【卡培立肽合成探究6500字（论文）】

前言卡培立肽合成研究【摘要】本实验是探讨固相化学合成卡培立肽中HOBT、OXYMA这2种偶联添加剂，谁的效果更好，可以合成纯度更高的卡培立肽。用固相合成的方法，采用Fmoc氨基酸为原料，以氯树脂为载体，用DIC/HOBT与DIC/OXYMA两种缩合体系，分别合成卡培立肽。用A/Tis/碘化铵在不加热的条件下进行裂解，得到卡培立肽粗品。并用反相高效液相色谱对它进行纯化，其中HOBT体系得到收率为16.90%、纯度83.40%的卡培立肽，OXYMA体系得到收率25.36%、纯度为93.58%的卡培立肽。用DIC/OXYMA体系合成的卡培立肽收率25.36%、纯度为93.58%均高于大于DIC/HOBT体系合成的卡培立肽。得到的结论是OXYMA价格低廉，且所得成品纯度高，比HOBT更适合多肽的合成。【关键词】卡培立肽，DIC，HOBT，OXYMA，心力衰竭目录TOC\o"1-3"\h\u301341前言 163871.1本论文选题意义 130511.2多肽的研究现状 1284551.3多肽合成 1231621.2.1多肽合成添加剂 3156481.2.2难以缩合的多肽 4154201.4多肽的应用 4191831.3.1药品 4141361.3.2化妆品 4132821.3.3食品 564641.5心力衰竭治疗药物的研究现状 5141521.6卡培立肽的研究现状 546672材料与方法 7173892.1实验试剂 75542.2配制溶液 7155333结果与分析 1081663.1使用HOBT合成的卡培立肽 1098913.2使用Oxyma合成的卡培立肽 1118253.3结果 1213749参考文献 141前言1.1本论文选题意义21世纪是生物的世纪，在这个时代，生物行业飞速发展，出现了许多新药物，尤其是在难以治愈的疾病方面，比如治疗艾滋病的药物恩夫韦肽，用于治疗糖尿病的利拉鲁肽等等。卡培立肽作为一种治疗心力衰竭的药物，它的安全性高，疗效显著，在提高心输出量、降低肺毛细血管楔压(PCWP)方面，均高于尼可地尔，所以卡培立肽值得探索，说不定可以成为利拉鲁肽这样的重量级药物。历史以来，人们在医药行业不停的研究和探索，其目的能够研制出高质量、有效、稳定而又低成本的良药，可以让世界上的每一位消费者都能用的起、买得起高质量的药物，让每一个人都能够看的起病。本文使用Fmoc固相合成法来合成卡培立肽，来探究DIC/HOBT、DIC/Oxyma谁更适合多肽的合成，从而实现合成工艺的优化。1.2多肽的研究现状多肽是有氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接而成的，它介于氨基酸与蛋白质之间，10个以下又叫寡肽，多肽虽然只是蛋白质的一部分，但是具有它的功能基团。二者之间的差别在于空间结构的复杂程度不同，蛋白质具有一到四级的结构，而多肽只有一二级，由于只是它的一部分，所以分子量也要小很多。因此多肽做药物的优点有：容易代谢，不易中毒，因为在体内停留的时间不长，多肽类药物的免疫原性要小于蛋白质类药物，更加稳定，且比蛋白质容易合成、改造，价格也更能让人接受。缺点就是容易被降解吸收，不能口服，给药形式比较麻烦，比如皮下注射等。虽然多肽目前占领药物市场的份额并不大，但是多肽药物是一个热点，它的市场正在迅速膨胀。在全球总共有76个多肽药物获批上市，而中国批准的有26个，但我们可以自主生产的，只有17个。而且这其中大部分都是仿制药，核心技术依然被国外把持，所以我们需要创新。1.3多肽合成多肽合成分为化学合成与生物合成，本文的实验用的是固相化学合成。化学合成多肽时，需要把不参与反应的氨基酸的氨基保护起来，这样可以保证反应按照预设的方向进行，而化学合成按照是否有固定载体可以分为液相合成与固相合成。