第七节离子交换色谱

,.,.第七节离子交换色谱2030具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一，由于:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，也简洁造成蛋白质变性失活。20世纪50年月中期，Sober和Peterson(CM-〕纤维素和能进人网孔内部从而大大提高了有效交大地推动了离子交换技术在生化分别中的进展和应用。(一)根本原理离子交换色谱分别生物分子的根底是待分别物质在特定条件下与离子交换6.7-1图6.7-1 离子交换色谱原理起始缓冲液中的离子； 梯度缓冲液中的离子； 极限缓冲液中的离子；待分别的目标分子；▲需除去的杂质2换剂结合；3-开头解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；45-再生阶段，用起始缓冲液重平衡色谱柱，以备下次使用蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过荷的溶质可被阳离子交换剂交换。(二)根本理论1.离子交换作用离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的6.7-2种离子与离子交换剂结合时存在竞争关系。无机离子与交换剂的结合力量与离子所带电荷成正比，与该离子形成的水子序数越高，结合力越强。在阳离子交换剂上，常见离子结合力强弱挨次为：Li+<Na+<K+<Rb+<Cs+；Mg2+<Ca2+<Sr2+<Ba2+；Na+<Ca2+<Al3+<Ti4+。图6.7-2离子交换色潜中所进展的离子交换过程(以阳离子交换树脂为例)在阴离子交换剂上，结合力强弱挨次为：F—<Cl—<Br—<I—pH，它打算了目的物的带剂上;洗脱时，往往通过提高溶液的离子强度，增加了离子的竞争性结合能.力，使得样品从交换剂上解吸，这就是离子交换色谱的本质。pHIpHI素。pHpH电荷。一方面，离子交换剂有一个工作pHpHpH，能够保证目标分子与离子交换剂带相反电荷而被吸附，同pH而不易洗脱。pHpH会造成目标分子活性丧失，导致回收率下降。特别是要考虑到由于道南效应Donnan〕pHpHHOH—被排斥，造成交换pH1pHOHHpH1pHpH5pH4pH会失活。大多数蛋白质在pH4由于溶液中的其他离子与目标分子竞争结合到离子交换剂上，因此离子种类和离子强度I是影响月标分子结合和洗脱的另一重要因素。低离子强度下，目标分子通过荷电基团结合至离子交换剂上带相反电荷的功能基团上;当竞争离子浓度即离子强度I渐渐上升时，目标分子渐渐被置换下来。绝大多数目的物在1mol/L。事实上在溶液中盐类还常扮演稳定目的物构造的角色，另外，辨率和不同蛋白质的洗脱挨次产生影响。疏水相互作用和氢键上此过程中还可能存在其他的作用力，常见的就是疏水相互作用和氢键。HPLCSephadexSepharose往可实现分别。离子交换动力学动力学则取决于离子交换剂的颗粒构造。上。53。①可交换分子在流速的快慢，亲水性越强、流速越慢，水膜越厚，反之水膜越薄。可交换分子通可交换分子大小和带电荷数等多种因素。③可交换分子取代交换剂上的反离于图6.7-3离子交换动力学示意(以阳离子交换剂为例)步骤①相反。依据电荷平衡的原则，肯定时间内，一个带电分子进人凝胶颗粒，就有与该53(三)离子交换的区分率(Rs)来描述。a-1 N ka-1 N ka 1k式中a——选择性N——柱效率容量因子

1 〔6.7-1〕4k＇又称保存因子，是色谱分别中常用的组分保存值表示法。R

tt0

V V/VR 0

〔6.7-2〕式中 tR和VR——溶质的保存时间和保存体积t0V0——非滞留组分的保存时间和保存体积寸和流速无关。柱效率N米色谱床所包含的理论塔板数，其计算公式:V 2

〔6.7-3〕N5.54 RWh式中 脱体积Wh——洗脱峰半峰高〔h1/2〕时对应的峰宽会导致柱效率下降。因此色谱过程中操作条件的掌握对色谱效果影响很大。选择性aa定义为：ak2k1

