年产50万支人乳头瘤病毒疫苗工厂设计

宫颈癌是的女性最常见恶性肿瘤之一，是女性生殖系统第二位的恶性肿瘤中，也是全球第四大常见致死癌症，研究证实95%以上的宫颈癌伴有人乳头瘤病毒(HumanPapilloma,HPV)感染。HPV预防性疫苗接种成为预防宫颈癌的生物技术有限公司得双价人乳头瘤病毒疫苗(商品名：馨可宁)于2019年12月31日获国家药监局批准上市注册申请，2020年1月3日下午，万泰公司已经打破HPV疫苗由默沙东公司(Merck)和葛兰素史克公司(GSK)生产的垄断本设计年产50万支人乳头瘤病毒疫苗的生产车间，每支含有40μgHPV16关键词：人乳头瘤病毒；高密度发酵工艺；基因工程Oneofthemostcommonfemalemalignancyiscervicalcancer,thecancerisinsecondplaceinthefemalereproductivesystem,andisalsotheworld'sfourthmostcommonfatalcancer,studiesconfirmthatmorethan95%ofcervicalcancersassociatedwithhumanPapillomaVirus(HPV)infection.ProphylacticHPVvaccinationasanimportantmeansofpreventingcervicalcancer.HPVvaccineresearchanddevelopmentofdomesticenterprisesincludingShanghaiInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd,NationalVaccine&SerumInstitute,BravoVax,ShanghaiZerunBiotechnologyCo.,Ltd,INNOVAX.WhichbytheINNOVAX.InManhattanbivalenthumanPapillomaVirusvaccine(tradename:Cecolin)on31December2019bytheStateFoodandDrugAdministrationapprovedformalproductionofvaccines,thevaccineisarecombinanthumanChina'sfirstindependentlydevelopedHPVvaccines,HPVvaccinebythebreakMerckandGlaxoSmithKline(GSK)productionmonopoly.Butacompany'sproductionishardlyenoughtosupplythewholeofChina.Therefore,thisdesignwillcancervaccinerecombinantEscherichiacoliastherawmaterial,theapplicationofhigh-densityfermentationprocess,aftertheproductionoftheproteinpurificationtechniques,mixedwithotheringredientsCecolinsaThisdesignedtoproduce500,000HPVvaccineproductionplant,eachcomprisingtherecombinantprotein40μgHPV16,20μgHPV18recombinantprotein,210μgaluminumsalt,Al(OH)3,packagedasapre-filledsyringe,aninjectiondosageform,specificationsfor60μg/0.5mL/support.Thisdesigncombinesthecervicaldocumentsandstandards,completedtheprocessofdesignandplantlayoutdesign,materialswerecalculatedheatbalance,selectionfermenterdesign,majorequipment.engineeredvaccine;DesignWorkshop 52人乳头瘤病毒疫苗的生产工艺确定 62.1重组大肠杆菌的发酵工艺 62.1.1培养基 7 82.1.3温度 82.1.4溶解氧浓度 82.1.5诱导条件 82.1.6菌体接种量 92.1.7补料方式 2.2蛋白质的纯化工艺 2.2.1菌体的收集 2.2.2菌体的洗涤 