2023年高考生物一轮复习（全国版） 第10单元 第1课时　基因工程的基本工具和基本操作程序

第1课时基因工程的基本工具和基本操作程序目标要求1.基因工程的诞生。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)。3.实验：DNA的粗提取与鉴定。考点一重组DNA技术的基本工具1．基因工程的概念(1)手段：按照人们的愿望，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(3)水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫做DNA重组技术。拓展延伸基因工程的理论基础2．DNA重组技术的基本工具(1)限制性核酸内切酶(也称“限制酶”)(2)DNA连接酶(3)载体(1)源于选修3P4“寻根问底”①原核生物中存在限制酶的作用是什么？提示原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？提示限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)源于选修3P6“寻根问底”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。延伸应用图解限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。考向一限制酶和DNA连接酶1．(2022·青岛市高三期中)下表为常用的限制性核酸内切酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是()限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGG注：Y为C或T，R为A或G。A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列答案D解析HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A项正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B项正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C项正确；HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D项错误。2．第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性核酸内切酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是()A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶答案C解析从图甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后两端各有一个切口，与图乙中EcoRⅠ切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C项错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D项正确。考向二基因工程载体的应用3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是()A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中B．细菌的基因只存在于质粒上C．质粒为小型环状DNA分子D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一答案C4．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是()A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因答案D解析在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。考点二基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。(2)获取目的基因的方法①从基因文库中获取eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(从基因组文库中获取,从部分基因文库如cDNA文库中获取))eq\a\vs4\al\co1(②利用,PCR技,术扩增,目的基,因)eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(原理：DNA双链复制,条件：引物、DNA模板、热稳定DNA,聚合酶、游离的dNTPdCTP、dATP、,dGTP、dTTP,过程\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(变性：90～95℃条件下受热变性,↓,