VV R2 VVR1 0

V VR1

(6.7-4〕式中 k1＇和k2＇——洗脱峰1和2的容量因子VR1和VR2——洗脱峰1和2的洗脱体积V0——非滞留组分的洗脱体积6.7-4)。6.7-4选择性和柱效率对区分率的影响更乐于通过掌握试验条件来提高选择性，从而获得好的区分率。RsRS以到达满足的分别效果，必需满足以下条件：①a>1，VR1-VR2a=1，此N的计算公式，当两种蛋白的洗脱体积VR1和VR2均等于非滞留组分的洗脱体积V0k＇﹦00，选择适宜的色谱条件，使得至少一种蛋白质在离子交换剂上发生吸附，就能满足k＇≠0，增加k＇的值将提高区分Rs，有利于分别。的研制和应用。(一)根本构造性质不发生转变。pHpH子〔阴离子)，因此被称为阴离子交换剂。pH(二)功能基团和酸碱性质效交换容量。pKapKapHpKapHpHpKa6.7-1电荷。6.7-1常见的离子交换功能基团(三)离子交换剂的局部性质粒度3~300µm也很大，颗粒直径越均一，分别效果越好。交联度和网孔构造子筛和离子交换双重成效。电荷密度电荷密度是指恭质颗粒上单位外表积的取代基(功能基团)的数量，它打算着1∶1质分子不能进人颗粒网孔。即使颗粒外表电荷密度很大，图6.7-5 离子交换剂的膨胀度与交换剂类型和溶液离子强度的关系测定条件：色讲柱：15mm×30mm30cmH2O〔1cmH2O=98.0665Pa〕〔a〕和(bpH7.6的TrisHCl(c)和〔d〕为pH4.3度用NaCl进展调整1:1降。因此，适合蛋白质类分子离子交换的介质电荷密度往往较低。膨胀度度，通常用每克干胶吸水膨胀后的体积(mL)来表示。影响离子交换剂膨胀度的因素如下。60mL/g液中体积变化格外小。6.7-54SephadexSephadexG-25SephadexG-50SephadexA-50SephadexC-50SephadexA-25和SephadexC-50。C-50SephadexG-50其膨胀度相应地也比后者高。图6.7-6 离子交换剂的膨胀度与溶液pH的关系测定条件：色谱柱×mOm；和〔pHpH6。应当指出，让离子交换剂在具有肯定离子强度的缓冲液中充分膨胀，可以的，所以离子交换剂使用前要进展预溶胀。交换容量换剂上功能基团的数量。也可使得离子交换剂和某种小的离子之间发生完全交换，然后通过侧定该离子的含量算出总交换容量。Sephadex6.7-2几种常用离子交换剂的总交换容量①于静态容量。而当色谱流速增大后，蛋白质来不及使离子交换剂到达完全饱和，F质浓度可以计算出每毫升离子交换剂所能吸附的蛋白质的上限，此即为静态容量。1~5mg/mL。为确保离子交换剂满负荷吸附蛋白质，应不停地加〔00体中又不含不被吸附的蛋自质。转变缓冲液条件。使得蛋白质从色谱柱上解吸，速下的动态容量。(四)离子交换剂的类型1.离了交换树脂称各不一样，但有的在性能上是格外相像的。不用于蛋白质类大分子的色谱。离子交换纤维素基于纤维素的离子交换剂是最早用于分别蛋白质类大分子的离子交换剂之一，于1954PetersonSober4时洗脱很便利，并且蛋白质活性的回收率高。过β(1→4〕形)区域。微粒状的交换剂是将纤维素进展局部酸水解，除去了大局部非晶型区并且电荷分布更均匀。Whatman6.7-3DEAECM-纤维素属于常规生化分别中最常用的介质类型。表6.7-3 Whatman公司离子交换纤维素外还通过环氧氯丙烷交联强化凝胶构造，在此根底上再连上功能基团。DEAE-Sephacel6.7-4。表6.7-4 Pharmacia公司的DEAE-Sephacel离子交换剂离子交换葡聚糖PharmaciaSephadexGG-504AC2550SephadexG25SephadexG-50。Sephadex30000SephadexGSephadexG-50于凝胶颗粒网孔孔径较大.