液相合成EmilFischer创立，一般分为逐步合成与片段合成，当合成的序列比较短时，采用逐步合成，反之，多肽比较长或者缩合困难就采用片段合成。液相合成的优点在于反应浓度比较高，在每一步合成结束时，会有结晶的操作，所以杂质会比较少，得到的粗品纯度会较高，生产的成本也比较低，因此大部分能够规模化生产的多肽都是采用液相合成。但是随着肽链的增长，它的溶解度会越来越低，所以对反应溶剂的要求也会改变，且操作麻烦，需要转移，所以会有一部分的损失，不如由Merrifield提出的固相合成。合成始终在一个反应容器中进行，不需要转移，减少了多肽合成中的损失，固相合成的原理是选择合适的树脂，将氨基酸的羧基端与树脂的Linker键连接，再按照顺序添加氨基酸，进行反应，在反应过程中，需要把不参加反应的氨基酸侧链上的活性基团用保护基保护起来，而氨基酸的保护基及捕获剂如下图所示：图1氨基酸的保护基及捕获剂图固相合成的方法根据氨基的保护基类别主要有Boc(叔丁氧羰基)法和Fmoc(9一芴甲氧羰基)法，Boc(叔丁氧羰基)法的boc对酸敏感,对它进行脱除时，是采用三氟乙酸(TFA)的，而它最后的裂解是用强酸氢氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMsA)来将多肽与树脂分离，因为使用的酸腐蚀性和毒性都很大，对操作人员来说太危险，且多肽在PH较小的条件下，不能稳定存在，易从树脂上脱离。所以现在采用Fmoc(9一芴甲氧羰基)法，它脱除条件温和，低浓度的碱即可脱除保护，且对酸不敏感，可以与Boc联用，其中Fmoc保护α氨基，Boc保护侧链上的氨基，形成正交保护，大大提高了合成效率。固相合成按照反应方式可以有缩合剂法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，最主要的有3种，分别是缩合剂法、原位法、对称酸酐法，缩合试剂法是在加了dic之后，还添加了例如HOBT（1-羟基苯并三氮唑）的物质，可以减少消旋和副反应的发生，提高产率。原位法是直接加碳二亚胺类物质和保护氨基酸在树脂中进行反应，它反应速度快，但是容易有副反应的发生。对称酸酐法它反应速度很快，操作也很简单，适用于合成小分子肽，但是它耗费氨基酸原料较多，且树脂要一直保持良好的溶胀性，所以更多采用的是缩合剂法。1.2.1多肽合成添加剂HOBT与OXYMA都是多肽合成中的偶联添加剂。HOBT是苯丙三唑类的衍生物，是最常使用的偶联添加剂，可以降低手性分子的消旋，提高合成效率。但是HOBT容易发生爆炸，运输、储存皆需要一定的条件，比如防爆，且对身体的呼吸系统、中枢神经系统有危害性。OXYMA（2-肟氰乙酸乙酯）：它具有良好的溶解性，制作它的原材料容易获取，价格低廉，是优良的多肽合成偶联添加剂。MasumiItoh发现OXYMA与碳二亚胺联合使用时，可以显著的抑制多肽消旋化，可使消旋化由35％下降到1．8％，它的作用原理是当O一酰基异脲(0一acylisourea)中间体生成后，由于OXYMA具有强大的吸电子能力，让酰基与之结合，形成活性酯，再氨解，从而生成酰胺物质，它减少了嗯唑酮与N-酰基脲的生成，就很大程度上提高了产率。OXYMA的副产物也更容易处理，毒性更小。而且，OXYMA与醇形成的肟酯还可以收集用于酯的合成可以减少浪费，对环境更为友好。Elfaham等报道在催化N一乙酰赖氨酸与4-氨基苯甲酸偶联反应时，当使用DIC/HOBt体系时，产率是82％，核磁共振氢谱显示有杂质，当使用DIC/OXYMA体系时，产率是88％，核磁共振氢谱显示没有杂质。综上所述，OXYMA的耦合效率要优于HOBt，且Oxyma大大降低了爆炸风险，所以它未来会得到比HOBT具有更广泛的应用。1.2.2难以缩合的多肽当多肽难以缩合的时候，我们可以用的办法有1微波合成；微波的温度很高，这可以促进多肽的合成；2DCM/DMF混溶，溶胀树脂，减少空间位阻；3DMSO/DMF与物质混溶，增加该物质的溶解度；4使用合适取代度的树脂，尽可能减少树脂的用量，确保洗涤、缩合效果；5使用高效缩合剂比如把HOBT换成HBTU、Oxyma等。