后解链为单链,

,复性：55～60℃条件下，引物与单,

链相应互补序列结合,↓,延伸：70～75℃条件下在热稳定,

DNA聚合酶作用下合成子链)),结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形,

式扩增约为2n，其中n为扩增循环的次数))③用化学方法直接人工合成eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(条件：基因比较小，核苷酸序列已知,方法：通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成))归纳总结(1)PCR技术和DNA复制的比较(2)几种获取目的基因方法的比较项目从基因文库中获取人工合成方法从基因组文库中获取从cDNA文库中获取化学合成法反转录法过程供体细胞中的DNA↓限制酶许多DNA片段↓插入载体↓导入受体菌群(基因组文库)↓外源DNA扩增，产生特定性状↓分离目的基因目的基因的mRNA↓反转录单链DNA↓合成双链DNA↓插入载体↓导入受体菌群(cDNA文库)↓分离目的基因蛋白质的氨基酸序列↓推测mRNA的核苷酸序列↓推测基因的核苷酸序列↓化学合成目的基因目的基因的mRNA↓反转录单链DNA↓合成双链DNA(即目的基因)说明将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库，包括基因组文库和cDNA文库适用于片段较小，核苷酸序列已知的目的基因；利用DNA合成仪合成以RNA为模板，需要逆转录酶易错提醒①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。④PCR扩增过程中的循环图示与规律循环次数123nDNA分子数2482n含引物A(或B)的DNA分子数1372n－1同时含引物A、B的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗的引物数量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22n＋1－22.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用(3)构建过程易错提醒列表比较启动子、终止子、起始密码子、终止密码子项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入辨析1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎双球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。2农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接非人工操作是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入非人工操作是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。3农杆菌特点①能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。4．目的基因的检测与鉴定考向一目的基因的获取5．如图表示基因工程中获取目的基因的示意图，下列相关叙述不正确的是()A．③表示PCR技术，用来扩增目的基因B．若获取的目的基因相同，则图中基因组文库小于cDNA文库C．要从基因文库中得到所需的目的基因可以根据目的基因的相关信息来获取D．若基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过化学方法直接人工合成获取答案B6．利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述，错误的是()A．PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B．变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶C．复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D．延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸答案D考向二基因工程的基本操作程序7．(2022·山东高三联考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是()A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、CB．重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒C．过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定答案D解析戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A项错误；启动子是一段有特殊结构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2蛋白的载体时，需要选择大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，B项错误；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，增大大肠杆菌细胞壁的透过性，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C项错误。8．某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是____________________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________________。该方法中农杆菌的作用是__________________________________________________________。(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是______________________________________________________________。(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。为什么？____________________________________________________________________。(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。答案(1)Ti质粒T－DNA感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上(2)防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率(3)否含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏(4)如图所示科学思维载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：考点三DNA的粗提取与鉴定1．基本原理(1)DNA的粗提取①原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。②DNA与蛋白质在物理和化学性质方面的差异比较项目DNA蛋白质溶解性2mol·L－1NaCl溶液中溶解析出0.14mol·L－1NaCl溶液中析出溶解酒精溶液中析出溶解耐受性蛋白酶无影响水解高温80℃以上变性不能忍受60～80℃的高温(2)DNA的鉴定：DNA＋二苯胺eq\o(→,\s\up7(沸水浴))蓝色。2．操作流程易错提醒(1)DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”实验操作实验操作的目的加蒸馏水2次①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14mol/L，使DNA析出用纱布过滤4次①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA(2)注意事项①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。②加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。③二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。④提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。⑤在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。考向DNA的粗提取与鉴定9．下图是“DNA的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是()A．图①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精B．图①和图③都需要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并保持结构完整C．若图③操作后接图②操作，则DNA会留在滤液中D．若图④操作后接图②操作，则DNA会留在纱布上答案B10．(2022·贵州遵义联考)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述正确的是()A．图1中溶液a是物质的量浓度为0.14mol/L的NaCl溶液B．图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显C．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶D．图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色答案B解析图1中溶液a是NaCl溶液，其目的是溶解DNA，DNA在物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，在物质的量浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，A错误；图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶，C错误；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺出现蓝色，D错误。重温高考真题演练1．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是()A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNAD．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热答案A解析哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。2．(2021·全国甲，38)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。(2)操作③中使用的酶是________，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、______三步，其中复性的结果是______________________________________________。(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指_______________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。答案(1)④②③①(2)Taq酶(热稳定DNA聚合酶)延伸引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(3)病原菌DNA(4)一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术解析(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。3．(2019·全国Ⅰ，38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括____________________和______________。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是____________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________________________________________。答案(1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至90～95℃氢键(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活4．(2018·全国Ⅰ，38)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了___________________________________________________________________________________(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。答案(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶5．(2021·全国乙，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中____________________酶切割后的DNA片段可以用E·coliDNA连接酶连接。上图中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是______________。