其交换容量要明显大于SephadexA-25和SephadexC-251000002550系列的交换剂，分子的交换与结合都仅发生在颗粒外表，255025pH0.01mol/L，增0.5mol/LDEAE--SephadexA-50A或SephadexC-50应尽量避开。离子交换琼脂糖凝胶比葡聚糖凝胶更显多孔构造，由于其孔径稍大，对于相对分子质量在106以内的球状蛋白质表现出很好的交换容量。琼脂糖离子交换剂的多糖链排列成束，不同程度的交联使得束状构造进一步强化，因此该介质表现结实，体积(膨pHPharrnacia。SepharoseBio-RadBio-GelAPharrnaciaSepharoseSepharoseCL-6B、ehe〔e、ete、egs〔eB〕等系列。SepharoseCL-6BSepharoseCL-6BSepharoseHighPerformance是基于高度交联琼脂糖的颗粒状交换剂，pH性，因此在色谱时有很高的区分率，是SepharoseHighPerformance和SP-SepharoseHighPerformance两种色谱介质，都属于强离子交换剂。色谱介质填充成预装柱出售，商品名为HiTrap、HiLoadBioPilot，其柱尺寸挨次增大，分别满足从试验室到小规模生产等不同规模分别的要求。SepharoseHighPerformance系列，平均为90µm，这使得它比750cm/h,适合大规模分别纯化Flow4柱出售。SepharoseBigBeads大的粒度赐予该介质极好的流速特性，即使BigBeads属于强离子交换剂。Bio-RadBio-GelA4%交联琼脂糖的离子交换剂，DEAEBio-GelACMBio-GelA回收率低等特点。高效离子交换剂硬度，区分率很高的一类离子交换剂，其中包含了很多种类。确保了该交换剂有很高的硬度，能够承受格外高的流速，使分别时间大大缩短；性吸附很低，因此蛋白质活性的回收率很高。SOURCE酸到大分子蛋白质的很大的分子范围内都表现出好的交换容量和区分率。SOURCEQSRESC}UR;}柱出售。PharmaciaSOURCERESOURCEMonoBeadsPharmaciaSOURCE亲水基团形成亲水外表。MonoBeadsSOURCE预装的MonoBeads25000异性的吸附作用，该色谱介质对蛋白质总量和活性的回收率都很高。MonoQ和MonoS制成预装柱出售。Toso-HaasDEAE-3-SWCM-3-SW，它们承受的基质是二氧化硅，外面掩盖带有功能基团的亲水层；能基团、孔构造和颗粒尺寸的交换剂的色谱行为是格外相像的。其高区分率，在进一步纯化和最终的精制阶段是格外有用的。非孔型离子交换剂5~6纯化。PharmaciaMiniBeads3µm，MiniBeadsSaiQ3iS3其他离子交换剂Toyopearl凝胶作为基质，连接上不同功能基团后形成的，目前商品化的仅有定性较好，pHParath等人制备了兼性离子交换剂，在基质上连接如β-丙氨酸、对氨基外的良好效果。之中，它们是推动生化分别技术不断进步的一个重要方面。三、离子交换色谱试验技术(一)离子交换色谱条件确实定始缓冲液的种类、pHpH离子交换剂的选择离子交换剂的种类很多，没有一种离子交换剂能够适合各种不同的分别要目标蛋白质分子人小、等电点和化学稳定性等性质。当作为重要参数。为了能满足快速分别的要求，所选择的色谱介质应当能够在承受高的流速须能够满足原位清洗(CIP)的要求，对于大规模的色谱柱，每次分别后将色谱介脂糖的离子交换剂是比较适宜的。其次是这步离子交换在整个目标分子的纯化所处的阶段及所要求的区分分。一般来说，考察色谱操作优劣的指标包括区分率、速度、容量和回收率，但其余的指标是次要的，只作肯定的参考。接着应考虑目的物的分子大小和离子交换剂的有效交换容量。离子交换剂优势，基于交联葡聚糖的交换剂属于此类。以上考虑主要针对离子交换剂基质的选择，而在确定所选用的基质后，选pH性。