临床检验免疫学

临床检验免疫学

一.绪论

免疫学教学内容

1.基础免疫学（Basicimmunology）

相关内容：抗原、抗体、补体、细胞因子、HLA、免疫系统、免疫应答。以免疫应答为中心。

2.临床免疫学（Clinicalimmunology）

1）抗感染免疫（Infectionimmunology）

2）超敏反应（Hypersensitivity）

3）自身免疫（Autoimmunity）

4）肿瘤免疫（Tumo门mmunology）

5）移植免疫（Transplantationimmunology）

3.免疫学实验技术（immunologicaltechniques）即：免疫学检验，根据免疫学基本理论建立起来的试验方法

二.抗原抗体反应

抗原抗体反应是抗原和相应抗体之间所发生的特异性结合反应，这种结合具有高度特异性，它既可以发生

在体内，也可以发生在体外。

发生在体内的抗原抗体反应，是机体体液免疫效应的表现方式，具有溶菌、杀菌、中和毒素及调理吞噬的

作用。

发生在体外的抗原抗体反应，根据抗原的物理性状（可溶性Ag或颗粒性Ag）及参加反应的物质不同，可分

为：沉淀反应、凝集反应、中和试验及补体参与的反应等

由于抗体都来自于血清，因此，我们将体外的抗原抗体反应又称为血清学反应。

本章讲的抗原抗体反应就是指发生在体外的抗原抗体反应

抗原抗体反应原理

l.Ag>Ab能特异性结合（内因）：

Ag、Ab能特异性结合，是由于Ag表位（抗原决定簇）和AbV区之间的特异性结合，二者在空间结构上是

严格互补的。

2.Ag、Ab结合的动力（外因）：

静电引力（又称库仑引力）：它是指抗原和抗体分子上带有相反电荷-NH3+或-CO。一之间的相互吸引力。

例如Ab分子上赖氨酸离解层中含有-NH3+,Ag分子上天门冬氨酸离后含有-C。。，这两者之间就可相互吸

引而产生静电引力。

该力的大小与两个电荷间距离的平方成反比。距离越近，静电引力就越强。

范得华力（又称电子云力）：该力是原子与原子、分子与分子间所具有的一种吸引力。当Ag、Ab两分子外

层轨道上的电子相互作用时，电子云由于偶极摆动而产生吸引力，从而促使Ag、Ab的结合。该力大小小

于静电引力。

氢键:该力是由于分子中的H原子和电负性较大的O、N、S原子间的相互吸引而形成的。Ag（-NH2、-COOH、

-OH、-SH）、Ab（-NH2、-COOH>-OH、-SH）可形成氢键桥梁，促使Ag、Ab的结合。

氢键对于维持生物大分子<AgAb）的形态和结构有重要作用。它的大小大于范得华力。

疏水作用力：A?是蛋白质，Ag少数是多糖，多数也是蛋白质，那么它们就是胶体物质，在水溶液中就带

有-NH3+或-COCF极性基团，从而带上正电或负电，成为亲水胶体。当Ag表位和AbFab段相互靠近时，亲

水层消失，排斥掉两者间的H20分子，促进Ag、Ab的结合。疏水作用力在整个Ag、Ab反应中提供的作

用最大。

在高浓度电解质（如NaCI等）存在的条件下，NaCI可先与Ab分子结合（在Ab未与Ag相遇时），排斥H2。

分子，从而使Ab蛋白质优先沉降，称为盐析现象

由于抗原抗体反应不含有共价键，因此抗原抗体反应不为化学反应，不产生新的物质。

Ag+Ab-*AgAb

抗原抗体反应特点

1.特异性：

Ag、Ab的结合实质上是抗原表位和抗体可变区之间的结合。Ab可变区可形成一个平穴槽，Ag则楔状

嵌入，由于两者在化学结构和空间结构上的互补，使得它们的结合具有特异性。这种结合如同钥匙与锁的

关系，一把钥匙只能开相应的一把锁.

交叉反应（cross-reaction）一抗体对,具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反应称为交叉反应。

交叉反应并没有违背Ag、Ab特异性结合的原则，其产生的先决条件是不同抗原之间存在共同Ag表位。

交叉反应的意义：

1.帮助免疫学诊断：eg外斐氏反应等:用变形杆菌0X19、0X2、OXk作抗原查血清抗体，诊断斑疹伤寒（立

克次氏体感染所致）

2.可造成免疫病理损害：eg链球菌感染后易导致肾小球肾炎，其原因为链球菌与人体肾小球基底膜有共同

Ag表位所致。

2.比例性:

