生物化学古练权版省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

非水溶剂中酶促反应有机介质中酶促反应概述有机介质中反应条件有机介质对酶性质影响有机介质中酶催化应用1/92长久观点认为:有机溶剂是酶变性剂、失活剂这一传统酶学思想影响下，酶在有机介质中催化作用研究以前几乎毫无进展。这一观点直到1984年，非水溶剂中酶催化研究才取得了突破性进展。1984年美国Klibanov,A.M.在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点综述。Klibanov等工作——在仅含微量水有机介质(Microaqueousmedia)中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。基于研究工作，Ｋlibanov等提出只要条件适当，酶能够在非生物体系疏水介质中催化天然或非天然疏水性底物和产物转化，酶不但能够在水与有机溶剂互溶体系，也能够在水与有机溶剂组成双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水有机溶剂中表现出催化活性。这一观点无疑是对酶只能在水溶液中起作用传统酶学思想挑战有机介质中酶促反应概述2/92有机相酶反应优点有利于疏水性底物反应。可提升酶热稳定性。能催化在水中不能进行反应。可改变反应平衡移动方向。可控制底物专一性。可预防由水引发副反应。可扩大反应pH值适应性。酶易于实现固定化。酶和产物易于回收。可防止微生物污染。3/92有机相酶反应具备条件确保必需水含量。选择适当酶及酶形式。选择适当溶剂及反应体系。选择最正确pH值。4/92有机相酶反应研究进展超临界流体中酶反应仿水溶剂和印迹技术5/92超临界流体中酶反应指温度和压力均在本身临界点以上高密度流体，含有和液体一样凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又靠近于气体，是通常液体近百倍。6/92超临界流体相关性质超临界流体P-V-T性质7/92所谓超临界CO2是指纯净CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1℃，临界压力7.28Mpa)时状态。该流体含有没有毒、无臭、不燃等优点。提升溶剂选择性基本标准操作温度和超临界流体临界温度靠近超临界流体化学选择和待分离溶质化学性质靠近超临界流体相关性质8/92超临界流体萃取应用实例9/92有机相酶反应研究进展超临界流体中酶反应仿水溶剂和印迹技术10/92仿水溶剂和印迹技术仿水溶剂体系原理分子印迹技术11/92仿水溶剂体系原理可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替换系统中辅助溶剂水，从而影响酶活性和立体选择性。极性添加剂对体系影响对反应体系内水分配影响与蛋白质直接作用对产物分配影响应用举例：经过适当地添加少许DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物得率从51%提升到91%，且反应活性也有所提升。12/92分子印迹技术当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应速度比不含抑制剂水溶液中冻干出来酶高100倍，但这么处理酶在水溶液中其活性与未处理酶相同。原理：竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生改变，形成一个高活性构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中高度刚性而得到保持。酶蛋白分子在有机相中含有对配体“记忆”功效。13/92非水溶剂中酶促反应有机介质中酶促反应概述有机介质中反应条件有机介质对酶性质影响有机介质中酶催化应用14/92有机介质中酶促反应条件必需水酶选择溶剂及反应体系选择pH选择和离子强度影响15/921.必需水概念紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需最少许水。16/921.必需水影响酶反应体系中需水含量原因不一样酶需水量不一样。同一个酶在不一样有机溶剂中需水量不一样，溶剂疏水性越强，需水量越少17/922.酶选择酶种类选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。除与酶相关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系相关。酶形式选择酶粉比如：有些人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发觉催化活性随反应体系中酶量降低而显著增加。化学修饰酶比如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、pH、蛋白酶水解稳定性均高于天然SOD。固定化酶把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其反抗有机介质变性能力、反应速度、热稳定性等都可提升。18/923.溶剂及反应体系选择