的等电点pIpH来实现)，则功能基团很简洁确定。如图6.7-7所示，假定图中实线代表目标蛋pI=7.0，pH<7pH7主要杂蛋白pI=8.2，pH<8.2将带净的正电荷，而pH>8.2将带净的负电荷；pH9.0pHpH9pH。图6.7-7 依据滴定曲线确定起始pHpH7.5pI较近，目标蛋白所带净电荷较少，为了确保目标蛋8.0~8.5pH目标蛋负电荷，所以应选择一种碱性功能基团，也就是选择阴离子交换剂。pHpI和电性质一无所知时，鉴于大多数的蛋白质pI7，可以pH在选择好使用阳离子交换剂或是阴离子交换剂以及色谱的起始pH后，还pHpHpHpH离子交换剂。多数蛋白质的pI在中性或略偏酸性的范围内，进展分别时承受的pH(pH6~8)，此时无论选用强离子交换剂还是弱离子交换剂都能实现分别，习惯上人们较多地承受弱型的离子交换剂。还有一种离子交换方法虽然使用相对较少，但有时也能获得令人满足的效过程也被称为起始相洗脱。色谱柱的尺寸柱的尺寸通常用内径(mm〕×高度〔mm)来表示，据此可计算出另外两个常用指标：柱体积〔mL)和高径比。5-20cm5。在大移，色谱柱越长，风带间的距离拉得越大，区分率就越高。缓冲液的选择一般的原则是，进展阳离子交换时，选用缓冲离子为阴离子的缓冲物质；进展阴离子交换时，选用缓冲离子为阳离子的缓冲物质。固然这并不确定，但pH型的缓冲物质取决于色谱分别时的pH条件，后者又.与目的物的等电点有关。pHpKapKapHpI=6.5,选用DEAE-SephadexC50H0s6pH的物发生吸附的最高离子强度，而洗脱则承受使目的物解吸所需的最低离子强度，至于这些离子强度分别为多少，可以通过试管小试法确定。pH试管小试法确定，具体操作如下：①预备10支15mL试管；②每管参加0.1g基于交联葡聚糖的离子交换剂或1.5mL基于琼脂糖或纤维素的离子交换剂；③0.5mol/LpHpH0.5pH4~8，假设pHpH10管中用以平衡交换剂，混合一段时间后弃去上清液，再分别加人10rnL颖缓10pHpH可承受0.05mol/L的浓度，琼脂糖和纤维素交换剂可承受0.01mol/L的浓度)pH5放置5~10min；⑦使离子交换剂沉降，分析上清液中目的物含量，结果如图4.21(a6.7-8a)中可以看出，6.7-8试管法确定起始pH〔a〕pH7.0；(b0.15mol/L；洗脱盐浓度为0.3mol/LpH7.0pH磷酸盐缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸〔Hepes〕缓冲液等；假设承受阴离子交Tris附后承受转变pH的方法来洗脱目的物，那么从图可以看出选择pH5.0的洗脱缓冲液可以到达目的。在离子交换色谱中，确定起始缓冲液的离子强度时，多数状况下人们直接0.02~0.05mol/LpH确定起始和洗脱缓冲液所需离子强度的具体操作类似于起始pH确实定，只是10支试管中分别用一样pH而不同浓度非缓冲盐的缓冲液分别平衡，相邻两管〔b8L使目的物能够吸附的最高非缓冲盐浓度，而0.3mol/L低非缓冲盐浓度，由此确定，起始缓冲液中应添加非缓冲盐使其终浓度为0.15mol/L，而洗脱缓冲液中非缓冲盐浓度增加到0.3mol/L，而这两种缓冲液pHpH虑选用挥发性的缓冲物质，以尽可能少地将杂质成分带入最终产品中。有的中性聚合物如聚乙二醇〔PEG〕能与蛋白质竞争溶液中的水分子，这将增加蛋白质与离子交换剂的相互作用而提高区分率。近来有争论说明〔PEG〕也有类〔PEG〕对蛋白质的稳〔PEG〕对蛋白质的保护作用机制实际上是共溶剂的参加转变了溶液碘乙酰胺，金属蛋白酶可承受金属螯合剂作为抑制剂。的。(二)离子交换剂的预备选择好离子交换剂后，进展色谱分别前，必需先将离子交换剂预备好，这pH1.离子交换剂的预处理各种不同的离子交换剂在使用前所需进展的预处理程序是不同的。SOURCE系列、MonoBeads系列和MiniBeads系列等细颗粒介质通常衡后即可加样。