2.2.3包涵体的破碎 2.2.4包涵体的溶解 2.2.5HP亲和层析 2.2.6包涵体的复性 2.2.7去盐浓缩 2.3冷冻干燥工艺 2.4疫苗的灌装工艺 2.5各项指标检测 2.5.1蛋白无菌检测 2.5.2蛋白纯度检测 2.5.3蛋白浓度检测 2.5.4蛋白内毒素检测 2.5.5蛋白活性检测(ELISA法) 2.5.6蛋白的表达与Westernblot检测 2.6工艺流程 3工艺计算 3.1工艺基础数据 3.2发酵罐的选型 3.2.1发酵罐台数的确定 3.2.2主要尺寸的计算 3.2.3发酵罐冷却面积的计算 3.2.4发酵罐搅拌器的设计 3.2.5发酵罐设备结构的空气分布器 3.2.6发酵罐的密封方式 3.2.7发酵罐设备材料的选择 3.2.8发酵罐支座的选择 3.3种子罐的选型 203.3.1种子罐台数的确定 203.3.2主要尺寸的计算 203.3.3种子罐冷却面积的计算 213.3.4种子罐搅拌器的设计 223.3.5种子罐设备结构的空气分布器 223.3.6种子罐的密封方式 223.3.7种子罐设备材料的选择 223.3.8种子罐支座的选择 233.4原料消耗计算 233.4.1每周期消耗培养基计算 233.4.2原料消耗汇总表 243.5热量衡算 253.5.1发酵工艺热量计算 253.5.2发酵过程中的无菌空气消耗量计算 263.6其他主要设备选型 263.6.1高压蒸汽灭菌锅 263.6.2切向流过滤系统 273.6.3去盐浓缩设备 273.6.4离心机的选型 283.6.5高压均质机 293.6.6喷雾冷冻干燥机 293.6.7粉针剂分装机 293.7辅助部门 3.7.1理化分析室 3.7.2微生物实验室 3.7.3原料仓库 3.7.4成品仓库 3.7.5供水系统 3.7.6供气系统 3.7.7供电系统 4全厂车间布置概况 4.1厂址选择 4.2车间布置 参考文献 致谢 错误!未定义书签。附录 1.种子罐设计 2.发酵罐设计 3.车间布置图 4.工艺流程图 5人乳头瘤病毒(HumanPapillomaVirus,HPV)是子宫颈癌形成的原因，由德国科学家哈拉尔·德祖·尔豪森(HaraldzurHausen)在2008年发现，哈拉尔也因此获得当年诺贝尔生理及医学奖，同时也为HPV疫苗的研究及应用打下了坚固基础。本设计疫苗为基因工程疫苗，是将大肠杆菌经过基因重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因重组到其中，经培养后，提取、纯化所表达的保护性抗原制成的疫苗。1.1.1人乳头瘤病毒的危害人乳头瘤病毒是通过性传播的病毒[1],是宫颈癌发生及发展的主要致病因素。宫颈癌的发病率是女性生殖系统恶性肿中的第二位，也是全球第四大常见致死癌症[2],每年约有25万人死于宫颈癌，且发病率及致死率呈逐年上升的趋势[3]。2015年中国恶性肿瘤发病约392.9万人，其中11.1%为子宫颈癌，位居我国恶性肿瘤发病第八位，每年有近10万宫颈癌新发病例和3万死亡病例。目前，被发现的HPV基因型有200多种，可分为高危类型和低危型，但仅有少数高危型是HPV16/18/31/33/35/39等为最常见的高危型，其中由HPV16型和HPV18型感染的宫颈癌占所有由高危型感染的宫颈癌的发病率71%[5]。1.1.2人乳头瘤病毒疫苗研究进展及市场HPV属乳头瘤病毒科，由外壳蛋白包裹基因组构成，病毒基因组为7900bp的双链闭和环状DNA分子，可分为早期编码区(E)、晚期编码区(L)及非编码区(LCR)[6]。L区又可分为L1基因(编码主要结构衣壳蛋白)和L2基因(编码次要结构衣壳蛋白)。HPV感染的预防性疫苗目前以L1蛋白作为主要成分组蛋白被认为是未来治疗性疫苗的重要组成部分[0,已有许多实验室在研究，但目前获得显著成绩较少。虽然宫颈癌有较高的发病率和致死率，但同时也是最容易预防的恶性肿瘤之一，且目前被认为是唯一可以预防的癌症。最先获得批准用于临床试验的是美国默克公司Gardasil和英国葛兰素史克Cervarix两种四价预防性疫苗在2006年，这两种疫苗相继获批上市在全球100多个国家和地区推广，普遍人群接种后可望预防90%的宫颈癌、外阴癌和肛门癌2007年，澳大利亚成为首个提供免费四价宫颈癌疫苗的国家，促使21岁-30岁女性生殖道疣发生率在五年间下降8.2%[8]。2016年7月18日批准二价HPV6疫苗希瑞适被批准上市，第二年5月18日批准四价佳达修被批准上市，第三年4月29日批准九价佳达修被批准上市。目前国内研发HPV疫苗企业主要包括上海生物制品、北京生物制品、武汉博沃、上海泽润、厦门万泰等。