1.4多肽的应用1.3.1药品抗菌肽不仅可以抑制细菌的生长，当它量多时还可以杀死癌细胞，比如BCp12。多肽疫苗的优点是它的特异性、安全性都比较高，相较其他疫苗，但免疫原性低，可以通过修饰来弥补，用于HPV、艾滋病、肝炎等传染病的预防。与肿瘤基因靶点进行特异性的结合可以诱导癌细胞的凋亡，比如人颗粒蛋白A（HGRNA）。从肽库内还可以筛选细胞因子模拟肽，虽然结构不同，但是具有相似的作用。从动植物体内分离的小分子多肽比如PCSK9单克隆抗体具有明显防治心血管疾病的作用。还有用于诊断时，它主要对病原微生物进行检测，灵敏度、特异性都很高，且容易制备，临床上可以大量使用。1.3.2化妆品多肽由于是小分子物质，比蛋白质更容易被皮肤吸收，且它具有抗氧化、消炎、美白等作用，所以它被广泛添加到化妆品中，在医美市场很火爆。具体的例子比如可以促使皮肤愈合、防止疤痕组织增生的蓝铜胜肽，清除人体自由基、防止过氧化物生成的谷胱甘肽，可以除皱的类肉毒杆菌素，还有水蛭素、棕榈酰多肽等等。1.3.3食品在人体中，蛋白质被吸收大部分时候是以多肽的形式，而不是氨基酸，且吸收多肽的速度比氨基酸快，当多肽添加在食品中，可以让它具有保健作用，比如把玉米多肽添加在酒中，可以保护肝细胞不受损伤。还有将花生多肽添加到需长期保存的食品中，例如月饼，可以保证它的水分不流失，表皮不被氧化，保持了它的外观、口感，还延长了它的保质期。1.5心力衰竭治疗药物的研究现状心力衰竭是指任何原因引起心肌损伤使心肌结构和功能发生改变，导致心室泵血功能降低，不能满足机体需要的临床综合征，是各种心脏病的终末阶段。治疗心力衰竭的药物根据机制不同可以分为：1肾素—血管紧张素—醛固酮系统抑制药：ACEI不仅能缓解心衰的症状，还可以防止心室重构，降低心衰病死率，代表药物为卡托普利，用于治疗心功能不全；血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂：阻断AngII与其受体的结合，抑制AngII的促生长作用，还可以预防、逆转心血管的重构，代表药物为氯沙坦；抗醛固酮药：与ACE抑制药合用降低AngII及醛固酮水平，代表药物为螺内酯。2利尿药：如氢氯噻嗪，可以减轻疼痛，改善体液潴留，是长久用药。3β受体阻断药：改善CHF的症状，长久用药，可能会抑制心肌收缩力，加重心功能障碍。4血管扩张剂：包括硝酸酯类和钙离子拮抗剂，前者比如硝酸甘油，扩张冠状动脉，增加心肌供氧量，后者硝苯地平，可以控制心室重塑现象，改善心肌的舒张功能，但是长久用药，会增加风险。3正性肌力药：如左西孟旦，加强心肌收缩性，提高心输出量。4抗血小板类药物：减轻血液的黏稠程度，防止血管堵塞。5人心房钠尿肽等新药：卡培立肽，可以扩张血管，利尿，对器官起保护作用。1.6卡培立肽的研究现状卡培立肽是由丝氨酸（Ser）、亮氨酸（Leu）、精氨酸（Arg）、半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸（Phe）、甘氨酸（Gly）、甲硫氨酸（Met）、天冬氨酸（Asp）、异亮氨酸（Ile）、丙氨酸（Ala）、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asn)、酪氨酸（Tyr）这几种氨基酸构成的，总共28个氨基酸，它是α型心房钠尿肽,分子式为C127H203N45O39S3分子量：3080.44。结构式如下：图2卡培立肽结构图它与血管平滑肌的ANP（心房利钠多肽）受体结合，使鸟苷酸环化酶的活性上升，从而舒张血管。