2.9 蛋白质样品的前期处理

主讲老师：邢煜骞蛋白质样品的前期处理蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化是当代生物产业中的核心技术，是基因工程制药产业中的重要环节。捕获粗纯精纯蛋白样品的前期处理预处理

离心过滤细胞破碎机械破碎非机械破碎固液分离离心过滤水相萃取常用细胞破碎方法分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活高压匀浆法利用高压迫使细胞悬浮液通过针型阀后，因高速撞击和突然减压而使细胞破裂的方法。可以大规模应用，不适用于易造成堵塞的团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌、以及含有包含体的基因工程菌。高速珠磨法将细胞悬浮液与研磨剂(通常是直径＜1mm的无铅玻璃小珠)一起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的相互剪切、碰撞促进细胞壁破裂而释放出内含物。产生大量的热，必须采取冷却措施。超声破碎法利用超声波来处理细胞悬浮液，在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。可处理少量样品，产生热量大，敏感物质易失活。高压挤压法把浓缩的细胞悬液冷冻成冰晶，用高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，由于冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。破碎率高，细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。不适用对冻融敏感的生物活性物质。机械破碎法的优缺点优点速度快，处理量较大，不带入其它化学物质缺点产生热量，要采取冷却措施，防止目的产物失活渗透冲击法将细胞置于高渗介质中，平衡后，突然稀释介质或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。温和，操作简单，仅适用于细胞壁较脆弱、经酶预处理的菌，或细胞壁合成受抑制而强度减弱的菌。增溶法利用表面活性剂等化学试剂的增溶作用，增加细胞壁和膜的通透性使细胞破碎的方法。表面活性剂：SDS,TritonX-100有机溶剂：乙醇、异丙醇、尿素、盐酸胍金属螯合剂：EDTA（G－菌）缺点：添加新的化学试剂，造成新的污染脂溶法有机溶剂与细胞壁和膜上的脂质作用，导致细胞壁膨胀、破裂，释放出胞内物质。如：甲苯、氯苯、异丙苯、二甲苯等。酶溶法利用生物酶消化溶解细胞壁和细胞膜的方法。如溶菌酶、葡聚糖酶、糖苷酶等优点产物可选择性释放、核酸泄出量少、细胞外形完整缺点溶酶价格高，回收利用难，大规模使用成本高；通用性差，最佳条件不易确定；存在产物抑制作用，释放率低；只限于实验室规模。非机械破碎法的优缺点优点选择性高，胞内产物的总释放率低，特别是可有效抑制核酸的释放，料液黏度小，利于后处理过程缺点