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能______________；质粒DNA分子上有_________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是__________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________。答案(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ(2)磷酸二酯键(3)自我复制一个至多个限制酶切割位点用含有该种抗生素的培养基培养宿主细胞，能存活的细胞含有质粒载体(4)一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位一、易错辨析1．限制酶也可以识别和切割RNA(×)2．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来(×)3．E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)4．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物(√)5．提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替(×)二、填空默写1．(选修3P1)基因工程：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。2．(选修3P4)限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。3．(选修3P5)DNA连接酶的作用是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。4．(选修3P6)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。5．(选修3P6)载体上有特殊的标记基因，作用是供重组DNA的鉴定和选择。6．(选修3P9)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。7．(选修3P11)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。8．(选修3P11)启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。9．(选修3P11)终止子位于基因的尾端，是一段有特殊结构的DNA短片段，终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。10．(选修3P12)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。11．(选修3P13)将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射技术。12．(选修3P13)将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是Ca2＋处理法，首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞，第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。课时精练一、选择题1．若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是()A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体答案D解析解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。2．农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的载体，下列相关叙述正确的是()A．Ti质粒是能够自主复制的单链DNAB．Ti质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接C．重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞D．Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上答案B3．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是()A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16答案D解析用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成(两种)引物，但不必知道基因的全部序列，A正确；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。4．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验原理的叙述，正确的是()A．利用DNA能溶于酒精溶液，而蛋白质不溶于酒精溶液的特点，可将DNA与蛋白质分离B．利用85℃的高温能使蛋白质变性却对DNA没有影响的特性，将DNA与蛋白质分离C．利用DNA在2mol·L－1NaCl溶液中溶解度最大的特点，可将DNA与杂质分离D．在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离答案D5．科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。下图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。下列叙述不正确的是()A．目的基因插入到质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中B．为使目的基因与质粒高效重组，最好选用EcoRⅠ和PstⅠC．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素D．可用PCR等技术或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达答案D解析农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点，将目的基因插入到质粒的T－DNA上，才能整合到受体细胞染色体中，A正确；应选用EcoRⅠ和PstⅠ切割质粒，氨苄青霉素抗性基因被破坏，故成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素，C正确；检测目的基因是否表达应检测是否成功产生蛋白质，可用抗原—抗体杂交技术，D错误。6．科学家将苏云金芽孢杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析错误的是()A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因表达效率低B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中D．若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能只是载体DNA分子导入受体细胞答案D解析抗原、抗体能特异性结合，可提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，说明抗虫基因能表达。但棉花植株并无抗虫性状，则可能是抗虫基因表达效率低，合成的Bt抗虫蛋白太少，A正确；核酸分子杂交技术的原理是碱基互补配对，检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，说明抗虫基因能转录，细胞中无Bt抗虫蛋白，说明抗虫基因不能正常翻译，导致棉花植株并无抗虫性状，B正确；核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，而抗虫基因又不能表达，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中，C正确；由题干信息“鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株”可知，导入受体细胞的是重组DNA分子，D错误。二、非选择题7．如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：表1pIJ702pZHZ8BglⅡ5.7kb6.7kb表2固体培养基中硫链丝菌素浓度(μg/mL)012510不含质粒的链霉菌生长状况＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断裂，切割形成的末端有______________________两种。(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为____________kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是__________________________________________________________________________。(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成________________________________________________________过程。(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在________μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是___________________________________________________。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的____________(填“DNA”或“RNA”)。答案(1)磷酸二酯键黏性末端和平末端(2)1.4pIJ702上的原有BglⅡ切割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段(3)转化(4)5根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选RNA解析(2)质粒pIJ702的长度为5.7kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7kb，又已知构建基因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为6.7－5.7＋0.4＝1.4kb。(4)从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5μg/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5μg/mL。检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是目的基因是否能转录形成mRNA。8．(2022·济南联考)下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用到的组织细胞是________________，③过程的目的是________________________，⑤过程常用________处理大肠杆菌。(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有________种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有______种和___________________________________________种。(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选____________________的大肠杆菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是__________________________。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是____________________________。答案(1)调控作用人垂体组织细胞将平末端处理为黏性末端Ca2＋(2)933(3)含四环素抗性基因完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒)在丙中能存活，在乙中不能存活解析(2)(后面的→均按照顺时针方向)假设PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三种酶的切点分别用1、2、3表示。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1→1、2→2、3→3；任意两种酶分别同时酶切时，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六种片段；三种酶同时酶切时，可得到1→2、2→3、3→1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3种含有完整氨苄青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3种含有完整四环素抗性基因。9．我国科学家将甲型肝炎病毒V区抗原基因和丙型肝炎病毒C区抗原基因以融合基因的方式导入光致死突变体(pet基因缺失导致光照致死)衣藻的叶绿体基因组中，融合蛋白得到了高效表达，且具有双价抗原活性。回答下列问题：(1)构建基因表达载体时，应当在甲型肝炎病毒V区和丙型肝炎病毒C区融合基因的首段插入启动子序列，便于其被________识别并发生特异性结合，应当选择____________作为标记基因。培养pet基因缺失突变体的受体衣藻时，应给予____________以筛选成功导入重组质粒的衣藻细胞。(2)科学家将基因表达载体包裹