其中由厦门万泰沧海生物技术有限公司得双价人乳头瘤病毒疫苗(商品名：馨可宁)于2019年12月31日获国家药监局批准上市注册申请，2020年1月3日下午，万泰公司已经开始正式生产疫苗，该疫苗是我国首个自主研发生产的重组人乳头瘤病毒疫苗，并于5月起可预约接种。表1.1我国已批准上市的HPV疫苗双价疫苗四价疫苗九价疫苗生产企业葛兰素史克厦门万泰沧海生物技术有限公司默克默克产品名称卉妍康馨可宁佳达修佳达修96(30μg)6(20μg)16(60μg)L1VLP型别45(20μg)含L1序列杆生产细胞株状病毒载体的粉纹夜蛾昆虫重组大肠杆菌酿酒酵母酿酒酵母细胞佐剂500μgASO4A1(OH)3225μgAAHS500μgAAHS注：ASO4是氢氧化铝加上50μg的3—O—脱酰基—4—单磷酰脂质A;AAHS是无定形羟基磷酸硫酸铝；L1是主衣壳蛋白。2人乳头瘤病毒疫苗的生产工艺确定2.1重组大肠杆菌的发酵工艺本设计采用高细胞密度发酵工艺(highcelldensitycultivation,HCDC),通7过提高细菌的发酵密度来优化目标产品的比生产率，具有缩短生产周期、降低生产成本、减少设备投资、提高生产效率、增加生产效益等优点。本设计采用的基因工程菌是重组大肠杆菌，该菌的构建决定了所合成的目的蛋白的生产能力和潜力，但在实际生产过程中有诸多因素可影响该菌的生产能力，如培养基成分、pH值、发酵温度、溶解氧浓度、诱导条件、菌体接种量、补料方式等。2.1.1培养基半合成培养基可适用于大肠杆菌高密度发酵，培养基的组分是最重要的一部分，营养丰富的培养基有利于菌体的生长和产物的表达，但某些过量的营养物质会给菌体的生产和产物的表达带来抑制作用，甚至会造成菌体的自溶。一般情况下，葡萄糖的抑制浓度为50g/L。表2.1碳氮比含量对培养基的影响碳氮比含量影响①促进乙酸的代谢与合成偏高②菌体繁殖数量减少③代谢不平衡①菌体生长旺盛偏低②菌体提前进入衰退期③产物积累偏少无机盐是维持菌体新陈代谢的重要成分，一般情况下，无机离子对大肠杆菌的抑制浓度为：氨(3g/L)、Fe²+(1115g/L)、Mg²+(817g/L)、PO₄³-(10g/L)、Zn²+(0.1038g/L)l⁹]。本设计主要采用以下3种培养基。表2.2培养基的组分培养基组分浓度LB培养基g/L发酵基础培养基g/L发酵流加培养基g/L蛋白胨10;酵母粉5;氯化钠10;氨苄西林至75μg/mL蛋白胨15;酵母粉9;葡萄糖5;K2HPO43;微量元素溶液1mL;MgSO40.8(单独灭菌)蛋白胨78;酵母粉10.78;葡萄糖600;MgSO4·7H2O9(单独灭菌)注：微量元素溶液组分：FeSO4·7H2O2.8g,CoSO4·7H202.8g,MnCl2·4H2O2g,CaCl2·2H201.5g,ZnSO4·7H2O0.3g,CuCl2·2H2O0.2g,将上述物质溶于1mol/L煮沸的H2SO4溶液中，并持续搅拌直至完全溶解，除菌过滤。培养基均用注射用水定容，121℃高压灭菌20min。8大肠杆菌最适pH在7.0-7.2之间。合适的酸碱度在菌体培养的过程中能够带来体保持旺盛的生长状态等正面影响，若培养基的pH偏高或偏低都会给菌体的生长繁殖带来诸多负面影响，如菌体失活、胞内蛋白变形等。大肠杆菌的培养过程中主要的副产物是乙酸，该副产物可以使培养基pH下降，对菌体的生长和产物的表达都有抑制作用。同时，氨水作为氮源在发酵过程中也会引起培养环境的酸碱度下降。因此，在高密度发酵培养重组大肠杆菌的过程中，应实时监控发酵罐内pH值的变化，通过及时流加酸或碱来调节培养基的酸碱度，使菌体可以持续处在合适的生长环境。程雪莲[10]等以重组大肠杆菌DALA为实验菌株，研究了该菌株在机械搅拌通风发酵罐发酵过程中前后期pH对产物积累的影响，结果发现，先pH6.5,后pH6.0时产物的积累情况优于先pH6,后pH5.5。2.1.3温度培养环境中的温度高低直接影响菌体的生长密度和目的产物的表达，不同菌种的最适培养温度有所差异，即使是同一菌种在诱导目的产物表达的前后最适温度也也不一定相同。刘斌[11]等通过用IPTG诱导大肠杆菌重组构建BL21-FMDV-B4工程菌株条件的优化发现37℃为最适温度，与35℃条件下诱导的细胞密度差异较大。柴家前[12]等通过实验得出高温有利于提高细菌的密度，而低温有利于目的产物的表达。所以采用不同培养阶段不同的培养温度以此控制菌体密度和提高目的产物的产量。大肠杆菌最适培养温度为37℃,在诱导阶段同样采用37℃,诱导8h{l³]。2.1.4溶解氧浓度大肠杆菌为好氧微生物，影响其生长繁殖的因素中，溶氧浓度为重要因素之一。由于氧在水中溶解度很小，在常温常压下仅9.1mg/L,好氧菌在对数生长期时会快熟繁殖，同时对氧气需求量大幅提升，若供氧不足会导致菌体缺氧死亡等不利影响。