2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体课件高二下学期生物人教版选择性必修33

第2章

细胞工程第2节

动物细胞工程第2课时

动物细胞融合技术与单克隆抗体植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养温故知新：植物体细胞杂交技术打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和障碍，培育出新的作物类型。实例：1970年，人—鼠细胞荧光标记融合实验人细胞鼠细胞红色荧光染料标记的膜蛋白绿色荧光染料标记的膜蛋白细胞融合人鼠杂交细胞37°培养40min细胞融合实验表明：细胞膜具有流动性有没有技术能让不同种动物的体细胞杂交？思考：动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处？无需去除细胞壁；全能性受限制，不能培育成新的动物个体。显微镜下的动物细胞融合动物细胞融合概念原理诱导方法使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。细胞膜具有一定的流动性物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活病毒诱导法一、动物细胞融合技术动物细胞融合特有的诱导方法思考：灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么呢？灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。动物细胞融合完成的标志动物细胞融合结果意义运用形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。第一第二第三为制造单克隆抗体开辟了新途径。研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。一、动物细胞融合技术植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能植物体细胞杂交和动物细胞融合比较(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒(

)(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构(

)(3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞(

)×√判断下列正误×二、单克隆抗体及其应用病原体处理呈递辅助性T细胞结合记忆B细胞浆细胞抗体第一信号分裂、分化

并分泌细胞因子分裂分化促进产生分泌第二信号B细胞抗原呈递细胞结合抗体与病原体结合后形成沉淀等，进而被其他免疫细胞吞噬消化。摄取知识回顾：抗体的产生血清（抗体主要分布部位）传统抗体制备方法:向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。缺陷：产量低、纯度低，特异性差血清含量有限(一)传统抗体制作方法及缺陷：二、单克隆抗体及其应用抗体1抗体2抗体3抗体4…….动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种抗原1抗原2抗原3抗原4B细胞1B细胞2B细胞3B细胞4…….每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体刺激刺激刺激刺激(一)传统抗体制作方法及缺陷：二、单克隆抗体及其应用抗体1抗体2抗体3抗体4…….动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种抗原1抗原2抗原3抗原4B细胞1B细胞2B细胞3B细胞4…….每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体刺激刺激刺激刺激血清中获取纯度低特异性差需要得到若能得到大量的B细胞4就可以(一)传统抗体制作方法及缺陷：问题:若我们只需要大量的抗体4有什么办法吗？二、单克隆抗体及其应用（１）动物体内产生的特异性抗体种类多达百万种；（２）每个B淋巴细胞（浆细胞）只分泌一种特异性的抗体。科学家发现：遗憾：如何解决这一难题？二、单克隆抗体及其应用如何获得大量、单一的抗体？每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体单一B淋巴细胞细胞群选择克隆产生大量纯度高特异性强的抗体B淋巴细胞不可能无限增殖一个极富创造力的方案：动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体1975年，米尔斯坦和柯勒1984年，诺贝尔生理学或医学奖二、单克隆抗体及其应用二、单克隆抗体及其应用1.制备单克隆抗体的原理（1）每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，在体外培养条件下，不能无限增殖。（2）骨髓瘤细胞能无限增殖，不能产生抗体。（3）通过动物细胞融合技术将两种细胞融合，得到的融合细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体。骨髓瘤细胞能无限增殖能产生抗体B淋巴细胞从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养多种已免疫B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合小鼠的脾脏中获取注射特定的抗原,小鼠脾产生特定抗体的淋巴B细胞2.单克隆抗体的制备过程：B细胞1B细胞2B细胞3B细胞4B细胞2B细胞3B细胞4骨髓瘤细胞B细胞1杂交1杂交2杂交3杂交402杂交瘤细胞（多种）置于选择性培养基上培养第一次筛选融合的细胞B细胞自身融合未融合的B淋巴细胞B瘤骨髓瘤细胞自身融合未融合的骨髓瘤细胞2.单克隆抗体的制备过程B瘤B瘤第一次筛选：用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。【第一次筛选】获得杂交瘤细胞①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。②B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。筛选出杂交瘤细胞方法？培养基中加入氨基嘌呤（HAT选择培养基）B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞

克隆化培养2.单克隆抗体的制备过程第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞

克隆化培养2.单克隆抗体的制备过程抗原4第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞

抗体检测2.单克隆抗体的制备过程抗体检测呈阳性第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞

抗体检测2.单克隆抗体的制备过程第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞使用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过克隆化培养和抗体检测，即可获得大量能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养单克隆抗体体内或体外培养注射到小鼠腹腔2.单克隆抗体的制备过程腹内培养相对于体外培养的优点：不需要特定的培养基，不需要严格控制环境条件。单克隆抗体的制备过程单克隆抗体杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内培养第一次筛选骨髓瘤细胞

诱导融合分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群提取已免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术特异性强灵敏度高可大量制备注射抗原单克隆抗体的制备过程选择性培养基上培养第二次筛选克隆化培养抗体检测既能大量繁殖又能产生专一抗体单克隆抗体的制备小结（1）该过程中应用到的技术_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）诱导融合的方法______________________________________动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法（5）第一次筛选的目的______________________

第一次如何筛选___________________________

筛选原理_________________________________________________________________________________筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长单克隆抗体的制备小结（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________（7）第二次筛选的目的________________________________________________如何筛选___________________________________________________选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________

_____________（8）抗体检测原理_______________________________________获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）既能迅速大量增殖，又能产生抗体（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________（10）如何获取单克隆抗体①体外培养___________________________②小鼠腹腔内培养_________________________（11）单克隆抗体的优点______________________________________________________________________________在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备阳【资料1】用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。具有准确、高效、简易、快速特点诊断优点：3.单克隆抗体的应用作为诊断试剂——最广泛的应用抗体药物接头ADC被细胞吞噬释放药物溶酶体裂解细胞凋亡【资料2】使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates,ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。3.单克隆抗体的应用用于治疗疾病和运载药物讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。二、单克隆抗体技术及其应用3.单克隆抗体的应用讨论2：除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？①

可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②

一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。讨论3：单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？①

单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；②

ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。抗体药物接头ADC被