Ag、Ab的结合并不是在任何比例下都进行得充分、完全的。要形成我们肉眼可见的反应（如沉淀、凝集

现象等），就涉及到最适比例问题。

以沉淀反应为例：在一排试管中加入等量的Ab,然后依次向各管加入递增量的可溶性Ag,根据形成的沉

淀物及抗原抗体比例可见：（图）

①：Ab过剩区，又称前带，此时，上清液中Ab过剩，大多出现的是可溶性抗原抗体复合物。

②：Ag过剩区，又称后带，此时，上清液中Ag过剩，大多出现的也是可溶性抗原抗体复合物。

③：是Ag、Ab合适比例范围，又称等价带。在这一带中，Ag、Ab反应充分，形成的沉淀物快而多；其中

有一管Ag、Ab反应速度最快、形成的沉淀物最多，上清液中几乎没有游离的Ag或Ab存在。这时候，抗

原抗体之间的比例称为最适比（顶点处）。

利用沉淀反应对不同来源的抗血清比较后，发现抗体根据等价带范围不同可分为两种类型：

①R型抗体：它以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只有在Ag过剩时;才出现可

溶性抗原抗体复合物。大多数小动物的免疫血清属于该类型。

②H型抗体：它以马免疫血清为代表，抗原抗体合适比例范围较窄，在Ag、Ab过剩时，都可出现可溶性

抗原抗体复合物。人和多数大动物的免疫血清属于该类型。

3.可逆性：

Ag、Ab结合形成抗原抗体复合物，这一过程是一个动态平衡，在一定的条件下，反应是可逆的：Ag+Ab-

AgAb,其主要原因为Ag、Ab结合是非共价键结合，不为化学反应。

抗原抗体反应的影响因素

自身因素：

1.Ag：与Ag的理化性质、抗原表位的数目及种类有关；

2.Ab：与Ab的来源有关：是R型抗体或H型抗体；与Ab的特异性、亲合性有关；与Ab的浓度有关。

外界环境条件：

1.电解质：一般实验室所用电解质都是生理盐水（0.9%NaCI）,浓度不能过高。浓度过高，会使Ab蛋白

质优先沉淀而出现盐析现象。

2.PH：一般为PH6-8,当PH<3时，可出现颗粒性的非特异性凝集，称酸凝集；当PH过高，可造成碱变性。

3.温度：抗原抗体反应的常用温度为37。Co

抗原抗体反应的类型

分5大类型：

沉淀反应；凝集反应；补体参与的溶血反应、补体结合试验；中和试验；免疫标记技术。

思考题：

1.抗原抗体反应的原理

2.抗原抗体反应的特点

3.影响抗原抗体反应的主要因素

4.抗原抗体反应分哪些种类？

5.什么是交叉反应，有无特异性，为什么？在临床工作中有何意义？

三.沉淀反应（precipitationreaction）

概念：可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质存在，两者比例恰当时，可出现肉眼可见的沉淀现象。