基于琼脂糖的 Sepharose系列和Bio-GelA系列离子交换剂，以及DEAE-Sephacel交换剂是以液态湿胶形式出售的，一般也无需预处理，使用前倾去上清液，按湿胶，缓冲液(体积比)=3:1的比例添加起始缓冲液，搅匀后即可装柱。pH中进展，完全溶胀在常温下需1~2天，在沸水浴中需2h左右，而且在高温下Sephadex很大，简洁将凝胶颗粒胀破。基于纤维素的离子交换剂也是以干态形式出售的，使用前需要进展溶胀。0.5mol/L的NaOH浸泡半小时，倾去碱液，用蒸馏水将交换剂洗至中性，再用0.5mol/L的HCl0.5mol/LNaOHC打算了最终离子交换剂上平衡离子的类型，对于阴离子交换纤维素，一般用碱-酸-碱的挨次洗涤，最终平衡离子是OH-；对于阳离子交换纤维素，一般用酸-碱-酸的挨次洗涤，最终平衡离子为H+。洗涤完以后，必需用酸或碱将离子交换pHpH2mol/LNaOHHCl装柱装柱是色谱技术的一个重要环节，装柱质量的好坏直接关系到分别效果，影响区分率。换剂：上清液(体积比)=3：1，稍微搅拌混匀，利用玻棒引流尽可能一次性将色入，防止两次倾注时产生界面。平衡平衡过程的目的是为了确保离子交换剂上的功能基团与起始缓冲液中的平pH、电导和离子强度方面是否到达全都，由于在这几个pHpH对于一些弱型离子交换剂，由于本身具有肯定的缓冲力量，直接用起始缓冲液是很难将其平衡至起始pH的，此类交换剂在装柱前就应当用酸或碱将其pH先调整至起始pH，装柱后再用起始缓冲液进展平衡。有时为了加快离子交换剂到达平衡的速度，先选择与起始缓冲液有着一样pH但是浓度更大(如0.5mol/LpH也与起始缓冲液全都。样品的预备90μm1μm90μm0.45μm进展过滤;需要无菌过滤或澄清度特别高的样品时，可使用孔径为0.22μm的滤10000g15min样品的黏度是影响上样量和分别效果的一个重要方面，高黏性的样品会造在离子交换色谱上样前必需确保样品溶液在pH和离子强度方面与起始缓冲液全都，这样才能保证在起始条件下目的物能吸附在离子交换剂上(在起始相洗脱中保证目的物不被吸附而杂质发生吸附)。对于固体样品，将其溶于起始缓pH始缓冲液(pH2-10操作。缓冲液交换一般是通过SephadexG-25pHpHpH，同样能够确保目的物发生吸附。(三)加样溶液进入柱床，目的物完成吸附，并用起始缓冲液将不发生吸附的杂质洗去。加样量虽然在试验方案设计时，应当考虑依据所需分别样品的量来确定色谱柱的试验条件，即色谱柱和离子交换剂的规格，来确定色谱时的最大加样量。抱负的分别效果，建议加样时样品中目的物的含量不应超过其有效交换容量的10%~20%。pH1010样童。加样方法会造成区带外形变差，洗脱峰变宽。吸附在交换剂上，则加样的流速可以取较大的值;而假设起始条件与目标蛋白解流安排器，能保证样品参加时平均分布在床面上并均匀进入柱床。对于自装柱，常见的加样方法有排干法和液面下加样法。排干法是最常用进展洗涤。承受这两种方法加样时不存在流速过快的问题。样品进入柱床后，接着就是用起始缓冲液洗涤柱床，将起始条件下不能被紫外检测器，依据测定出的280nm时可以适当提高洗涤流速来缩短分别时问。假设色谱的起始条件是预先摸索过应的分部合并可得到经过纯化的目的物溶液。(四)洗脱多数状况下，在完成了加样吸附和洗涤过程后，大局部的杂质已经从色谱质进一步分别。洗脱机制1V0+Vi≈Vt〕洗去不吸Sephadex前，实际上也进展了肯定的分别。被结合和吸附的物质不转变条件是否能从柱上洗脱下来?应当说这和溶质与吸附平衡常数或称为分布系数σ来表示，其定义可用数学式表示为:σ=被吸附的某溶质量/某溶质总量=固定相/(流淌相+固定相)吸附平衡常数σ0~1，不同σ值下，溶质的吸附强度不同，被洗脱的难易程度也会消灭变化。假设σ=0，溶质没被吸附，可能不带电或带一样电荷，在一个柱体积被洗脱，Ve=