用于治疗急性心功能衰竭（acuteheartfailure，AHF）和慢性心功能衰竭（chronicheartfailure,CHF）加重，它的不良反应主要是低血压，所以使用卡培立肽时，患者不能有低血压，此外，相关实验表明卡培立肽可以预防心室重构，并保护器官。卡培立肽目前的使用方式是静脉滴注。它目前的生产方式有基因重组技术、Boc路线液相/固相合成法、Fmoc路线液相/固相合成法、Fmoc路线固液结合片段法四种方法，其中基因重组技术的成本高昂，操作麻烦，所得成品杂质较多，纯度不高。Boc路线液相/固相合成法在生产过程中会使用大量的HF、TFA，对操作人员和环境都具有较大的危害。Fmoc路线液相/固相合成法生产周期较长。而Fmoc路线固液结合片段法，可以同时合成多个片段，将时间缩短至原来的1/3,且成本低廉，杂质少，所得粗品的纯度大于75%，最后的收率大于25%，且使用的试剂相对来说，对人和环境来说更为友好，所以Fmoc路线固液结合片段法最适合卡培立肽的商业化生产。致谢2材料与方法2.1实验试剂AR二氯甲烷(DCM)，纯DIC，20%Pip（哌啶），ARDMF(N,N-二甲基甲酰胺)，AR甲醇，工业DMF，HOBT（1-羟基苯并三氮唑），OXYMA（2-肟氰乙酸乙酯），检A（5%茚三酮无水乙醇溶液），检B（80%苯酚无水乙醇溶液），三氟乙酸(TEA)，茴香硫醚，苯酚，Tis（三异丙基硅烷），EDT(1，2-乙二硫醇)，碘化铵，纯水，冰乙醚，乙腈；Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。2.2配制溶液按照AA/dic/oxyma=1:0.95:1的比例来算，氨基酸的浓度要求为0.2mmol/ml,使用的是50ml的氨基酸溶液。OXYMA溶液配制：称取21.3gOXYMA溶45mlDMF中，HOBT称20.3g溶到45mlDMF中。表1氨基酸用量氨基酸分子量质量氨基酸溶液体积（V）Fmoc-Ser(tBu)-OH383.43.8350mlFmoc-Leu-OH353.43.5350mlFmoc-Arg(pbf)-OH648.76.4950mlFmoc-Cys(Trt)-OH585.75.8650mlFmoc-Phe-OH3873.8750mlFmoc-Gly-OH297.32.9750mlFmoc-Met-OH371.53.7250mlFmoc-Asp(otBu)-OH411.54.1250mlFmoc-Ile-OH353.43.5350mlFmoc-Ala-OH311.33.1150mlFmoc-Gln(Trt)-OH6106.1050mlFmoc-Asn(Trt)-OH596.75.9750mlFmoc-Tyr(tBu)-OH4664.6650ml2.2仪器与设备万分之一电子天平；柱状反应器；恒温水浴锅；循环水式真空泵；冰箱；日本岛津LC-20分析型液相色谱仪；日本岛津LC-8制备型液相色谱仪；HPLC质谱仪。2.3方法（1）改造树脂：在电子天平上称取3g氯树脂，1mmol丝氨酸，先倒氯树脂，再加入DCM（二氯甲烷）至树脂刚好鼓动，再加入称好的丝氨酸，加1mlDIEA反应70分钟，再加1mlDIEA和1ml甲醇封头25分钟。（2）洗涤：用工业DMF洗4次（3）脱保护：用20%Pip脱保护，并对树脂进行抽检，检查Fmoc是否脱除，在试管中分别加入1ml检A、检B，并加热60s左右，温度为95℃以上，若前后颜色相差大，即Fmoc脱除。（4）洗涤6次，并用四氯苯酚测试，看是否洗净。（5）缩合：加入对应的氨基酸，并分别加入dic/oxyma、dic/hobt，反应1h。（6）缩合检测：用检A、检B对树脂进行全检，反应结束后，树脂颜色相差不大，即氨基酸缩合完全。若颜色相差大，就再接一遍，然后就是脱保护-洗涤-缩合-缩合检测这几个步骤循环，直到卡培立肽序列合成结束。