Ag沉淀原Ab沉淀素（precipitin）

实验中为使抗原抗体比例（数量）恰当，应稀释Ag

颗粒性抗原：光镜下可见，肉眼观呈浑浊悬液，如细菌、RBC等。-凝集反应

可溶性抗原：光镜无形态，肉眼观呈澄清透明，如血清蛋白溶液、多糖抗原等。一沉淀反应

分类：

液相沉淀：絮状沉淀试验、环状沉淀试验、免疫比浊测定法

凝胶扩散：双向琼脂扩散试验、单向琼脂扩散试验等

凝胶免疫电泳：免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳等

一.液相沉淀反应

（-）絮状沉淀试验（flocculation）：抗原抗体结合，在电解质存在的情况下出现絮状/块状沉淀。既可在试

管内进行，也可在玻片上进行。

用于：玻片法常用于定性测定试管法:半定量测定

在沉淀反应前，应测试抗原、抗体最佳稀释度，一般采用方阵滴定法。

（二）环状沉淀反应

方法：在环沉管（0.2X3cm）中进行。先加抗体，后加抗原。静置30分钟后观察在Ag、Ab交界处是否有

白色沉淀环，若有，为阳性）。

用途：多用于测抗原（法医学上血迹鉴定等）

（三）免疫浊度法（immunoturbidimetry）

原理：免疫比浊实验是在一定量的Ab中加入递增量的Ag,反应一段时间后，形成可溶性AgAb复合物,

此复合物在PEG作用下，自液相析出，形成微粒，使检测浊度发生改变，用浊度计检测相应浊度，浊度高

低与复合物含量成正比。绘制标准曲线，根据浊度推算样品中Ag含量。

1.免疫透射浊度测定法

原理：缓冲液中，先加入已知过量Ab,然后加入待测Ag,AgAb复合物的量随Ag量的增加而增加，反应

液的浊度亦随之增加，与一系列标准品对照，即可算出未知Ag含量。

优点：

该法操作方便、检测快速。临床上多用于检测IgG、IgA、IgM、C3、C反应蛋白（CRP）等。

缺点：

反应时间长，加促聚剂PEG。所需Ag/Ab量大。

2.免疫胶乳浊度测定法

原理：将已知Ab吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应Ag时，使胶乳颗粒发生凝集，减

少透光度。透光度减少程度与胶乳凝聚成正比，当然也与Ag量成正比。

本法不易选择适用的乳胶，同时Ab与胶乳结合也困难。

二.凝胶扩散（agarimmunodiffusion）

在凝胶中进行的沉淀反应

凝胶扩散试验：可溶性抗原与相应抗体在电解质存在下，在琼脂基质中扩散，当两者相遇，比例恰当时结

合，可出现肉眼可见的沉淀线。

（一）双向琼脂扩散试验（简称双扩doubleimmunodiffusion）

方法：制琼脂板（3ml1.5%NS琼脂）

打孔（双孔型/三角孔型/梅花孔型）

加样（平孔沿加满）

扩散（37C、24h观察结果）

优点：简单、易行，用途广

用途：

1.已知Ag或Ab测未知Ab或Ag：双孔型

2.抗原性质分析：三角孔型

3.测Ag有效稀释度：梅花孔型

缺点：敏感性低、出结果慢、只定性，不能定量

（二）单向琼脂扩散试验（简称单扩singleimmunodiffusion）

方法：已知Ab+琼脂制板、打孔-一在琼脂板小孔中加梯度Ag--Ag向四周扩散形成沉淀环--Ag浓度与

沉淀环直径呈线性关系，绘制标准曲线一一从标准曲线上查出并计算出待测标本含量

用途：定量测定，如测IgG、IgA、IgM、C3等含量

三.凝胶免疫电泳（agargelimmunoelectrophoresis）

在电场作用下的凝胶扩散

电泳技术：带电胶体颗粒在电场中向相反电极泳动，利用电泳现象研究某些化学组分的分离技术。

免疫电泳技术的优点：

1.加快反应速度

2.规定了抗原、抗体扩散方向，提高反应敏感性

3.可将某些带电性不同的组分分开，再进行抗原抗体反应

影响电泳的因素：

1.与溶液的pH有关：常用pH8~9,蛋白质带负电

2.与溶液离子强度有关：愈高，泳动慢，一般0.02~0.2M

3.与电场强度有关：愈高，愈快，一般4~6v/cm（琼脂长），约40V左右

4.电渗作用的影响

电渗作用：电场中液体对于一固体的固定相对移动的现象。电渗方向与电泳方向相反。

（一）对流免疫电泳（counter-immunoelectrophoresis）

原理：定向加速的免疫双扩（双扩+电场，使抗原、抗体相对泳动）

方法：抗原、抗体分别在琼脂板上不同孔内，抗原在负极端，抗体在正极端，电泳。

电压：4~6v/cm（琼脂长度）

电泳时间：45分钟~1小时

优点、用途：耗时短，反应敏感性强。用于HBsAg、AFP等检测

（二）火箭免疫电泳（rocketimmunoelectrophoresis）

原理：单扩+电场，为定量试验

方法：已知Ab+琼脂混合，制板---在玻板一端打孔、加梯度Ag……电泳……根据所知样品悌度含量……

绘制标准曲线一一查出待测样品含量

优点与用途：与单扩相同，已知Ab定量测Ag,但出结果快。

（三）免疫电泳（immunoelectrophoresis）

多用于分析复杂抗原组分

原理：Ag区带电泳+双扩结合

方法：

l.Ag电泳分出区带

2.Ag、Ab免疫双扩

用途：常用于分析复杂Ag的组分。（如人全血清组分的分析）

优点：用样品量小、特异性高、分辨力强

缺点：由于复杂抗原中各成分含量差异大，不能全部显出，敏感性不高。

用途：分析复杂抗原组分；多发性骨髓瘤等疾病的测定

思考题：

1.双扩、单扩、对流免疫电泳、免疫电泳实验的原理，方法，用途。

2.影响电泳的因素有哪些？

四.凝集反应（Agglutination）

概念：细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加入相应抗体，在电解质存在下，两者特异性结合，出现肉眼可见的

凝聚块。

凝集反应应稀释抗体。

Ag凝集原agglutinogen

Ab凝集素agglutinin

分类：

直接凝集反应directagglutination

I间接凝集反应indirectagglutinationorpassiveagglutination

一.直接凝集反应（directagglutination）:

细菌、螺旋体、细胞等颗粒性抗原（抗原是细胞表面结构）在适当电解质参与下，直接与相应抗体结合,

出现肉眼可见的凝集现象。

育榜滞集反应分类•

（-）玻片法：用已知抗体检测未知抗原

玻片凝集试验（定性试验）：

于玻片上先加已知抗体，再加入待测物（未知抗原），混匀。如发生凝聚，说明待测物中有与抗体相对应

的抗原。

用途：ABO血型鉴定、菌种鉴定

（-）试管法：用已知抗原测未知抗体的效价，属半定量试验。

试管凝集试验：

方法：1~9号试管分别加不同稀释度待检血清（容量相同，Ab）,10号加NS（对照），各管再加定量（浓

度、容量一样）的Ag。

结果：以出现明显凝集的血清最高稀释度（即可以判为++者）作为该血清（Ab）的凝集效价。

举例：

1.肥达氏反应（Widaltest）

2.外斐氏试验（Weil-Felixtest）

二.间接凝集反应（indirectagglutinationorpassiveagglutination）

将可溶性抗原或抗体吸附在某种载体（carrier）微球上，使之成为颗粒性抗原或抗体，然后再与相应的抗体或

抗原结合，出现载体微球的凝集现象。

（-）载体要求与种类

要求：不干预免疫反应、颗粒大小均匀

常用载体种类：红细胞（绵羊、家兔、人。型）、活性炭粒、硅酸铝颗粒、聚苯乙烯胶乳颗粒（人工合成

高分子材料）等。

致敏微粒或致敏颗粒：吸附有抗原或抗体的载体颗粒

间接凝集试验命名：根据载体不同而命名。

血凝试验（以RBC为载体）

乳胶凝集试验（以胶乳颗粒为载体）

（二）间接凝集试验的分类：

1.（正向）间接（血、胶乳）凝集试验

原理：将已知的可溶性抗原吸附于颗粒性载体匕检测未知抗体。

2.反向间接（血、胶乳）凝集试验

原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体上，检测未知抗原。

如:反向间接血凝检测HBsAg、AFP等

3.间接凝集抑制试验

原理：待测样本（可溶性Ag?）+已知Ab-+已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性Ag）一观察是否有凝集

现象。

不凝集为阳性，凝集为阴性。

如：用胶乳凝集抑制试验检测尿液中绒毛膜促性腺激素（HCG）

4.协同凝集试验（coagglutination）

原理：实质为反向间接凝集反应。

葡萄球菌A蛋白（StaphylococcusproteinA,SPA）能非特异地与IgG的Fc段结合，当与特异性抗原相遇时，IgG

的Fab段与抗原结合，出现金葡菌的凝集现象（属特殊间接凝集试验）。

协同凝集试验实际是用已知抗体检测未知抗原，可用于多种抗原的检测

沉淀试验与凝集试验的比较

沉淀试验凝集试验

抗原性质可溶性Ag颗粒性Ag

稀释对象抗原抗体

结果现象沉淀现象凝集现象

敏感性低高

思考题：

1.玻片凝集试验和试管凝集试验的区别

2.反向间接凝集试验、间接凝集抑制试验的原理及实例

3.协同凝集试验的原理

4.比较沉淀试验和凝集试验的异同

五.免疫标记技术

用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定

抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少。

免疫标记技术=免疫技术（抗原抗体反应：特异性）+标记技术（示踪物标记：灵敏性）

常用标记物：荧光素、酶、同位素、胶体金、可发光化学物质。

试验命名：根据标记物命名。如：免疫荧光技术、免疫酶技术等

免疫荧光技术（Immunologicalfluorescenttechnique,IF）

原理：用荧光素标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待

测的抗体或抗原。

免疫荧光技术分类：免疫荧光显微技术（定性）

免疫荧光测定技术（定量）

一.荧光、荧光素及荧光显微镜

（-）荧光

一种光照射某种物质时，该物质可发出比照射光波长更长的光称为荧光。照射光:可见光、紫外光

（二）荧光素

能产生荧光的物质，可作为染料。

常用荧光素：

1.异硫氟酸荧光黄（FITC）：可发出黄绿色荧光

2.四乙基罗丹明（RB2OO）：发橘红色荧光

3.藻红蛋白（PE）：发出橙色荧光

（三）荧光显微镜

L结构：主要组成

A.白炽光源（超高压汞灯）：发射紫外光或兰紫光；

B.两组滤光板:激发滤板（选择合适的激发光谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视野，只允许荧