1 1

0+Vi=Vt

；假设σ=11，目的物可被完全吸附或几乎完

11

V→∞；假设.

11

Vt=10Vt；一不同σ6.7-5。表6.7-5 不同吸附平衡系数σ下溶质所需的洗脱体积争论σ的影响因素:①pHσ发生变化;②离子强度增大，可使σ下降，减弱溶质的吸附;σ都有影响;④溶质浓度与σ呈反比关系。的方法如下。pH，使目标蛋负电荷pH，使目标蛋正电荷削减，从而被洗脱下来。子与蛋白质竞争结合交换剂，降低了蛋白质与交换剂之间的相互作用而导致洗NaC1KC1。作用而被置换下来，这种洗脱方式称为亲和洗脱。先于置换剂从柱中流出，这种色谱方式称为置换色谱。阶段洗脱pHpH阶段洗脱是用一系列具有不同pH的缓冲液进展洗脱，pH的转变造成pH脱的杂质之问实现分别。此方法再现性较好，不同pHpHpH解度。离了强度阶段洗脱是使用其有一样pH而离子强度不同的同一种缓冲液进展接增加缓冲液中缓冲物质的浓度来增加离子强度，例如，起始缓冲液承受mol/L液中被洗脱而与在其他离子强度下被洗脱的杂质实现分别。6.7-8果的比较，可以看出阶段洗脱要优于梯度洗脱。但阶段洗脱有时效果并不抱负，图6.7-9显示了用离子强度阶段洗脱和线性梯度洗脱某混合物的分别效果。明显阶段洗脱效果较差，峰2和峰6在线性梯度洗脱时又分出儿个组分，而峰3和峰4实际上是同一组分，在阶段洗脱时pH承受阶段洗脱来优化分别效果，缩短操作时间。图6.7-8 离子强度线性梯度洗脱和阶段洗脱分别牛血清蛋白图谱QAE-Sephadex-50；样品为4mL3%pH6.5，0.1mol/LTris-HCl0.2mL/min图6.7-9 离子强度阶段洗脱和线性梯度洗脱效果比照梯度洗脱梯度洗脱与阶段洗脱原理上是一样的，但由于洗脱剂的洗脱力量是连续增pH获得连续线性pH梯度比较幽难，它无法通过按线性体积比混合两种不同pHpHpHpH它再现性好而且易于产生，只需将两种不同离子强度的缓冲液(起始缓冲液和极限缓冲液)按比例混合即可得到需要的离子强度梯度，此过程中缓冲液的pH始0.02~0.05mol/L。极限缓冲液NaC1pHTris-HC1.Tris-HC1两种缓冲液按肯定的比例混合，可以得到NaC1浓度在0~1mol/L连续变化的离子强度梯度。在色谱过程中梯度缓冲液可以通过梯度混合器来获得。最简洁的梯度混合6.7-10为市售梯度混合器，它们都是依据连通器原理来产生连续变化的梯度。容器AB中放置极限缓冲液，容器AB通过管路相通，容器AA、B路，当容器A中液体作为洗脱缓冲液流出时，其液面下降，依据连通器原理，BA中，使容器AB持全都，此过程中容器A中的洗脱缓冲液离户强度在不断增加，到两个容器中液休都用完的时刻，容器A中的洗脱缓冲液等价于极限缓冲液。在洗脱过程中NaCl浓度)可以依据以下公式计算得出:(6.7-5)