（7）裂解：用dcm溶胀树脂，甲醇抽干树脂，再转移到船型反应器中，用82.5%TFA、5%茴香硫醚、5%苯酚5%水2.5%EDT的正常切割液加上Tis、碘化铵，在不加热的条件下把卡培立肽从树脂上裂解下来，一般需要3h的裂解时间，完成裂解之后再加4-5倍乙醚进行离心。（8）纯化：用反相高效液相色谱仪纯化，波长为214nm,色谱柱为50*250mm反相C8柱，用常规0.1%TFA/乙腈流动相纯化，分段收集主峰，再冷冻、减压干燥，最后得到目标产物。3结果与分析3.1使用HOBT合成的卡培立肽图3HOBT合成MS图谱图3.1.1是用HOBT合成的卡培立肽于14aa处时取小样做的MS图，理论分子量为1627.832，实际分子量为1625.2，根据公式M=M/Z*N-N算出与实际分子量相差在合理范围之内，可以继续合成。图4HOBT合成MS图谱图3.1.2是用HOBT在合成卡培立肽到28aa处时做的MS图，理论分子量为3080.44，实际分子量为3081.5，根据公式M=M/Z*N-N算出与实际分子量相差在误差范围以内，说明合成成功，可以进行纯化。图5HOBT合成HPLC图谱图3.1.3是用HOBT在合成卡培立肽完成后用反相高效液相色谱仪所做的成品HPLC图谱，根据图我们可以判断出该物质的出峰时间为14分钟左右，用210mg样品经过纯化最后得到了纯度为83.40%的成品35.48mg，收率大约为16.90%3.2使用Oxyma合成的卡培立肽图6Oxyma合成MS图谱图3.2.1是用Oxyma合成的卡培立肽于14aa处时取小样做的MS图，理论分子量为1627.832，实际分子量为1626.7，根据公式M=M/Z*N-N算出与实际分子量相差在误差范围以内，可以继续合成。图7Oxyma合成MS图谱图3.2.2是用Oxyma在合成卡培立肽到28aa处时做的MS图，理论分子量为3080.44，根据公式M=M/Z*N-N算出与实际分子量相差在误差范围以内，说明合成成功，可以进行纯化。图8Oxyma合成HPLC图谱图3.2.3是用Oxyma在合成卡培立肽完成后用反相高效液相色谱仪做的成品HPLC图谱，根据图我们可以判断出该物质的出峰时间为14分钟左右，用210mg样品经过纯化最后得到了纯度为93.58%的成品53.26mg，收率大约为25.36%。3.3结果用Oxyma合成的的卡培立肽收率为25.36%，纯度为93.58%,均高于HOBT所合成的的卡培立肽，收率为16.90%、纯度83.40%，所以Oxyma的耦合效率要高于HOBT，Oxyma更适用于多肽的合成。参考文献[1]赵存友,王洋,韩香.多肽合成中肽键形成的研究进展[J].武警后勤学院学报(医学版),2016,25(01):72-76[2].多肽药物专家共识[J].药物生物技术,2020,27(01):14-16.[3]陆冬冬,乔春华,张国庆,白俊才,谈技.固液结合法合成抗肿瘤多肽药物醋酸布舍瑞林[J].中国医药工业杂志,2014,45(11):1004-1008.[4]RBMerrifield.Solidphasepeptidesynthesis.I.Thesynthesisoftatetrapeptide[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,1963,85(14):2149-2154.[5]王浙锋.固相合成活性肽工艺优化及活性验证[D].福州大学,2011.[6]孙鹏程.缩宫素的固相合成及其纯化方法的设计和优化[D].海南大学,2015.[7]董倩,琚滢蓥,徐宏伟,叶小惠,成美玲,孔毅.布舍瑞林的合成制备研究[J]药物生物技术,2014,21(05):412-415.[8]李敏.氮杂多肽的固相合成方法研究及其应用[D].重庆大学,2019.[9]狄曼,郭丽媛,孔露,何子儒,黄胜堂,吴诗.Oxyma及其衍生的新型偶联试剂[J].湖北科技学院学报(医学版),2019,33(03):267-272.[10]AdamD.McF