光通过。

C.显微镜：普通的光学显微镜。

光路程序：

白炽光源——发射紫外光or兰紫光——激发滤板——紫外光——被检物（荧光染色标本）——紫外光+荧

光——抑制滤板一-荧光（显微镜下可见）

荧光显微镜据光源路径分类：

透射式（光源从下面经聚光器会聚后到达样品，适用于观察对光可透的标本）

落射式（光源从上面到达样品，经标本反射进入物镜。适用于观察透明度不好的标本及各种活性组织等）

2.使用注意事项：

染色后立即检查（荧光易猝灭）

准备好后开启白炽光源，不能随时启灭。打开后15分钟才能关闭

每次使用2小时

保持室内通风

3.荧光素可以标记（染色）抗原，也可以标记抗体，一般免疫荧光显微技术均标记抗体

二.免疫荧光显微技术

（--）荧光抗体的制备：

纯化的一定量抗体……加-定量FITC（搅拌使结合）---去除游离荧光素---测抗体效价、测荧光素

与蛋白质（Ab）结合比（F/P）——小量分装保存备用

（-）片子的制作：

1.常做切片、涂片、印片，要求薄、均匀，并与玻片充分固定。固定后不能被洗脱。

2.注意保持抗原完整性

3.不同材料固定方法不同（无水已醇、丙醇、聚甲醛等）

（三）荧光抗体染色法

1.直接法

待测标本固定（Ag?）+Ab--洗涤--AgAb

特点：快、直接、干扰因素少。

用于检测抗原。

每检测一种抗原需标记相应的荧光抗体,较麻烦

2.间接法

分两步：

第一步：荧光素标记抗抗体（如荧光标记的羊抗人IgG）；

第二步：已知Ag固定+待测标本（Ab?）——洗涤，+荧光标记的抗抗体——洗涤，荧光显微镜镜检

间接法用得最多

优点：制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测。

灵敏度高

3.补体法：

第一步：荧光素标记抗补体；

第二步：已知Ag固定+待测标本（Ab?）+补体——洗涤，+荧光标记的抗补体——洗涤，荧光显微镜

镜检

特点：灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多种检测

干扰因素多，补体不稳定，易失活，

该法少用

4.双标记法

用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag

有两种相应抗原表位存在时.，可同时见到黄绿和橙红两种荧光。

（四）免疫荧光显微技术优缺点

优点：

1.特异性、敏感性高

2.快速

3.可定位

4.既可测Ag又可测Ab

缺点：

L需要荧光显微镜

2.存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题）

3.定性测定、判断结果不客观

4.制备的片子难以长期保存（荧光猝灭）

三.时间分辨荧光免疫测定（液相检测）

原理：用箱（Eu）等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag,从而检测待测标本中相应

Ag或Ab的新技术。

其特点是：利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特异性干扰荧光。

灵敏度可达0.2~1ng/mL.

思考题：

1.免疫标记技术的原理

2.免疫荧光技术中最常用的荧光素是什么？

3.免疫荧光显微染色的各种方法及优缺点？

4.免疫荧光显微技术的优缺点？

5.荧光显微镜的光源分几种？

六.免疫酶技术(Immunoenzymetechnique)

概述：70年代初在免疫荧光技术基础上建立。较IF、RIA(radioimmunoassay)更优越，具有敏感、安全、稳

定、易观察结果等优点。

原理：利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶

催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质(Ab、Ag)有无及含量多少。

Ag+AbE---AgAbE+底物一呈色反应

免疫酶技术具有：

特异性一Ag、Ab反应

敏感性一能的高效催化作用

两种方法：

酶免疫组织化学染色技术(免疫组化)

酶免疫测定法(酶联免疫吸附实验，

Enzyme-Linkedimmunosorbentassay;ELISA)

常用的酶：

(一)选择酶的要求

1.自然界存在广，易获得

2.易纯化、性稳、活力高

3.形成的酶结合物稳定，并保留醐、抗体或抗原的活性

4.底物来源方便并易保存

5.反应后有色产物能快速测定

6.酶分子量不能太大，太大不易进入组织细胞内，影响组化染色定位

(-)常用的酶：

辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等

辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)：•种铁吓琳蛋白质，分子量4.4万，能进入细胞内。

酶活性强，酶结合物可长期保存。最适pH为5.5左右。选用时注意酶纯度和活性

纯度：RZ表示，反映酶含量与蛋白含量之比，最好要RZ值为3.0左右

活性：每lmg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mg

HRP的底物：邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺(TMB)---反应体系中作为供氢体

DH2+H2O2——D+2H2O

供氢体受氢体HRP有色产物

OPD特点：

有色产物为黄色

空白对照接近无色

敏感度高，有致癌作用

TMB特点：

有色产物为蓝色

无致癌作用

底物系统(包括供氢体、受氢体)临用时配，配后避光保存

酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linkedimmunosorbentassay,ELISA)

一.原理：将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物(酶标记物)，当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形

成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab

的量。

固相载体：聚苯乙烯

实验中所需酶标抗体的制备方法同荧光抗体制备：纯化后的抗体+酶-―-透析去除游离酶---测定酶标抗体

工作浓度

试验中有关术语及试剂：

包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后，不能被洗脱。包被缓冲

液：PH9.6CB

洗涤（wash）：PH7.2-7.4PBS

酶结合物：酶标抗体或酶标抗原

终止液：2MH2SO4

OPD：HRP催化后其有色产物为黄色，H2SO4终止后变为橙色（棕色）

TMB：HRP催化后其有色产物为蓝色，H2s04终止后变为黄色

二.方法类型和操作步骤

（■'）双抗体夹心法

双抗体夹心法步骤：包被已知Ab---洗涤一一加待测标本（测Ag?）一一洗涤---加前标Ab--一洗涤一一

加底物--加终止液---观察结果

特点：该法主要用于检测抗原

包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体

每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦

（二）间接法测抗体

步骤：包被已知Ag+待测标本（测Ab?）——反应一段时间后，洗涤——加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）