水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等水不溶性有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等酶促反应有机介质体系：单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂）两相体系（水/水不溶性有机溶剂）低水有机溶剂体系（有机溶剂体系）反胶束体系19/92反胶束体系概念和表面活性剂反胶束体系概念表面活性剂分散于连续有机相中自发形成纳米尺度一个聚集体。反胶束溶液是透明热力学稳定系统。表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油极性基团和亲油憎水非极性基团两部分组成两性分子。在有机相酶反应中用得最多是阴离子表面活性剂：AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。20/92有机溶剂影响酶催化方式有机溶剂能经过直接与酶相互作用引发抑制或失活增大酶反应活化能来降低酶反应速度。降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成氢键，使酶活性下降。酶三级结构改变，间接改变酶活性中心结构影响失活。有机溶剂与扩散底物或产物相互作用而影响酶活有机溶剂直接与酶附近必需水相互作用21/924.pH选择和离子强度影响pH选择：在有机溶剂环境中，不会发生质子化及脱质子化现象。酶在水相pH值可在有机相中保持，同一个酶不一样起源，对pH值敏感程度大不相同。离子强度影响：随冻干时用缓冲溶液离子强度增大，酶活会增大。22/92非水溶剂中酶促反应有机介质中酶促反应概述有机介质中反应条件有机介质对酶性质影响有机介质中酶催化应用23/92有机介质对酶性质影响稳定性活性专一性反应平衡方向24/921.稳定性热稳定性提升和储存稳定性提升结论：在低水有机溶剂体系中，酶稳定性与含水量亲密相关；普通在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量增加而急剧下降。25/922.活性刚-柔并存刚性：生物大分子结构准确性柔性：生物大分子局部区域含有一定可运动性。（1）单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响有机溶剂直接作用于酶。有些酶活性会伴随一些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）到达最大值；若浓度再升高，则活性下降。（2）低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保留，但也有一些酶活性亦改变。例有些人对吸附在不一样载体上胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水活度下酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而改变，在一定水活度下，酶活性随载体不一样而改变。26/922.活性（3）在反向微团体系中，微团效应使一些酶活性增加超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值活性称为超活性（Super-activity）。认为：超活性是由围绕在酶分子外面表面活性剂这一外壳之较大刚性所引发。依据：微团水化程度（W）（W=[H2O]/[表面活性剂]）最正确值和酶活性最大值呈正相关W值最正确时，微团内径总是相当于被包裹酶分子直径27/923.专一性一些有机介质可能使一些酶专一性发生改变，这是酶活性中心构象刚性增强结果。有些在水中不能实现反应路径，在有机介质中却成为主导反应。28/92酶活性丧失可能原因29/924.反应平衡方向酶合成产物有机溶剂使用浓度（%）合成收率（%）枯草杆菌蛋白酶核糖核酸酶甘油9050无色杆菌蛋白酶人胰岛素DMF和乙醇3080羧肽酶牛胰核糖核酸酶甘油9050凝血酶人生长激素甘油8020嗜热杆菌蛋白酶天冬甜味素乙酸乙酯

胰凝乳蛋白酶脑啡肽乙醇或DMF

30/92非水溶剂中酶促反应有机介质中酶促反应概述有机介质中反应条件有机介质对酶性质影响有机介质中酶催化应用31/92有机介质中酶催化应用酶催化反应应用蛋白酶 肽合成酰基化 合成多肽糖类酰基化羟基化酶氧化 甾体转化过氧化物酶 聚合酚类、胺类化合物聚合胆固醇氧化酶 氧化胆固醇测定 醇脱氢酶酯化有机硅醇酯化脂肪酶 肽合成酯合成转酯聚合酰基化 青霉素G前体肽合成醇与有机酸合成酯类各类酯类生产二酯选择性聚合甘醇酰基化32/92手性药品拆分概念：手性化合物是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体两种异构体化合物。手性药品两种对映体药效差异一个有显著疗效，另一个有疗效弱或无效

一个有显著疗效，另一个有毒副作用

两种对映体药效相反

两种对映体含有各自不一样药效

两种消旋体作用含有互补性33/92手性药品拆分方法分为：非生物法、生物法非生物法（机械分离法、形成和分离对映体异构法、色谱分离法、动力学拆分）生物拆分法原理实质即两个对映体竞争酶同一个活性中心位置，二者反应速率不一样，产生选择性，从而使反应产物含有光学活性。青霉素酰化酶及其催化作用：利用其底物专一性及对映体选择性进行光学异构体合成与拆分。34/922、手性高分子聚合物制备(1)可生物降解聚酯合成(2)糖脂合成3、酚树脂合成如辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶均一介质体系中，能够催化苯酚等酚类物质聚合，生成酚类聚合物。4、导电有机聚合物合成如辣根过氧化物酶能够在与水混溶有机介质（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。5、发光有机聚合物合成如辣根过氧化物酶能够在有机介质中催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，能够发出蓝光。6、食品添加剂生产如利用芳香醛脱氢酶生成香兰素。7、甾体转化如可松转化为氢化可松酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成系统中，转化率高达100%和90%。8、生物能源如生物柴油。35/92有机溶剂中酶促反应C-O键形成C--N键反应，肽合成C-C键形成还原反应氧化反应异构化反应

