定量PCR中-ct值的含义

实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。一.

实时荧光定量PCR原理

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.

Ct值的定义

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。图1.Ct值的确定2.

荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10´SDcycle6-153.

Ct值与起始模板的关系

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。图2.荧光定量标准曲线4.

荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。现将其原理简述如下：TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示。板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著〔7,8〕。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方〔9〕。

AppliedBiosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。

综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域〔10,11,12,13〕。参考文献1.

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基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。

荧光域值（threshold）的设定：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR第3—15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

CT值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线

判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：

1、曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。

2、曲线指数期斜率与扩增效