在发酵后期，即产物积累时，发酵液粘度上升，造成溶氧减少，若供氧不足，则会造成产物积累减少等不利影响。程雪莲[10]等以重组大肠杆菌DALA为实验对象，研究其在机械搅拌通风发酵罐发酵过程中溶解氧对产物积累的影响，结果显示发酵前期转速500r/min,通气为2vvm,后期转速250r/min,通气量1vvm条件下产物积累情况优于在酵前期转速400r/min,通气量2vvm,后期转速200r/min,通气量2vvm的条件。2.1.5诱导条件基因工程菌在前期构建过程中加入了可诱导的强启动子，在合成目的产物的9过程中利用启动子，目的是为了提高产率。这种操作不同于普通菌的产物合成，通常在菌种培养过程中先进行菌种增殖，提高菌体密度，再进行诱导。获得更多目的产物可体通过提高菌体密度实现。何勇智[14]等用0.5mmol/LIPTG对菌种诱导，结果显示目的产物产量较传统的LB培养基培养提高6倍，同时证明乳糖的诱导效果不及IPTG。陈玉梅[4]等利用重组菌pESUMO-16L1分别实验了诱导剂IPTG的浓度、诱导时的温度、时间及添加时间等，结果显示，诱导剂加入时间差异对L1蛋白的表达量有显著影响，当OD600为0.8~1.0时加入诱导剂的效果比在OD600为0.6时加入的诱导效果要好很多，目的蛋白的产量显著提高不少。同时也发现诱导剂IPTG的浓度变化对重组HPVL1蛋白的表达量影响不大。由于缺少该菌前期的生产优化试验，本设计结合他人文献数据，采用当发酵液D600≥0.8时，加入100mL100mol/LIPTG诱导8h[ll]。2.1.6菌体接种量接种量的计算方式为,接种量的大小决定细菌在培养基中繁殖表2.3接种量的优缺点对比优点缺点①使培养基中营养成分被利用得①菌体前期过快生长繁殖接种量过多接种量过少更充分②限制外来杂菌的生长繁殖，减少生产过程中的污染概率③使菌体提前进入目的产物合成期，缩短培养时间①提高比生长速率，延长对数生长期②营养物质消耗剧增③发酵液变浓稠④溶解氧下⑤降菌体自溶⑥目的产物偏少①不利于产物的合成②延长了生产周期③降低了生产效益因此，在接种过程中应该根据菌体的具体生长情况确定接种量。马永凯[15]等对重组菌株DE3-pEGX6p-1-PFMAP进行接种量优化实验中，利用正交试验优化50L发酵罐发酵条件，结果显示5%(v/v)的接种量为最适接种量。舒畅[10等对发酵产酶的重组大肠杆菌BI21(DE3)/mtg条件进行优化，通过单因素实验法以及利用响应面模型，得出5%接种量下生产酶活为为优化前的1.56由于缺少该菌前期的生产优化试验，本设计结合他人文献数据，采用5%(v/v)接种量。2.1.7补料方式大肠杆菌发酵培养过程中由于大肠杆菌繁殖较快，营养物质会被迅速消耗，所以在生产中通常采用分批补料方式给菌种进行营养物的补充。目前分批补料技术被应用地最多，分批补料技术(fedbatchculture)是指在发酵过程中，对微生物生长所需的某些营养物质进行连续投料，其方法主要包括反馈补料法和非反馈补表2.4高密度发酵培养流加补料方法比较补料方法特点优点缺点反馈恒糖浓度法可监测糖浓度，调节流加速率及时准确费用较高补料恒pH值法操作简单有滞后性恒溶氧法碳源耗尽，溶解氧上升操作简单有滞后性恒速补料非反馈补变速补料料指数补料补料速率不变补料速率改变可控制流加速度，控制一定比生长速率操作简单可调节补料速率可控制抑制物浓度补料目的性差，无法控制比生长速率可变形差可变性差，不能及时调节赵雨等利用基因工程菌E.coilBL21(DE3)pET28+(PyNpase)在发酵体积为5L的高密度发酵中，试验恒pH-补料分批发酵、恒速流加分批发酵、分批发酵三种不同的发酵方式对该菌的生长密度的影响，结果表明恒pH-补料发酵模式为最适合大肠杆菌工程菌的高密度发酵，该模式为pH为6.5,甘油补料35mL/h。结合赵雨等研究成果及表2.4,本设计将采用指数-恒pH值混合流加的补料方式，补料类型为甘油，流速35mL/h。选择原因如下：该补料方式可以根据菌体生长的具体情况及时补充菌体生长所需营养物质，同时能以恒定的特定生长速率适当抑制乙酸等副产品的生成。IPTG加入后，目的产物将快速、大量产生，培养环境粘度上升，且溶氧能力很快达到饱和状态，单位体积的培养基中所能提供给菌体的溶氧量逐渐下降，从而导致菌体合成乙酸和葡萄糖。此时，反馈控制恒定pH值可以根据环境中pH的细微变化迅速地调节pH值，减轻甚至抑制副产物乙酸的积累，有效地提高菌体密度和外源性蛋白的表达。2.2蛋白质的纯化工艺蛋白质纯化的意思是变性蛋白的纯化，纯化是为了去除非目的蛋白，提高产品纯度。工业生产中常采用操作简单、成本低廉的稀释复性，但由于其复性后体积较大，复性体系组分复杂，所以再上一步工艺中需要充分考虑蛋白浓缩和纯化方法的选择，例如菌种在基因编辑中加入特定基因序列。