高三一轮复习生物基因工程及其应用课件

微专题三基因工程及其应用一

基因表达载体的构建要点解读1.构建基因表达载体不可缺少的工具酶是限制酶和DNA连接酶。2.选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因,从而确定限制酶的种类。限制酶切割载体的切割位点并不是任意的,切点所处位置必须在所需要的载体基因片段之外,避免载体因目的基因的插入而失活或影响鉴定和筛选。必须保证载体上至少有一个完整的标记基因,以便于检测。(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。

①不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如上图不能选择SmaⅠ。②应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如上图可选择PstⅠ或PstⅠ和EcoRⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,应使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如上图选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶,但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点,且切割位点不在标记基因内部。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保具有相同的末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等,因此所选择的限制酶不能破坏质粒上的所有标记基因,即至少要保留一个标记基因,用于重组DNA的鉴定和筛选,如上图中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因,不能选用。3.E.coliDNA连接酶只能连接双链DNA的黏性末端,而T4DNA连接酶既可连接双链DNA的黏性末端,又可连接平末端。因此,在构建基因表达载体时要根据限制酶切割的结果来加以选择。4.若用同一种限制酶切割质粒和目的基因,会形成四个相同的黏性末端,则可能出现多种连接方式。例如,①质粒和质粒连接;②目的基因和目的基因连接;③质粒的自身环化、目的基因的自身连接;④质粒和目的基因的连接。质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种。目的基因与质粒的反向连接会导致密码子的顺序发生改变,进而使起始密码子和终止密码子位置改变,最终导致翻译不能正常进行而无法得到正常的表达产物。典例剖析【例1】图甲、图乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的切割位点,AmpR表示氨苄青霉素抗性基因,NeoR表示新霉素抗性基因。B下列叙述错误的是(

)A.图甲中的质粒用BamHⅠ切割后,含有2个游离的磷酸基团B.在构建重组质粒时,可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNAC.导入目的基因的大肠杆菌可在含新霉素的培养基中生长D.用PstⅠ酶切,无法避免目的基因和质粒的自身环化答案:B解析:在构建重组质粒时,不能用BamHⅠ切割质粒和外源DNA,会破坏目的基因。二

新型冠状病毒的检测要点解读1.抗体检测。新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒采用间接法检测人体中的新型冠状病毒IgM抗体,最快可在15min内通过肉眼观察获得检测结果。其实质是抗原—抗体杂交技术,但是,目前抗体检测还不能完全替代核酸检测。2.核酸检测。(1)新型冠状病毒是一种RNA病毒,病毒中特异性的RNA序列是区分该病毒与其他病原体的标志物。(2)检测原理:新型冠状病毒的核酸检测采用“实时荧光定量PCR”技术,利用荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行检测分析。因PCR反应模板仅为DNA,因此在进行PCR反应前,应将新型冠状病毒的RNA逆转录为cDNA。在PCR反应体系中,包含一对特异性引物以及一个Taqman探针,该探针为一段特异性寡核苷酸序列,两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;若反应体系存在靶序列,PCR反应时探针与模板结合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解,报告基团与淬灭基团分离,发出荧光。每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子产生。实时荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关,病毒核酸浓度越高,Ct值越小。典例剖析【例2】新型冠状病毒是一种单链RNA病毒,新型冠状病毒的核酸检测采用“实时荧光定量PCR”技术,通常在1~2h内即可得到检测结果。此方法是PCR和荧光检测技术的结合,利用荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行检测分析。步骤如下,请回答下列问题。(1)利用样本中提取的RNA获得cDNA,过程①使用

酶。需要将样本中的RNA经过过程①形成cDNA后再进行PCR扩增的原因是

。

(2)一次PCR一般要经历30次循环,每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步,每一步都要控制好相应的温度,延伸的温度

(填“大于”“小于”或“等于”)复性的温度,而

(填“大于”“小于”或“等于”)变性的温度。

(3)过程②中对cDNA序列进行扩增,需设计2种引物。下图为cDNA的部分序列,2种引物的结合位置是

。

(4)在检测过程中,随着PCR的进行,反应产物不断累积,“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加,为了保证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才能判断为阳性,最终确诊。虽然“实时荧光定量PCR”技术是当前被广泛认可的检测手段之一,但仍然存在有“假阴性”现象,结合上述内容,分析可能产生“假阴性”的因素有