——洗涤——加底物——加终止液，观察结果。

特点：该法主要用于测抗体

酶标记一种抗抗体可以用于多种抗体的检测

间接法测抗原：包被抗体……加标本（抗原）---加抗体一加酶标抗抗体

（三）双位点一步法

步骤：包被抗体A+待测标本+酶标抗体B——洗涤，+底物——终止液，观察结果

（检测Ag,Ag至少含A、B两个抗原表位）

特点：该法是一次性加入标本和酶标抗体，试验程序简单，提高了检测的特异性

用于检测Ag,且Ag是具有至少2种抗原表位的多价抗原

反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成

正比（在方法可检测范围内）

（四）竞争法

步骤：

待测管：已知Ab包被+待测标本（Ag?）——洗涤，+酶标Ag——洗涤，+底物——显色

（五）应用亲和素和生物素的EUSA

亲和素（avidin）：糖蛋白，-分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合

生物素（biotin）：维生素H,可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定

三.ELISA结果的判定

（-）肉眼判定

与阳性、阴性对照颜色比较：

1.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性；

2,若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。

3.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；

（二）酶标光度仪检测A492值（吸光率）：比色法

1.与阳性、阴性对照测定值比较

2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0为阴性

P:positive（待测吸光度值）N:negative

四.ELISA试验的影响因素

（1）固相载体

常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。

固相载体：酶标板可分软、硬板。一次性使用，不可回收

酶标板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高

板批间、孔间性能相近

（―）抗原、抗体

Ag：需纯化

Ab：需效价高、亲和力强、纯化

（三）试验条件

1.包被：一般用pH9.6CB（carbonatebuffer）,0.05M,有利于蛋白质吸附

包被浓度：0.1~100ug/ml,一般常用10ug/ml

包被时间、温度：4℃过夜或37℃l-3h

包被量：1003

封闭：用0.1~5%牛血清白蛋白缓冲液浸泡0.5小时

2.抗原抗体反应的条件

（1）微碱性有利于抗原抗体结合，故用pH7.4PBS（phosphatebuffersaline）洗涤

（2）去污剂有利于AgAb形成，洗液中加0.05%Tween-20

（3）Ag、Ab反应时间、温度：一般37℃、30~40min

3.洗涤：采用PH7.2-7.4PBS洗涤，规一化，每次浸泡l~2min,拍干，共洗涤3~4次

4.酶促反应条件：

温度：37℃时间：lOminpH：5.5底物量：一致

5.排除干扰：多设对照

ELISA试验应设对照:

应设对照操作应得结果

阳性对照同标本一样颜色深

阴性对照同标本一样颜色浅or无色

酶结合物对照加酶步加入无色

底物对照加底物步加入无色

空白对照只加终止液无色

（以间接法为例，每孔均已包被Ag）

血清100ul酶标二抗100ul底物100ul终止液100ul

待测标本待测血清+++

阳性对照阳性血清+++

阴性对照阴性血清+++

的结合物对照PBSlOOul+++

底物对照PBSlOOulPBSlOOul+

空白对照PBSlOOulPBSlOOulPBSlOOul+

五.ELISA试验优缺点

优点：1.既可测抗原又可测抗体

2微.量、定性、定量

3.特异性、敏感性高

4.操作简单，可不用特殊仪器

缺点：1.影响因素多，多方把关

2.偶有假阳性、假阴性

六.膜载体的酶免疫测定

（一）斑点-ELISA

特点：1.固相载体为硝酸纤维素膜

2.酶促反应后在膜上形成有色沉淀物

（二）免疫印迹法（immunoblottingtestJBT）

七.应用（包括所有标记技术）

（-）病原体的诊断及研究

1.病毒、细菌等传染病的诊断（测抗原或抗体）

2.病毒、细菌表面抗原的研究

（二）某些疾病的诊断

1.某些微量物质有关疾病的诊断

2.肿瘤的诊断及定位

3.自身抗体检测协助自身免疫病诊断

4.寄生虫疾病的诊断等

（三）免疫学方面的研究

T、B细胞的发生、演化、表面抗原改变等的研究

（四）微量物质的检测

体内：微量蛋白质、激素、酶等抗原；药物、糖等半抗原

工农业：微生物、微量物质等

思考题：

1.ELISA的原理、方法（以间接法测抗体和双抗夹心法为例）及影响因素。

2.ELISA试验应设哪些对照，为什么？

3.判断ELISA试验结果的方法。

发光免疫技术

发光免疫技术是将发光系统与免疫反应相结合，来检测抗原、或抗体的方法。

化学发光免疫测定

一.化学发光酶免疫测定（chemiluminescentenzymemunoassay,CLEIA）

试验前部分与ELISA一样，改变所加底物，使产物能发光，用仪器检测发光强度，判断结果。如酶是用辣

根过氧化物酶，常用底物是鲁米诺或其衍生物。

二.化学发光标记免疫测定（chemiluminescentmunoassay,CLIA）

是用化学发光剂作为标记物直接标记抗原或抗体的免疫测定方法。

金免疫技术

采用胶体金作为标记物

胶体金又称金溶胶，是金盐（氯金酸）被还原（还原剂：柠檬酸钠）成原子金后形成的金颗粒悬液

胶体金的特性：

1.胶体金性质：颗粒稳定均匀，分散悬浮，l~100nm

2.呈色性：颜色与颗粒大小有关

2~5nm:橙黄色10-20nm：酒红色30-80nm：紫红色

•.斑点金免疫渗滤试验（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA）

原理：采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反应后根

据在膜中央形成的红色斑点（胶体金聚集）有无来判断结果。

技术类型：双抗体夹心法（测Ag）；间接法（测Ab）

二.斑点免疫层析试验（dotimmunochromatographicassay,DICA）

以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析。

HCG金标试纸：带条中均匀含有胶体金标记的鼠抗人HCG单抗

尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物；随层析作用向上移动，至检测线与鼠抗人HCG

抗体结合而聚集显色。

在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗（IgG）随着尿液上行，到达质控线与羊抗鼠IgG（二抗）结合而显色，