2.2.1菌体的收集在实验室试验阶段中少量菌体菌体的收集一般采用离心机梯度离心，但在生产过程中梯度离心耗时长、单次离心菌液少、成本较高，无法满足大批量生产需求。目前市场上已有连续式离心机，但受到运行参数、离心力、能耗、早期投资等多方面限制，导致该技术无法在现实生产中得到推广和广泛应用。随着工艺技术的不断提高，切向流过滤(TFF)系统目前正在进入生产过程。TFF是一种能够有效的分离液固混合体系的方法，它能解决单向过滤堵塞膜孔的问题。当采用TFF时，大部分处理液流动方向为平行膜表面且保持较高流速，而不是垂直通过膜结构(如图2.1所示)。除了水处理应用外，沿膜表面只有一小部分切向流会被渗透。以从培养液中分离细胞为例，单次操作渗透液约占1%~5%,95%~99%将成为保留液通过系统内输送至处理容器再次快速、平行流过膜结构，形成一种连续的过滤操作。但TFF也有局限性，需结合离心设备去除几乎所有发酵液，提高菌体收集率。滤液滤液滤液滤液滤液图2.1中空纤维切向流过滤示意图2.2.2菌体的洗涤本设计将浓缩后的菌液采用离心机在4℃、3000rpm的条件下离心10min,收集沉淀，将收集好的菌泥用PBSBuffer溶液反复重悬3次。2.2.3包涵体的破碎本设计采用高压均质机对包涵体进行破碎处理，步骤大致为：均质机清洗→加入菌液→待均质均质机出口送料后设定压力→重复均质次→均结结束后料液排空最后将收集好的破碎菌液在4℃、1000rpm的条件下离心20min,弃上清，收集沉淀。2.2.4包涵体的溶解解液边用玻璃棒搅拌、移液器不断搅拌吹打至终浓度达到10~20mg/mL,室温放置15min使包涵体可以充分在裂解液中溶解。溶解完全后的液体需通过滤纸过滤掉少数难溶物质，保证裂解液的澄清，所收集的滤液为粗提蛋白，需保存在≤-20℃备用或进入下一工段。2.2.5HP亲和层析宋浩[17等对重组大肠杆菌诱导生产的蛋白LT-A进行包涵体复性液亲和层析，镇柱使用HP5mL柱和Crude5mL柱各上样400mL包涵体稀释复性液浓缩液，流速5mL/min,结果发现使用Crude镇亲和柱时穿出液中蛋白含量较高，所以Crude亲和柱对蛋白的亲和力不高，同时在利用300mM咪唑洗脱时只有少量蛋白洗脱。相反，再利用HP柱时，穿出液中蛋白含量较少，利用300mM咪唑洗脱时可将所有蛋白洗脱。综上，HP亲和柱比Crude更适合作为蛋白的亲和层析纯化。使用HP亲和柱的收率为75.3%。步骤大致为：装柱→柱填料平衡→上样→洗脱蛋白→洗涤柱体详见《生物化学实验手册》。2.2.6包涵体的复性纯化后的蛋白在尿素中处于变性状态，需要对其进行复性。本设计采用在4℃下快速加入1倍样品体积的复性Buffer,全复性过程需要再磁力搅拌器下进行，保证复性液得到充分搅拌。2.2.7去盐浓缩本设计采用电渗析脱盐系统的浓缩设备对复性液进行去盐浓缩。该设备是利用带电离子膜的反离子迁移原理，以电位差为驱动力，在直流电场作用下，将带电离子从电子元件中分离出来的膜工艺。2.3冷冻干燥工艺冷冻干燥是把物质中的水分通过凝固再升华去除，而物质本身保留原有骨架李冰[18]等利用丝胶蛋白粉进行冷冻干燥、喷雾干燥两种干燥工艺的对比实验，结果发现，冷冻干燥过程复杂、耗时长、能耗高，且单次处理量少，只适合实验室操作，不适合在生产中应用。而喷雾干燥过程简单、耗时短，兼具可连续进料、处理量大和成本低廉、设备简单、可在生产中应用等特点。本设计采用喷雾冷冻干燥工艺处理蛋白浓缩的液，干燥过程为先浓缩后干燥。浓缩条件为在50～60℃,0.1MPa,真空浓缩至约100mL。然后进行喷雾干燥，出风温度控制在65～95℃之间。2.4疫苗的灌装工艺(1)将两种干燥好的蛋白质按比例混合，并加入佐剂，A1(OH)₃;(2)预充注射器包装上贴签、装盒。2.5各项指标检测疫苗主要成分为具有免疫活性的物质。在疫苗的生产过程中，所使用到的材料的来源和种类都各不相同，并且生产工艺复杂同时易受多种因素影响，所以在实际的生产过程中应该做到对每一个工艺环节以及每个工艺所使用到的每一种材料进行质量控制，并且根据实际生产状况制定出适用于生产的质量控制标准。表2.5各阶段检测项目菌种培养的过程中培养物收获后疫苗成品细菌纯度菌体纯度疫苗鉴别细菌总数培养基pH值培养基耗氧量细菌总数活菌含量抗原含量疫苗理化测定疫苗纯度测定疫苗效力测定疫苗异常毒性检查疫苗无菌检查疫苗细菌内毒素检查疫苗中工艺杂质残留物2.5.1蛋白无菌检测取待测蛋白样品各5份，按照1:50的比例将样品接种至T.G培养基中，置37℃培养3天，培养完成后按照表2.6完成后续检测。