式第64页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）（3）菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告；

大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，按四舍五入法计；为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。第65页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）（4）注意事项

为了能正确的反映食品中各种细菌存在的情况，应注意并遵循以下要求和规定：

a.检验中所需玻璃仪器必须完全无菌，不得有残留物存在；

b.检样的稀释可用灭菌的生理盐水或蒸馏水；第66页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）c.注意每次递增稀释一次，必须更换1支1ml灭菌吸管，以保证结果的准确性；

d.接种结束后，平皿应倒置培养，以防冷凝水落到培养基表面影响菌落形成；

e.平板活菌记数法只能检出生长的活菌，不能检出样品中全部的细菌数，记数总是比食品中实际存在的细菌数要少。第67页,共79页，2024年2月25日，星期天三、操作方法（3.3菌落记数报告）f.加入平皿内的检样稀释液，有时带有检样颗粒，为了避免与细菌菌落混淆，可做一检样稀释液与琼脂混合的平皿，不经培养，于4℃环境放置，以用作记数检样菌落时的对照。

g.矿泉水和自来水等的检测，一般不稀释，直接取样进行琼脂平板培养。第68页,共79页，2024年2月25日，星期天四、细菌菌落总数测定的其他方法4.1平板表面涂布法

操作方法：将琼脂制成平板，经50℃，1～2h或35℃，18～20h干燥后，于上滴加检样稀释液0.2ml，用L形棒涂布与整个平板表面，放置约10min，将平板倒置，培养，计数。第69页,共79页，2024年2月25日，星期天四、细菌菌落总数测定的其他方法（4.1平板表面涂布法）

优点：菌落生长于表面，便于识别和检查；不会与食品检样中带有的颗粒混淆；可使细菌不受融化琼脂热力损伤，避免由于操作中的不良因素而使检样中菌落数降低。

缺点：取样量较少，代表性受到一定影响。第70页,共79页，2024年2月25日，星期天四、细菌菌落总数测定的其他方法4.2平板表面点滴法

操作方法：用标定好的微量吸管或注射器或微量加样器将定量（如0.1ml）检样稀释液滴加于琼脂平板固定区域（预先在平板背面用记号笔将平板划分为6等份），每个区域滴同一稀释度，滴3滴作为平行试验。滴加后，将平板平置5～10min，然后倒置培养。第71页,共79页，2024年2月25日，星期天四、细菌菌落总数测定的其他方法（4.2平板表面点滴法）

优点：快速，