作为质控对照。

思考题：

1.发光免疫技术、金免疫技术的原理

2.用金标记免疫法（斑点免疫层析试验）检测HCG的原理

七.免疫血清的制备

一.概述：

1.免疫5清：含有某种抗体的血清。它是免疫化学和细胞免疫的主要试剂，其质量的好坏由Ab的效价、特

异性决定。

2.来源：山Ag免疫动物而来。Ag可以是纯Ag（如白蛋白），也可以是复杂Ag（如人全血清）

二.免疫血清的制备：

（-）动物的选择：

1.常用动物：哺乳类较多：马、羊、猪、猴、兔、豚鼠等；禽类：鸡

2.选择原则：

免疫的Ag与动物的种类要求越远越好（即免疫原性好）；

与免疫血清的量有关：所需量大，用马、羊、猴等大动物；所需量小，用兔、豚鼠等小动物；

动物的个体状态：雄性、适龄、健康、无感染；

其它：根据实验的特殊要求。

（-）抗原的条件：

具有良好的抗原决定簇（表位）：易被LC识别而产生Ab；

具有可靠的纯度；

具有足够大的分子量及相对复杂的空间结构；

注射量：严格掌握，宁可小，一般用25ug/kg动物；量大可出现免疫抑制

（三）佐剂的应用：

佐剂（adjuvant）：同Ag一起或预先注入机体，能增强机体对该Ag的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。

多用于可溶性Ag,颗粒性Ag一般不用佐剂。

使用佐剂的目的：增加Ag的免疫原性，从而提高抗血清的效价

佐剂的种类：

1.福氏不完全佐剂（FIA）：

组成：羊毛脂+石腊油，二者比例为4：1

FIA的制备：将Ag溶液逐滴加入羊毛脂和石腊油中，不断研磨，使Ag溶液均匀混于佐剂中，形成“油包

水”乳剂，“水包油”不行。

要形成“油包水”乳剂的原因为：

延缓Ag在体内的破坏和消失，并缓慢释放Ag；

刺激单核-巨噬细胞对抗原的处理和提呈能力；

刺激淋巴细胞的增殖、分化从而增强机体的免疫应答。

2.福氏完全佐剂（FCA）：

组成：羊毛脂+石腊油+卡介苗

免疫效果更好，进一步提高、加强了免疫反应，并使免疫反应发生质的改变。

表现：促进、诱发Ag产生强大、持久的细胞免疫反应；

促使机体合成新的1g种类

FCA特点：

卡介苗同Ag一起加到羊毛脂和石腊油中，儿滴即可；

免疫效果好；

注射局部易形成肉芽肿，溃烂，但对Ab生成无危害。

3.另外还有明研佐剂、氢氧化铝佐剂等非免疫原性佐剂

4.细胞因子佐剂：与Ag合用可以有效地激发机体免疫功能，增强免疫反应。如IL-2、IFN-Y、IL-1等

（四）免疫程序及采血：

1.注射途径：静脉、皮内、皮下、淋巴结、腹腔。采用一种途径多点注射

可溶性Ag：常选用皮内或皮下（皮内易引起细胞免疫反应，对产生Ab有利）

颗粒性Ag：常选用静脉或腹腔

若Ag量少，可直接注射淋巴结

2.注射间隔及次数：

单次注射：Ab生成慢、持续时间短、效价低，但特异性好；

再次注射：注射2次，Ab效价上升快，持续时间长；

间隔一定时间多次注射：Ab效价高、生成时间长，但特异性差。间隔时间一般为7-10天

•般采用后两种注射方法

3.注射量：蛋白质Ag一般注射l-4mg/次，注射量过大易形成免疫耐受

4.制定免疫程序

5.试血和放血：

试血：末次Ag注射后，测定血清中Ab的效价，叫试血。

若Ab达到所需效价，即可放血。若未达到，继续追加免疫Ag一次。

试血：可溶性Ag：用双扩（梅花孔型）；颗粒性Ag：用直接凝集试验（试管法）

放血：直接颈动脉放血或直接心脏穿刺抽血。然后分离出血清，即可得到Ab

测抗体效价：双扩梅花孔型

试管凝集试验：

方法：1-9号试管分别加不同稀释度待检血清（容量相同，Ab）,10号加NS（对照），各管再加定量（浓

度、容量一样）的Ag。

Ab效价判定：以出现明显凝集现象的（记为：++凝集）抗体最高稀释度作为该抗体的效价。又称滴度Titer）

6.鉴定

Ab效价的鉴定：

可溶性Ag用双扩法（梅花孔型）；

颗粒性Ag用直接凝集试验（试管法）

Ab特异性的鉴定：双扩法（双孔型）

方法：在琼脂上打两排孔，左边一侧一孔加粗Ag（Ag粗提物），一孔加纯Ag（特异性Ag）,右边一侧两孔

分别加免疫血清,放37°C、24ho

结果：若抗血清与粗Ag及纯Ag之间皆出现一条沉淀线，且两条线融合，则说明动物已产生单价特异性

Ab；若与纯Ag出现1条线，与粗Ag出现多条线，则说明血清中有杂Ab。

Ab纯度的鉴定：

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，若出现多条电泳带，即提示免疫血清中有杂蛋白，需进一步分离、纯化

