分离纯化的后期步骤

关于分离纯化的后期步骤11.1样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

1、减压加温蒸发浓缩

2、空气流动蒸发浓缩3、冰冻法4、吸收法5、超滤法6、其他第2页,共35页，2024年2月25日，星期天1、减压加温蒸发浓缩

通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。第3页,共35页，2024年2月25日，星期天2、空气流动蒸发浓缩空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。第4页,共35页，2024年2月25日，星期天3、冰冻法生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。第5页,共35页，2024年2月25日，星期天4、吸收法通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。

第6页,共35页，2024年2月25日，星期天5、超滤法超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。第7页,共35页，2024年2月25日，星期天6、吹干浓缩法

将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。第8页,共35页，2024年2月25日，星期天7、凝胶浓缩法

选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。比浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。第9页,共35页，2024年2月25日，星期天11.2干燥生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。第10页,共35页，2024年2月25日，星期天11.3结晶结晶对酶的重要意义作为纯化的方法之一作为均匀性的证据作为稳定的贮存方法单晶可以作为X-衍射分析的材料常用的结晶方法等电点结晶法盐析结晶法透析结晶法温差结晶法第11页,共35页，2024年2月25日，星期天第12页,共35页，2024年2月25日，星期天11.4贮存生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。第13页,共35页，2024年2月25日，星期天1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。

2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。

3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。第14页,共35页，2024年2月25日，星期天11.5纯度鉴定电泳法沉降法分光光度法：A280/260=1.75恒溶解度法结晶法：免疫法第15页,共35页，2024年2月25日，星期天11.6蛋白质分子量的测定方法1.沉降离心法：M=RTS/D（1-

）2.渗透压法：M=gRT/PC3.电泳法：lgM=a－bRf4.分子筛法：lgM=a－bVe5.最小分子量法：蛋白质最小分子量＝100*金属原子量／该金属在该蛋白质中的百分含量第16页,共35页，2024年2月25日，星期天11.7蛋白质（酶）含量的测定方法凯氏(Kjedahl)定氮法双缩脲反应紫外光分光度法染料结合法之一水扬酸比色法Folin试剂法（Lowry法）第17页,共35页，2024年2月25日，星期天11.8分离纯化步骤的设计与方法的选择原则纯化步骤的评价第18页,共35页，2024年2月25日，星期天第19页,共35页，2024年2月25日，星期天原则（1）明确分离纯化的目的

(2)所分离的物质的性质（3）原料的特性与数量（4）时间（5）实验条件（6）各种方法的原理特性和优缺点（7）各种方法的使用顺序安排要合理（8）快速稳定的活力与含量的测定方法（9）操作过程中各种因素的影响第20页,共35页，2024年2月25日，星期天第21页,共35页，2024年2月25日，星期天蛋白纯化的基本策略捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。

中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。

精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。第22页,共35页，2024年2月25日，星期天第23页,共35页，2024年2月25日，星期天分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法第24页,共35页，2024年2月25日，星期天根据溶解度不同的分离方法等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、PEG沉淀法根据分子大小不同的分离方法透析/超过滤、分子筛、离心法根据分子带电性不同的分离方法离子交换层析、电泳法根据分子吸附性不同的分离方法吸附层析、亲和层析第25页,共35页，2024年2月25日，星期天第26页,共35页，2024年2月25日，星期天蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）第27页,共35页，2024年2月25日，星期天每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。

处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。

速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。

回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。第28页,共35页，2024年2月25日，星期天技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度★★★★★★★★★低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度★★★★★★高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度★★★★★★★★结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）

★★★★样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率

★★★★需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性

第29页,共35页，2024年2月25日，星期天第30页,共35页，2024年2月25日，星期天第31页,共35页，2024年2月25日，星期天提示：1、

通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、

硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、

GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、HIC、AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、

在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方