(填字母)。

A.取样不规范导致所获样本量不足B.样本运输中出现了损坏C.检测样本被污染D.病毒相应关键序列发生了改变答案:(1)逆转录PCR扩增必须以DNA为模板,RNA不能作为PCR扩增的模板(2)大于小于(3)Ⅱ和Ⅲ(4)ABCD解析:(1)利用样本中提取的RNA获得cDNA属于逆转录的过程,故需要逆转录酶的催化。PCR扩增必须以DNA为模板,RNA不能作为PCR扩增的模板,所以需要将样本中的RNA经过逆转录过程合成cDNA。(2)延伸的温度为72

℃左右,复性的温度为50

℃左右,变性的温度一般为90

℃以上,所以延伸的温度大于复性的温度,小于变性的温度。(3)在引物作用下,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,所以引物的结合部位是DNA链的3'端,即Ⅱ和Ⅲ。(4)取样不规范导致所获样本量不足,会使得荧光信号的强度达不到阈值;样本运输中出现了损坏,也会影响PCR过程中DNA的扩增,使荧光信号的强度达不到阈值;检测样本被污染,会导致荧光信号的强度比例受影响;病毒相应关键序列发生改变,会影响引物与cDNA的结合,从而影响荧光信号的强度比例。1.S基因与作物甜度相关,可用于培育转S基因作物新品系。如下图所示,为使S基因按正确方向与质粒连接,选用的限制酶组合是(

)A.XbaⅠ和SalⅠB.EcoRⅠ和HindⅢC.BamHⅠ和HindⅢD.XbaⅠ和HindⅢ答案:DS基因Ti质粒2.图1为限制性内切核酸酶SalⅠ和XhoⅠ的识别序列与切割位点示意图。用SalⅠ切割目的基因两侧,用XhoⅠ切割载体质粒,再用DNA连接酶处理可形成重组质粒。研究人员用2种酶单独切割或同时切割普通质粒和重组质粒,再将产物进行电泳分离,其结果见图2。图1图2下列叙述正确的是(

)A.SalⅠ切割产生的黏性末端与XhoⅠ切割产生的黏性末端不同B.根据重组质粒的酶切结果可知有2个目的基因插入重组质粒中C.重组质粒上有1个限制酶SalⅠ和1个限制酶XhoⅠ的识别序列D.2种酶切割产生的2kb产物可作为探针筛选含目的基因的受体细胞C解析:SalⅠ切割产生的黏性末端与XhoⅠ切割产生的黏性末端都是3'-AGCT-5',A项错误。普通质粒长度都是5

kb,用1种酶切割重组质粒得到的结果都是7

kb,用2种酶切割重组质粒得到的结果为5

kb和2

kb,说明有1个目的基因插入重组质粒中,重组质粒上有1个限制酶SalⅠ和1个限制酶XhoⅠ的切割位点,B项错误,C项正确。2种酶切割产生的2

kb产物需要经过荧光标记,然后解链成为单链DNA分子才可以作为探针筛选含目的基因的受体细胞,D项错误。3.新型冠状病毒是一种RNA病毒,临床检测最初采用核酸检测的方法,该方法首先要进行DNA的扩增,其一般过程是先通过一定的方法从患者体内获得该病毒的RNA,然后通过相应的酶合成cDNA(互补DNA),最后在特异性引物的帮助下扩增DNA。下列相关说法错误的是(

)A.此过程用到了逆转录酶、TaqDNA聚合酶和DNA连接酶等B.所设计的引物应该能与cDNA特异性结合C.从患者体内获得的RNA中可能包含患者自身基因转录的RNAD.核酸检测扩增DNA时用到了PCR技术A解析:以病毒RNA为模板合成cDNA的过程需要逆转录酶,以cDNA为模板扩增DNA的过程需要Taq

DNA聚合酶,不需要DNA连接酶。4.甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质,为了改善黄瓜的品质,科学家利用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞,得到了转基因植株。图1、图2分别为甜蛋白基因编码链(仅示部分碱基)和Ti质粒的示意图,其中①~⑤表示不同位点。请回答下列问题。图1图2(1)基因表达载体包括启动子、

等。其中启动子的功能是

。

(2)下表为不同限制酶的识别序列和切割位点,在构建甜蛋白基因表达载体时,应选用的限制酶是

。

(3)科研人员对载体Ti质粒进行改造时,需要插入多个限制酶单一切点,应选择在图2中的位点

(填序号)处插入。T-DNA