核酸的分离与纯化技术

第三章核酸的分离纯化技术临床样本处理与分离纯化技术1临床样本的处理2DNA的分离与纯化3RNA的分离与纯化4自动化分离纯化系统第一节临床样本的处理核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3’,5’—磷酸二酯键连接成的一类生物大分子，包括核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸DNA两类。真核生物原核生物染色体DNA（细胞核内，双链线状）细胞器DNA（线粒体或叶绿体，双链环状）染色体DNA

（双链环状）质粒DNA一、临床样本处理的一般原则（一）样本的采集生理活性物质容易失活与降解，采集时要保持取材的新鲜，防止腐败、变质与微生物的污染，按照所需样本的取材时间进行采集，根据不同类型的疾病、病程的不同阶段以及检测方法的要求，收集相应的临床标本，最大限度保证检测结果的可靠性。第一节临床样本的处理（二）样本的运送样本采集后，应尽快送至实验室检测，建议大多数样本采集后在2~8℃的低温条件下运送。（三）样本的保存对于不能及时检测的样本，DNA样本可在2~8℃下保存一周，RNA和蛋白质样本可在-20℃下短期冻存，长期不用的样本可以-70℃或液氮中保存。第一节临床样本的处理二、常见临床标本的处理方法1.血液：分子生物学检验中常见的临床样本，采集前应考虑饮食、药物、采集时间等因素的影响，取样时应避免溶血和产生泡沫。包括血清、血浆、全血、血细胞和无蛋白质的血滤液等。2.体液：尿液、脑脊液、关节积液、浆腔膜积液等，离心后收集沉淀用于核酸提取。3.组织：术后脏器、组织等新鲜材料应迅速剥离脂类和结缔组织，用生理盐水冲洗干净备用。第一节临床样本的处理4.细胞：贴壁生长细胞和悬浮细胞。5.痰液：去除黏蛋白和其他杂质。6.棉拭子：呼吸道、消化道和生殖道等标本的采集。7.特殊样本：带毛囊的毛发、唾液、牙刷、口香糖、烟蒂、口杯、鼻血、精斑、指甲等。第一节临床样本的处理三、组织细胞的破碎第一节临床样本的处理破碎细胞机械法非机械法液体剪切法固体剪切法干燥法溶胞法：化学试剂、酶（方法温和）不适合真核基因组DNA第二节DNA的分离与纯化临床检验中的DNA样本包括真核生物DNA、细菌DNA、质粒DNA、病毒DNA等，结构上有双链环状、双链线性和单链环状。DNA的分离与纯化要遵循保证DNA一级结构的完整和防止被RNA、蛋白及其他分子污染的原则。简化操作步骤，尽量减少对DNA的破坏。一、基因组DNA的分离与纯化第二节DNA的分离与纯化（一）酚-氯仿抽提法以含EDTA、SDS和RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，蛋白酶K消化蛋白，然后用酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100-150kb。第二节DNA的分离与纯化主要试剂的作用

EDTA：1.二价金属离子螯合剂，抑制DNA酶活性；

2.降低细胞膜的稳定性。第二节DNA的分离与纯化SDS：阴离子去垢剂1.溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；3.与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性；4.对RNA、DNA酶有抑制作用。第二节DNA的分离与纯化蛋白酶K：广谱蛋白酶

水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。第二节DNA的分离与纯化无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。第二节DNA的分离与纯化第二节DNA的分离与纯化酚-氯仿抽提法——流程示意图第二节DNA的分离与纯化能有效变性蛋白质，并抑制了DNA酶的降解作用采用实验室常见的试剂和药品，成本低。苯酚和氯仿毒性较大，DNA回收率较低，不能进行微量操作。第二节DNA的分离与纯化（二）吸附柱法硅基质材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化的硅石破坏了基质和DNA之间的吸引力，因而DNA从硅基质上被洗脱下来。第二节DNA的分离与纯化第二节DNA的分离与纯化第二节DNA的分离与纯化（三）磁珠法磁珠法的原理是采用纳米级磁珠，表面标记了对DNA有吸附作用的特定活性官能团，能同DNA发生吸附，通过洗涤液洗涤后，加入洗脱液DNA释放于洗脱液中。同时可以利用磁珠的磁性可以实现定向移动和聚集，不用离心就可以达到与杂质分离的目的。可以实现高能量和自动化。第二节DNA的分离与纯化二、质粒DNA的分离与纯化第二节DNA的分离与纯化细菌的培养先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。细菌的收集与裂解质粒DNA的分离纯化二、质粒DNA的分离与纯化第二节DNA的分离与纯化

常用的碱裂解法，煮沸裂解法，SDS裂解法均可获得较满意效果。按制备量的不同质粒DNA提取与纯化的方法可分为小量制备（1-2ml）、中量制备（20-50ml）和大量制备（500ml）。第二节DNA的分离与纯化（一）碱裂解法简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法在强碱NaOH（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物。当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构，质粒DNA保留在上清液中。第二节DNA的分离与纯化第二节DNA的分离与纯化（二）煮沸裂解法将细菌悬浮于含TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清液中的质粒DNA。第二节DNA的分离与纯化煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取相对分子质量小(＜15kb)的质粒DNA，适用于大多数E.coli菌株。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如HB101及衍生菌。不适用于表达核酸内切酶EndA的菌株。第二节DNA的分离与纯化（三）SDS裂解法将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁用SDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA适合相对分子质量大(＞15kb)的质粒DNA的抽提，但产率不高。三、DNA的鉴定第二节DNA的分离与纯化（一）DNA的浓度鉴定1.紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算DNA浓度