C-X反应卤化反应36/92C-O键形成酯类：酯酶和脂肪酶可催化酯合成反应、转酯反应和酸酐水解反应。环氧化合物糖苷键水解和形成加氧氧化反应37/92酯合成反应38/92转酯反应39/92酸酐水解40/92环氧化合反应41/92糖焦磷酸化，糖异构化42/92糖衍生物43/92醇解44/92加氧氧化反应45/92有机溶剂中酶促反应C-O键形成C--N键反应，肽合成C-C键形成还原反应氧化反应异构化反应

C-X反应卤化反应46/92C--N键反应，肽合成47/92有机溶剂中酶促反应C-O键形成C--N键反应，肽合成C-C键形成还原反应氧化反应异构化反应

C-X反应卤化反应48/92C-C键形成羟醛反应酮醛和羟醛转移反应醛缩合反应乙酰辅酶A参加C-C键组成反应醛加成反应49/92（1）羟醛反应50/9251/92（2）酮醛和羟醛转移反应52/92（3）醛缩合反应53/92（4）乙酰辅酶A参加C-C键组成反应54/92（5）醛加成反应55/92有机溶剂中酶促反应C-O键形成C--N键反应，肽合成C-C键形成还原反应氧化反应异构化反应

C-X反应卤化反应56/92还原反应57/92有机溶剂中酶促反应C-O键形成C--N键反应，肽合成C-C键形成还原反应氧化反应异构化反应

C-X反应卤化反应58/92氧化反应（1）C-H,C=C氧化（2）醇氧化（3）苯酚氧化（4）羧酸氧化（5）C-N氧化59/92（１）C-H,C=C氧化60/92（２）醇氧化61/92（3）苯酚氧化62/92（４）羧酸氧化63/92（5）C-N氧化64/92有机溶剂中酶促反应C-O键形成C--N键反应，肽合成C-C键形成还原反应氧化反应异构化反应