C = C2 - (C2-C1)(1-v/V0)A2/A1式中 C—容器A中流出洗脱剂体积为v时洗脱缓冲液的盐浓度，mol/L;C1一起始缓冲液中的盐浓度，一般为0;C2—极限缓冲液中的盐浓度;v一已经从梯度混合器中流出的洗脱剂的体积，LrnL;Vo—梯度洗脱剂的总体积，是起始缓冲液和极限缓冲液体积的总和Al一容器Acrn2；A2—容器B图6.7-10 梯度混合器装置缓冲液的容器横截面积小一于盛放极限缓冲液的容器时，产生的是凸形梯度;当A1＞A2时，即盛放起始缓冲液的容器横截面积大于盛放极限缓冲液的容器时，1物首次进展离子交换分别，猛烈建议承受线性梯度，多数状况下NaCl0~0.5mol/L度外形确实定绝不是随便的，而是依据线性梯度洗脱结果进展优化而来的。图6.7-11 梯度的外形及产生装置图6.7-12 梯度斜率对区分率的影响色谱柱为 MonoQHR5/5；样品为局部纯化的强啡肽转化酶；起始缓冲液为 pH7.0，20mmol/LTris缓冲液；极限缓冲液为含lmol/LNaC1的pH7.0，20mmol/LTris缓冲液；流速为1rnL/min梯度的高度与完成此梯度时所用洗脱剂体积(或时间)的比值。通常较低的斜率有6.7-12显示了不同斜率的梯度洗脱在分别效果上的差异，从图中可以看出，斜率降低后区分率得到改善。在洗脱过程中，流速会影响到待分别物质的区分率。在分别低分子量物质到达区分率的要求，再对流速进展优化。亲和洗脱的物从离子交换剂上置换下来的洗脱方式，在亲和洗脱中，解吸是特异性的。1,6-二磷酸果糖作为洗脱剂，CM1,64负电荷，而果糖-1，6-二磷酸酶由4个亚基组成，每个亚基都能结合一个底物1子交换剂上洗脱下来。置换色谱在置换色谱中，承受特别的置换物质来进展洗脱，置换剂与离子交换剂之间具有很强的亲和性，因此包括目的物在内的全部物质都从色谱柱上被置换下换剂上功能基团相反的电荷，因此与交换剂之间有着格外高的亲和力。用置换色谱的方法分别β-乳球蛋白，将100mgβ-乳球蛋白样品加样至3.5mL优势是其容量为一般离子交换色潜的两倍。(五)样品的收集和处理通常色谱柱的下端连接一个紫外检测器，用于检测蛋白质、核酸类组分的280nrn其他性质来判定目标分子。有时会消灭目标蛋白与其他组分未能完全分开的状况，这时需要选择方法成多个洗脱峰，导致这种现象的缘由是多方面的，可能是加样量过大造成的，遇到这种现象时应对其产生缘由进展分析，通过转变色谱条件予以排解。承受冷冻枯燥的方法可以对收集的分部进展浓缩或得到固体样品粉末，如