7.保存：

小包装低温保存：将血清分成小包装-20°C保存，避免反复冻融，可保存5年，效价不下降：

冰冻干燥保存：用冰冻干燥器使免疫血清形成冻干粉，可保存5-10年；

4℃加防腐剂保存：可保存半年。如石炭酸、叠氮兰、硫柳汞等防腐剂

1.免疫血清制备的主要程序。

2.佐剂概念、作用机理、福氏不完全/完全佐剂的组成。

八.免疫球蛋白的分离提纯

（separationandpurificationofimmunoglobulin）

目的：有利于标记

减少非特异性反应

有利于ig定量

—,盐析法

（-）原理：在不同浓度的中性盐中蛋白质会脱水，降低带电电势，由亲水性变为疏水性，分子间相互凝

聚而沉淀（盐析作用）。

不同蛋白质盐析所需中性盐的浓度不同，故可分离不同蛋白质。

分离蛋白质所用硫酸胺的浓度：

纤维蛋白原20%饱和度

V球蛋白、部分1a球蛋白33%饱和度

白蛋白＞50%饱和度

（二）常用的中性盐：硫酸胺

硫酸胺盐析的优点：

溶解度大（饱和700~800g/1000ml）

溶解度受温度影响小

蛋白质不易变性

操作简便

缺点：

需除去NH4+,透析时间长

含氮，干扰蛋白质定量

不纯的硫酸胺含有金属，可与蛋白质结合，因此硫酸胺需用分析纯试剂

（三）方法：

1.配制饱和硫酸胺溶液

2.加入稀释血清

3.透析去除NH4+（奈氏试剂检测）

注意：

pH：硫酸胺pH应接近蛋白质的等电点，才易形成沉淀（1g的pl=7.3~8.2,pH应7.7左右）

蛋白质浓度：2.5~3%为宜，所以血清要稀释

温度：室温即可（除特殊要求者）

二.离子交换层析法

原理：利用不同的蛋白质在缓冲溶液中所带电荷不同，与某一载体上的具有相反电荷的离子基团进行吸附,

然后进行解脱，达到纯化蛋白质目的。

常用载体是纤维素（DEAE）

例如在PH6.5的醋酸缓冲液中，侵泡DEAE,使DEAE带正电，因此它能吸附带负电的Alb、a、B球蛋白

（其PI均<6,PH6.5>PI,带负电），仅Y球蛋白PI为7.3,带正电（PH6.5<PI,带正电）不能被DEAE吸附

而直接流出，此时收集的第一峰即为提纯的Y球蛋白。然后通过改变缓冲液PH和离子强度，使Alb、a、

B依次洗脱下来。

方法：

1.用酸处理载体二乙氨乙基纤维素（DEAE）,使其带正电荷

2.装柱

3.加入蛋白质溶液，过柱时带负电的蛋白质吸附于载体上，带正电的蛋白质流出

4.然后用碱性溶液洗脱

三.凝胶过滤法

原理：凝胶颗粒是网格状结构，当分子大小不同的混合物通过凝胶柱时，分子大的先下来，分子小的则嵌

入凝胶颗粒的网状结构中后下来，从而将分子大小不同的物质分离，即为分子筛的作用。

常用凝胶：

葡聚糖凝胶Sephadex、聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl、琼脂糖凝胶Sepharose