表2.6无菌检测后续操作方法TBS小管T.G培养基取样量培养温度培养天数理应培养结果无菌生长2.5.2蛋白纯度检测取20μL蛋白进行SDS电泳，方法按照《分子克隆实验指南》(第三版)聚丙烯酰胺凝胶电泳方案操作。目的蛋白纯度应不低于90%。2.5.3蛋白浓度检测本设计采用BCA蛋白浓度测定试剂盒微孔酶标仪法检测蛋白浓度，方法以2.5.4蛋白内毒素检测本设计采用内毒素检测试剂盒凝胶法检测抗原中内毒素含量，方法以试剂盒分别将HPV16蛋白和HPV18蛋白用包被缓冲液稀释，加入96孔板中培养；加入室温封闭；加入稀释的血清样本、标准品及阳性质控血清室温孵育；加入HRP标记的羊抗人IgG室温孵育；加入底物显色液，显色30min;用0.18mol/L硫酸终止显色反应。于酶标仪450nm波长处读取A值。以阴性血清及阳性血清注：除终止显色反应外，每步操作前均需要用PBST充分洗涤样品。将诱导完成后收集的菌液，进行SDS分析，确定目的蛋白的表达，方法按照《生物化学试验手册》聚丙烯酰胺凝胶电泳方案操作。2.6工艺流程实输室踏段菌种菌种扩大培养发牌阶段发肺滞清发酵语实消发酵藏发酵霾蛋白趣样纯化阶段洗涤。破碎包涵体溶鲜亲和服析包涵体整性。浓雄真空冷冻干煤取样检润阶段无葡检测纯度检测浓度检测类毒素检测活性检测表达与WB检测灌装阶段两种蓝白混合加入佐剂贴签装盒图2.2工艺流程图3工艺计算3.1工艺基础数据根据车间生产要求，该车间所设计的人乳头瘤病毒疫苗的生产能力为50万支，每支含有40μgHPV16重组蛋白、20μgHPV18重组蛋白、210μg铝盐，Al(OH)3,为预充注射器包装，剂型为注射剂，规格为60μg/0.5mL/支。即需要16型重组蛋白20000mg,18型重组蛋白10000mg。按照全年365天计算，放假和大中修理等特殊情况约共45天。则全年工作日365-45=320d为了达到生产目标则每天的生产能力为：16型重组蛋白2000÷320=62.50mg/d18型重组蛋白1000÷320=31.25mg/d全天24小时不间断工作则每小时的生产能力为：16型重组蛋白62.50÷24=2.604mg/h18型重组蛋白31.25÷24=1.302mg/h生产工艺属于间歇式生产工艺，周期为32个小时，则全年的周期为：320×24÷32=240个周期则每个周期的生产能力为：16型重组蛋白2.604×32=83.328mg/周期18型重组蛋白1.302×32=41.664mg/周期已知HP亲和层析的收率为75.3%[11],在包涵体溶解复性阶段收率为14.7%[]、在浓缩阶段收率为90.3%I3.2发酵罐的选型20mg目的蛋白，本设计采用容积约10L发酵罐，填充率为30%,通风发酵。发酵罐参数比例高径比H₀:D搅拌器直径D;相邻两组搅拌器的间距S挡板宽度W挡板与罐壁的距离Bh₄+ho封头高度h其中h₄=(1/4)D当封头公称直径≤2m时，hb=25mm;当封头公称直径>2m时，ho=40mm液柱高度HrHoŋ+ha+液柱高度Hr (η为装料系数)图3.1发酵罐示意图3.2.1发酵罐台数的确定D一罐内径D一搅拌游直径S一和邻两组搅件器的距H—雄总高度H—倾柱高度H一液柱高度C一下组搅拌路与罐底距商W—当板觉度B—挡板与罐壁的部离h一坩头高度h₂一封头短书籼高度九一坩头直达高度发酵16型重组蛋白所需发酵罐数量：发酵18型重组蛋白所需发酵罐数量：3.2.2主要尺寸的计算圆柱部分体积V1:椭圆形封头体积V2:(式1)(式3)H₁=H₀η+h₄+h₀(式4)发酵罐参数数值发酵罐直径D(mm)相邻两组搅拌器的间距S(mm)封头短半轴高度h₀(mm)封头直达高度h(mm)圆柱部分体积V₁(L)植圆形封头体积V₂(L)3.2.3发酵罐冷却面积的计算本设计发酵罐选用的换热器为内部竖式列管换热器。20℃,冷却水出水温度约30℃,发酵液温度37℃,发酵液比热容c=4kJ·kg¹.℃¹,发酵液装液量V:V=10L×30%=3L放出热量Q:Q=mcAt=Ve△t=473.34kJ·h-¹(式5)(式6)换热面积F:3.2.4发酵罐搅拌器的设计为了最大程度增加溶氧量，本设计采用六直叶圆盘涡轮搅拌器，搅拌器直径D;=57mm。(1)搅拌器主要尺寸搅拌器叶宽K:K=0.2D=28.5mm搅拌器圆盘直径R:(2)转速转速采用150rbp/min。3.2.5发酵罐设备结构的空气分布器本罐使用单管进风。3.2.6发酵罐的密封方式本罐采用双面机械密封方式，处理轴与罐的动静问题。3.2.7发酵罐设备材料的选择设备采用1Gr18Ni9Ti制作。3.2.8发酵罐支座的选择因发酵罐较小，可选用支承式支座。