A260×稀释倍数×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。（A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA或RNA，33μg/ml单链寡核苷酸）第二节DNA的分离与纯化第二节DNA的分离与纯化2.荧光光度法荧光染料溴化乙锭EB，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。1-5ng）致癌、致畸和致突变。第二节DNA的分离与纯化溴化乙锭（EB）第二节DNA的分离与纯化（二）DNA的纯度鉴定1.紫外分光光度法通常：纯的DNAA260/A280=1.8

污染：DNAA260/A280﹥1.8提示有RNA污染﹤1.8提示有蛋白质或酚的污染通过A260

与A280的比值来判定有无蛋白质污染和鉴定核酸纯度。第二节DNA的分离与纯化2.荧光光度法用EB等荧光染料示踪核酸电泳，纯的DNA分子较RNA大，迁移率低，多于点样孔附近汇集，可以鉴定DNA制品中有无RNA污染。第二节DNA的分离与纯化RNA第二节DNA的分离与纯化RNA第二节DNA的分离与纯化（三）DNA完整性的鉴定降解：电泳图呈拖尾状四、DNA的保存第二节DNA的分离与纯化

短期贮存：-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中可以保存2年。TE缓冲液的pH与DNA贮存有关，pH为8.0时，可减少DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。EDTA抵制DNA酶活性。长期贮存：

TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。一、RNA提取的特殊要求第三节RNA的分离与纯化RNA酶（RNase）是一类生物学活性稳定的酶类，对RNA有强烈的降解作用，耐酸、耐碱、耐高温，蛋白质变性剂可使之失活，除去变性剂后又恢复活性。细胞内、实验室中的灰尘、各种实验器皿、人体的汗液及唾液中均含有。第三节RNA的分离与纯化为防止RNase对RNA的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。第三节RNA的分离与纯化实验室保持洁净戴手套和口罩尽量选用一次性材料及新包装的化学试剂，严格洗涤、消毒处理玻璃器皿200℃烘烤2h以上，不能烘烤的用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理。实验试剂DEPC水处理，高温高压灭菌去除DEPC冰浴二、RNA的分离与纯化技术第三节RNA的分离与纯化（一）总RNA的分离与纯化1.Trizol试剂法以含异硫氰酸胍、β-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞在pH4.0的条件下，酚-氯仿抽提细胞裂解溶液通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA第三节RNA的分离与纯化快速提取总RNA,具有适用范围广、操作简便、纯度高、污染小等特点。第三节RNA的分离与纯化2.离心柱法硅基质吸附方法，利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来，释放出来的核酸特异的吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对蛋白质、多糖、脂类等其他成分基本不吸附，再把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的总RNA。第三节RNA的分离与纯化可特异吸附核酸,使用方便、快捷，不使用有毒溶剂。第三节RNA的分离与纯化3.磁珠法运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能与RNA分子特异性地识别和高效结合。利用该纳米微球的超顺磁性,在一定条件下，对RNA具有极强的富集能力，当条件改变时可逆地释放RNA,再经清洗、洗脱等步骤，可以去除其他杂质。第三节RNA的分离与纯化具有高质量、高产量、高通量，操作简单快速，无毒无害的特点，易于实现流程自动化。第三节RNA的分离与纯化（二）mRNA的分离与纯化大多数真核细胞的mRNA的3‘-端通常带有长短不一的腺苷酸组成的polyA尾巴，以总RNA为起始材料，利用碱基互补配对原理，寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（OligoT）可以与之配对结合。寡聚（dT）-纤维柱层析法和磁珠法。第三节RNA的分离与纯化1.寡聚（dT）-纤维柱层析法mRNA上的polyA尾巴可与具有OligoT的纤维素柱在高盐条件下碱基配对发生亲和吸附，在低盐条件下，碱基配对被破坏，吸附解除，而其他成分的RNA不具这一特性。因此在高盐条件下，当RNA抽提样品经流柱体时，mRNA被挂在柱上，其他RNA随高盐溶液流出，当用低盐洗脱液洗柱时，mRNA被洗脱液流出，再用有机溶剂沉淀可得到纯化的mRNA。第三节RNA的分离与纯化第三节RNA的分离与纯化第三节RNA的分离与纯化2.磁珠法一般用生物素标记OligoT，亲和素标记磁珠，生物素标记的OligoT和mRNA上的polyA高效杂交形成复合体，复合体可以和亲和素标记磁珠结合，用磁性分离架可以将复合物分离，最后用无Rnase的去离子水将mRNA从复合物中洗脱出来即可。第三节RNA的分离与纯化第三节RNA的分离与纯化三、RNA的鉴定（一）RNA的浓度鉴定1.紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算RNA浓度

A260×稀释倍数×40＝μg/ml（A值等于1时，相当于40μg/mlRNA）第三节RNA的分离与纯化2.荧光光度法荧光染料溴化乙锭EB，可嵌入到碱基平面，而发出橙红荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。第三