常用葡聚糖凝胶Sephadex的型号：G10、25、50、75、100、150、200

蛋白质孔径愈小，选用型号愈小

不同型号分离蛋白质大小不同，分离1g多用G150

方法：

1.用缓冲液浸泡凝胶干粉，使其充分膨胀

2.装柱

3.蛋白质溶液过柱，收集过柱后的蛋白质溶液，一般5ml/小时

凝胶过滤分离的优点：

1.使用单一缓冲液，不需梯度洗脱

2.用后凝胶不需要再生，可连续使用

3.重复性好，样品回收率高

4.不引起蛋白质变性和失去生物学活性

缺点：

1.网孔径大小有限，限制分离物

2.凝胶可吸附芳香类、脂蛋白等物质，影响分离效果

3.过滤速度慢（5ml/h）,上样后要走1-2天

四.亲和层析法

原理：利用抗原抗体的结合具有特异性、可逆性，将纯化抗原先交联到载体上，制成亲和层析柱，当Ab

（Ig）通过时，与抗原在柱上特异性结合，Ab中杂质流出。然后通过改变缓冲液pH、离子强度，使Ab

解脱下来。

方法：

1.亲和层析柱制备：Sepharose4B——（浪化鼠）——吸附特异Ag装柱

2.蛋白质溶液过柱（特异性Ag与相应Ab结合）

3.改变缓冲液pH冲洗柱子，使Ag、Ab分离，收集Ab

优点：分离的1g很纯、柱子可反复使用

缺点：柱子制备较复杂

以上四种方法一般选用1~2~3种，或者一种方法反复进行2~3次

思考题：

1.分离提纯免疫球蛋白有哪些方法，其原理是什么？

九.单克隆抗体及应用（monoclonalantibody,McAbormAb）

一.概述

克隆：无性繁殖的细胞株

单克隆：由一个细胞无性繁殖而来的一个细胞株（一团细胞），其中所有细胞特性完全相同

（一）单克隆抗体：

针对Ag分子表面某一抗原决定簇（表位）而产生的抗体分子，称McAb。

单克隆抗体——由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗体。

（二）产生

1.1975年KohlerandMilstein首创用杂交瘤技术成功制备McAb

2.80年代初用基因工程成功制备McAb

（三）制备McAb的方法

1.杂交瘤技术

2.基因工程技术

二.杂交瘤技术制备单克隆抗体

（一）杂交瘤技术（hibrydoma）制备单克隆抗体的原理

B细胞（浆）+瘤细胞—（杂交）…杂交瘤细胞--（分泌）一单克隆抗体

（B细胞：能产生抗体的小鼠B（浆）细胞瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞）

1.B细胞（浆细胞）特点：

1）能产生抗体

2）但不能在体外长期培养

3）细胞内含HGPRT酶（次黄喋吟鸟喋吟磷酸核糖转化酶）和TK酶（胸腺嚅咤核苜激酶），可通过旁路途径

合成DNA

2.骨髓瘤细胞特点：

1）能在体外长期培养

2）不含HGPRT和TK酶

3.杂交瘤细胞具有以匕两种细胞的共性：

既能产生抗体、在体外能长期培养；

含有HGPRT和TK酶，可通过旁路途径合成DNA

4.HAT培养液筛选出杂交瘤细胞（次黄喋吟、氨基蝶吟、胸腺喀呢）：

家基蝶吟是抗代谢的药物，能阻断内源性合成DNA（合成DNA的主要途径）。

氨甲蝶n令（叶酸拮抗剂）阻止合成DNA

杂交瘤细胞（含HGPRT、TK）经旁路途径合成DNA

5.B细胞、瘤细胞杂交，经HAT培养液培养数日后，五种细胞的存活情况：

（1）B细胞：自然死亡（不能在体外长期培养）

（2）瘤细胞：HAT培养液（氨甲蝶吟）阻止细胞合成DNA；同时无HGPRT、TK酶，不能通过旁路途径合

成DNA,故死亡

（3）B/B杂交细胞：自然死亡

（4）瘤/瘤杂交细胞：死亡

（5）浆细胞/瘤细胞杂交瘤细胞：可以生长（HAT培养液中氨甲蝶吟阻止DNA合成；但其含有HGPRT、TK

酶,可通过旁路途径合成DNA）

（-）杂交瘤技术制备McAb的简要步骤：

1.制备能产生单抗的杂交瘤细胞

2.克隆化杂交瘤细胞

3.筛选杂交瘤细胞

4.扩大培养单克隆杂交瘤细胞

5.收集单抗并鉴定

6.纯化单抗

1.制备杂交瘤细胞

（1）制备能产生McAb的小鼠脾（B）细胞：

Ag免疫Balb/c小鼠---测抗体--一取脾--一制备脾细胞悬液---计数

（2）细胞融合：脾细胞（B）+小鼠骨髓瘤细胞一杂交

脾细胞（l-5X107/ml）瘤细胞（107-8/ml）

融合剂：40%聚乙二醇（PEG）

⑶筛选：培养过程中加入HAT培养液，培养14天，存活细胞为杂交瘤细胞。

2.鉴定：将筛选出的能产生抗体的杂交瘤细胞进行鉴定：

方法：采用ELISA、IF间接法检测杂交瘤细胞培养上清液中有无目的Ab,包被已知Ag+杂交瘤细胞培养上

清（Ab?）-洗涤，+醐标羊抗鼠IgG-洗涤，+底物一根据显色判断有无特异Ab

3.克隆化

（1）有限稀释法：特异杂交瘤细胞稀释：7-10个/ml,取0.1ml/孔，反复稀释培养、测相关抗体

（2）显微操作法：直接在显微镜下取单个杂交瘤细胞培养、测相关抗体

※筛选和克隆化应反复交叉进行。

4.冻存或扩大培养

（1）在液氮中冻存经鉴定后的杂交瘤细胞备用，需要忖复苏

（2）扩大培养（增殖），可得到大量单克隆抗体

体外法：将杂交瘤细胞在细胞培养瓶中进行培养、传代

体内法：将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内，利用杂交瘤细胞能大量繁殖的特点，产生腹水，腹水中有大量的

单抗

5.鉴定

（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定单克隆抗体的纯度；

（2）用ELISA、免疫电泳法鉴定抗体特性

6.纯化：盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、亲和层析法任选1-2种

清

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一

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（三）杂交瘤技术制单抗的优缺点

优点：

1.制备的单抗特异性高、效价高、产量高

缺点：

1.需特殊条件、无菌操作、难得到稳定细胞株；

2.抗体为抗鼠的IgG抗体，长期用于人体不利

三.人源单克隆抗体

（-）概念：单克隆抗体为人IgG

（二）制备目的：用于人

（三）杂交瘤技术制人源单抗的方法

1.人B细胞+鼠瘤细胞不稳定

2.人B细胞+人瘤细胞大多人瘤细胞含有HGPRT酶

3.人B细胞+人淋巳母细胞样细胞恶性、难以获得

4.EBV转化的能产生Ab的B细胞转化复杂

四.基因工程制备单克隆抗体

（-）概念：在基因水平上对编码抗体的基因进行切割、拼接或修饰，甚至人工合成，然后导入受体细胞

内表达而产生的抗体（单克隆抗体）。

人-鼠嵌合抗体（chimericantibody）

重构抗体（reshapedhumanizedantibody）

小分子抗体：Fab片段

Fc片段

Fv片段

双特异性抗体（bispecificantibody）：1g-融合蛋白，抗体导向酶等

（二）基因工程抗体种类

1.嵌合抗体

（1）概念：用DNA重组技术将鼠源单抗基因的可变区（V区）基因与产生人1g的恒定区（C区）基因相

连接，构成嵌合基因，导入受体细胞（骨髓瘤细胞），表达出嵌合抗体。

嵌合基因：红色一鼠McAb可变区基因；绿色一人1g的恒定区基因

嵌合抗体：可变区为鼠McAb部分，其它部分为人1g部分

构建成功的嵌合抗体：

抗乳腺癌（1986）、抗结肠癌（1987）、抗肺癌（1987）抗CEA（癌胚抗原）（1989）、抗HBsAg（1990我国）

抗T表面受体BMA031-lgG（1991我国）

（2）嵌合抗体优点：

a.免疫原性低，有利于用于人体

b.在人体内半衰期较鼠单抗长

c.在人体内生物学作用（如CDC、ADCC）较鼠单抗强

d.与人/人杂交瘤比，体外传代更稳定

（3）嵌合抗体制备流程：（不用记）

a.提取能产生McAb杂交瘤细胞的DNA、RNA、mRNA

b.建立基因文库：分纯轻、重链V区基因

c.测轻、重链V区基因DNA序列

d.与人1g轻、重链C区基因及表达载体连接，构成嵌合基因

e.导入受体细胞表达，并筛选

f.产物鉴定

2.重构抗体（ReshapedAntibody）

在嵌合抗体基础卜.发展而来，使嵌合抗体进一步“人化”

以人1g基因为框架，去掉高变区部分，用鼠单抗高变区基因连接上，构成重构基因，导入受体细胞表达出

的抗体。

研究表明，1g的氨基酸序列在重、轻链各有三个高变区（与抗原结合的部位）：

重链（共450aa）；N端31~37、51~68、84~91

轻链（共214aa）：N端26~32、48~55、90~95

重构基因：绿色为人1g基因（框架），红色为鼠McAb基因（高变区部位基因）

重构抗体：所有绿色部分均为人源，红色部分为鼠源（CDR）

重构抗体在临床应用更优于嵌合抗