支承式支座实际承受载荷Q:其中水平力P:P=am,g+0.25Pv(式8)其中水平风载荷Pw:式8、9、10中：k一不均匀系数，安装3个支座时支k=1;m₀一设备总重量(包括壳极基附件，内部介质基保温层温层的质量kg;3.3种子罐的选型本设计发酵罐接种量为5%,每周期运作30个填充率为30%的10L发酵罐，则至少需要4.5L种子液，因此可采用容积约10L发酵罐，填充率为50%,通风按照表3.1对发酵罐进行相应的设计。3.3.1种子罐台数的确定3.3.2主要尺寸的计算椭圆形封头体积V2:罐的全容积V0:液柱高度HL:H₁=H₀η+h₄+h₀表3.2计算得种子罐参数及尺寸(式1)(式2)(式3)(式4)发酵罐参数数值员柱部分高Ho(mm)发酵罐直径D(mm)搅拌器直径D;(mm)挡板宽度W(mm)挡板与罐壁的距离B(mm)相邻两组搅拌器的间距S(mm)封头短半轴高度h₄(mm)封头直达高度h,(mm)圆柱部分体积V₁(L)椭圆形封头体积V₂(L)液柱高度Hr(mm)3.3.3种子罐冷却面积的计算本设计发酵罐选用的换热器为内部竖式列管换热器。平均温差为：发酵液装液量V:V=10L×50%=5L放出热量Q:Q=mcAt=Vpe△t=7889kJ·h¹换热面积F:(式6)3.3.4种子罐搅拌器的设计为了最大程度增加溶氧量，本设计采用六直叶圆盘涡轮搅拌器，搅拌器直径D;=57mm。(3)搅拌器主要尺寸搅拌器叶宽K:K=0.2D=28.5mm搅拌器圆盘直径R:δ=8mm(4)转速转速采用150rbp/min。3.3.5种子罐设备结构的空气分布器本罐使用单管进风。3.3.6种子罐的密封方式本罐采用双面机械密封方式，处理轴与罐的动静问题。3.3.7种子罐设备材料的选择设备采用1Gr18Ni9Ti制作。3.3.8种子罐支座的选择其中水平力P:其中水平风载荷Pw:Pw=1.2fq₀D₀H₀×10(式10)式8、9、10中：D—支麻安装尺寸，nm,D=2s₂;g—重力加速度，取g=9.8m/3;k—不均匀系数，安装3个支座时支k=1;m₀一设备总重量(包括壳极基附件，内部介质基保温层温层的质量kg;n—支座数量；a—地震影响震影响根据式8、9、10可得出Q=12.015kN。由JB/T4712.4-2007表2查A型支座允许载荷[Q]=20KN。经计算，结果所选支座满足需求。3.4原料消耗计算3.4.1每周期消耗培养基计算由3.2.1可知每周期共需要30个10L发酵罐。表3.1每周期消耗培养基的量培养基名称计算方式培养基成分含量(g)摇瓶种子培养基接种量5%,每周期运作30蛋白胨个发酵罐，按5%的损失计酵母粉算，则需要4.725L/周期氯化钠发酵基础培养基每个发酵罐装液量为30%,损失量为5%,则需要94.5L/周期蛋白胨酵母粉葡萄糖微量元素溶液流加培养基平均流加速度为80mL/h,共发酵2h,损失量为5%,则需要5.04I流加速度35mL/h,诱导8h诱导前诱导后蛋白胨酵母粉葡萄糖MgSO4·7H2O甘油微量元素溶液每升发酵基础培养基需要1mL微量元素溶液，每周期需要94.5L发酵基础培养基，损失量为5%,则需要100mLFeSO4·7H2OMnC12·4H2O3.4.2原料消耗汇总表表3.2每周期原料消耗汇总表试剂名称每周期用量葡萄糖氯化钠酵母粉蛋白胨甘油MgSO4MgSO4·7H20K2HPO4FeSO4·7H2OCoSO4·7H2OMnC12·4H2OCaC12·2H2OZnSO4·7H2OCuC122H2O928.625g0.2800g0.2800g0.2000g0.1500g0.0300g0.0204g3.5热量衡算生产工艺中需要消耗能量主要在发酵过程，其他流程消耗热量较少，不进行3.5.1发酵工艺热量计算(1)种子罐罐空消蒸汽用量(2)种子罐实消蒸汽用量经过发酵罐实消，发酵液温度为121℃,发酵液起始温度(室温)为25℃,Q=cm△t=1.815x10kJQ=1.2Q=2.178×10°kJ(3)发酵罐空消蒸汽用量V=300×0.5×(127-20)÷(2706580-533.83×4.186=20.615kg(4)发酵罐实消蒸汽用量经过发酵罐实消，发酵液温度为121℃,发酵液起始温度(室温)为25℃,已知发酵液比热容c=4kJ·kg¹.℃¹,则发酵液从25℃加热到121℃所需要吸收的Q=cmAt=1.089×10°kJQ=1.2Q=1.306×10°kJ通过查表可得0.2MPa的饱和水蒸气，温度121℃,汽化潜热值r=22017kJ/kg,则水蒸气消耗量m已知种子罐填充率50%,通气速率1vvm,可得种子罐无菌空气量V:V=种子罐体积x通气速率x填充率=5×10⁴m³/h(式11)已知发酵罐填充率30%,通气速率1vvm,可得单罐发酵罐无菌空气量V:(式12)V=发酵罐体积x通气速率x填充率=3×10*m³/h(式12)3.6其他主要设备选型3.6.1高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅选用双扉灭菌柜，干热、湿热各一台，其主要参数如下表：(1)双扉式干热灭菌柜的选型干热灭菌柜选用南京维钢机械科技有限公司的DMH系列双扉式干热灭菌柜，其主要参数如下：参数工作室尺寸外形尺寸加热功率循环风机功率排湿、冷却风机功率温度范围重量配套电机主要材质800×800×1000(mm)1850×1200×1950(mm)250W+250W室温-350℃(可调)不锈钢316L,外不锈钢304-2B(2)湿热灭菌器的选型湿热灭菌器选用河南省汇邦医疗器械有限公司的SQ-Z60大型脉动蒸汽灭菌器，其主要参数如下表：参数容积产品形式加热方式功率电源外形尺寸内胆尺寸重量设计压力额定工作压力设计温度工作温度脉动次数立式电加热1190×810×1580(mm)①500*1000(mm)0-99次3.6.2切向流过滤系统切向流过滤系统选用美国Cytiva的GEÄKTAMflux全自动切向流过滤系统，设备如下图：3.6.3去盐浓缩设备去盐浓缩设备选用德兰梅勒的电渗析除盐系统浓缩设备，设备如下图：3.6.4离心机的选型离心机选用湖南湘仪离心机仪器有限公司的高速冷冻离心机H2500R-2,其主要参数如下表：参数H2500R-2支持电源温度精度最高转速总功率最短加/减速时间最大相对离心力整机噪声转速精度最大容量外形尺寸(长×宽×高)转子识别定时范围外包装尺寸(长×宽×高)净重温度设置范围AC220±22V,50Hz,25A25000r/min64800xg<62dB(A)4×1000mL730x930x960(mm)/lmin～99h:59min920×1040×1560(mm-20～40℃离心腔直径3.6.5高压均质机高压均质机选用上海巴崴奥商贸有限公司的M-110EH高压微射流均质机，其主要参数如下：参数M-110EH最高处理压力最大流量最高进料温度电源要求仪器管路压缩空气要求样品最小加入量机器尺寸重量30000psi(172MPa)450mL/mir3Ph,380V,5HP(3.7KW)压力为35-150psi,在50psi压力下流量为1SCFM,露点温度为0-35F73×87×148cm3.6.6喷雾冷冻干燥机喷雾冷冻干燥机选用无锡市精诚粉体机械有限公司的YPG-50压力喷雾干燥机，其主要参数如下：参数YPG-50进风温度排风温度水分蒸发量加热方式干燥塔直径外形尺寸70-110℃高压蒸汽或蒸汽+电6×4×133.6.7粉针剂分装机粉针剂分装机选用长沙一星制药机械有限公司的预充式注射器准全自动灌装机YCF2(2)Z型，其主要参数如下：参数YCF2(2)Z型适用规格生产能力灌装头数加塞头数预消毒注射器、卡式瓶0.5-20ml2个2个灌装泵控制及驱动方式灌装精度加塞合格率电功率机器重量外形尺寸陶瓷转阀泵伺服数控控制系统(全伺服型)(含层流罩)2500mm×1200mm×2400mm(L×W×H)(含层流罩)3.7辅助部门3.7.1理化分析室理化分析室用于蛋白纯度检测、浓度检测、毒素检测、活性检测、表达与Westernblot检测。3.7.2微生物实验室微生物实验室用来分析菌种的纯度，以及蛋白的无菌检测。3.7.3原料仓库菌种的保藏有严格的环境要求，应额外设置一个仓库满足菌种保藏的需求。3.7.4成品仓库成品仓库应建于生产车间内的一个独立房间，避免污染。3.7.5供水系统本设计的工厂用水有为下面几处：(1)生活用水；(2)消防用水；(3)生产工艺过程用水；(4)化验用水；(5)设备清洗用水。工厂用水需要以经济合理为原则，首要考虑安全性。由于本设计为药品生产工厂，诸多步骤需要使用到去离子水等，因此还需专门的制水设备，同时需要监控好水质。3.7.6供气系统本设计所使用的天然气由当地天然气公司供应，理应供应压力为0.1MPa。天然气的作用在本设计中占据非常重要一部分，如种子罐、发酵罐的空消和实消等。所以本设计设计在车间内设立分气缸，以便满足各生产流程的需求。3.7.7供电系统本设计所使用的电由当地供电局提供，理应供应为高压供电，由于车间设备最大电压为380/220V,所以需设立配电房将电压降低在输送至各车间。4全厂车间布置概况厂房的运行需要GMP认证，在GMP认证检查中，厂房的工艺布局为重要检查项目之一。WHO的GMP对厂房要求的原则是以下三点：①厂房选址②设计③施工、改造和保养适合生产操作。厂房的布局必须服从以下三点：①低危险性②无交叉污染③能有效地清洁和保养。为了避免产品质量在生产的各个阶段均无负面影响，《药品生产质量管理规范(1998年修订)》(即GMP)中的第九条明确指出：“厂房应按生产工艺流程及所要求的空气洁净级别进行合理布局”。这一条例是要求厂房的工艺布局须在人流、物流均无交叉且互不干扰的前提下按照生产工艺流程