C-X反应卤化反应65/92异构化反应

66/92有机溶剂中酶促反应C-O键形成C--N键反应，肽合成C-C键形成还原反应氧化反应异构化反应

C-X反应卤化反应67/92C-X反应卤化反应68/92酶工程酶工程定义化学酶工程固定化酶生物酶工程酶工程应用范围69/92酶工程定义酶工程即利用酶催化作用，在一定生物反应器中，将对应原料转化成所需产品。酶工程是当代酶学理论与化工技术交叉技术，它应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。70/92酶工程酶工程主要研究酶生产、纯化、固定化技术、酶分子结构修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面应用。酶工程主要采取两种方法。一是化学酶工程，即经过对酶化学修饰或固定化处理，改进酶性质以提升酶效率和减低成本，甚至经过化学合成法制造人工酶；另一个是生物酶工程，即用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从而声查性能稳定，含有新生物活性及催化效率更高酶。所以酶工程能够说是把酶学基本原理与化学工程技术及重组技术有机结合而形成新型应用技术。71/92酶工程酶工程定义化学酶工程固定化酶生物酶工程酶工程应用范围72/92化学酶工程1．天然酶工业用酶制剂大多是经过微生物发酵而取得粗酶，价格低，应用方式简单，产品种类少，使用范围窄。比如洗涤剂、皮革生产等用蛋白酶；纸张制造、棉布退浆等用淀粉酶；漆生产用多酚氧化酶；乳制品中凝乳酶等。天然酶分离纯化伴随各种层析技术及电泳技术发展，得到长足进展，当前医药及科研用酶多数是从生物材料中分离纯化得到。73/92化学酶工程2．化学修饰酶经过对酶分子化学修饰能够改进酶性能，以适合用于医药应用及研究工作要求。化学修饰路径，能够经过对酶分子表面进行修饰，也可对酶分子内部进行修饰。主要方法有：①酶功效基修饰：经过对酶功效基化学修饰提升酶稳定性和活性。比如将α-胰凝乳蛋白酶表面氨基修饰成亲水性更强-NHCH2COOH，可使酶抗不可逆热失活稳定性在60℃时提升了1000倍。②交联反应：用一些双功效试剂能使酶分子间或分子内发生交联反应而改变酶活性或稳定性。比如将人α-半乳糖苷酶A经交联反应修饰后，其酶活性比天然酶稳定，对热变性与蛋白质水解稳定性也显著增加。若将两种大小、电荷和生物功效不一样药用酶交联在一起，则有可能在体内将这两种酶同时输送到同一部位，提升药效。③大分子修饰：可溶性高分子化合物如肝素、葡聚糖、聚乙二醇等可修饰酶蛋白侧链，提升酶稳定性，改变酶一些主要性质。如α-淀粉酶与葡聚糖结合后热稳定性显著增加，在65℃结合酶半衰期为63min，而天然酶半衰期只有2.5min。74/92酶工程酶工程定义化学酶工程固定化酶生物酶工程酶工程应用范围75/92固定化酶固定化酶（immobilizedenzyme），是用物理或化学方法处理水溶性酶使之变成不溶于水或固定于固相载体但仍含有酶活性酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，轻易与水溶性反应物分离，可重复使用。固定化酶不但仍含有酶高度专一性和高催化效率特点，且比水溶性酶稳定，可较长久使用，含有较高经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内酶模拟，可有利于了解微环境对酶功效影响。固定化酶在文件中曾用水不溶酶、不溶性酶、固相酶、结合酶、固定酶、酶树脂及载体结合酶等名称。酶催化反应依赖于它活性部位完整性，所以在固定某一酶时必须选择适当条件，使其活性部位基因不受影响，并防止高温、强酸及强碱等条件，不使蛋白质变性。76/92固定化酶①载体结正当：最惯用是共价结正当，即酶蛋白非必需基团经过共价键和载体形成不可逆连接。在温和条件下能偶联蛋白质基团包含：氨基、羧基、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基、酪氨酸酚基、丝氨酸和苏氨酸羟基。参加和载体共价结合基团，不能是酶表现活力所必需基团。②交联法：依靠双功效团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采取双功效团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参加交联反应。③包埋法：酶被裹在凝胶细格子中或被半透性聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，比如可用明胶及戊二醛包埋含有青霉素酰化酶活力菌体，工业上用于生产6-氨基青霉烷酸。酶经过固定化后,比较能耐受温度及pH改变，最适pH往往稍有移位,对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提升几十倍（如5′-磷酸二酯酶工业应用）甚至几百倍77/92固定化酶固定化酶形式多样，可制成机械性能好颗粒装成酶柱用于连续生产；或在反应器中进行批式搅拌反应；也可制成酶膜、酶管等应用于分析化学；又可制成微胶囊酶，作为治疗酶应用于临床。现在又有些人用酶膜（包含细胞、组织、微生物制成膜）与电、光、热等敏感元件组成一个装置称生物传感器，用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息传递及环境保护中有害物质检测。最惯用是酶膜与离子选择电极组成生物传感器，比如脲传感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧电极组成，脲经脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又继续被硝化菌氧化，总耗氧量则经过氧电极反应出电流改变，用以计算脲含量。78/92酶工程酶工程定义化学酶工程固定化酶生物酶工程酶工程应用范围79/92生物酶工程生物酶工程是在化学酶工程基础上发展起来，是以酶学和DNA重组技术为主当代分子生物学技术相结合产物。所以它亦可称为高级酶工程。自从70年代初DNA重组技术问世以来，把酶学推进到一个十分主要发展时期，使它基础研究和应用研究领域发生着巨大革命性改变，产生了生物酶工程。生物酶工程主要包含三个方面：(1)用DNA重组技术(即基因工程技术)大量地生产酶(克隆酶)；(2)对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶(突变酶)；(3)设计新酶基因，合成自然界不曾有过、性能稳定、催化效率更高新酶。80/92酶基因克隆和表示技术应用使我们有可能克隆各种天然蛋白基因或酶基因。先在特定酶结构基因前加上高效开启基因序列和必要调控序列，再将此片段克隆到一定载体中，然后将带有特定酶基因上述杂交表示载体转化到适当受体细菌中，经培养繁殖，再从搜集菌体中分离得到大量表示产物——我们所需要酶。一些来自于人体酶制剂，如治疗血栓栓塞病尿激酶原，就能够用此法取代从大量人尿中提取。另外还有组织纤溶酶原激活剂(TPA)与凝乳酶等一百各种酶基因已经克隆成功，其中一些还已进行了高效表示。此法产生出大量酶，并易于提取分离纯化。81/92近几年兴起另一个新研究领域：酶选择性遗传修饰，即酶基因定点突变。研究者们在分析氨基酸序列搞清酶一级结构及X线衍射分析搞清酶空间结构基础上，再在由功效推知结构或由结构推知功效重复推敲下，设计出酶基因改造方案，确定选择性遗传修饰修饰位点。现在人们已掌握技术，所以只要有遗传设计蓝图，就能人工合成出所设计酶基因。酶遗传设计主要目标是创制优质酶，用于生产昂贵特殊药品和超自然生物制品，以满足人类特殊需要。82/92需要改进酶学性质包含：对热、氧化剂、非水溶剂稳定性；对蛋白水解作用敏感性；免疫原性；最适pH、离子强度及温度；催化效率；对底物和辅助因子专一性与亲协力；反应主体化学选