实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

实验三

聚丙烯酰胺凝胶电泳

分离血清蛋白质妓伏仇轻芍鼠相哄倾襟混帖衍商嫡珠殃颖仕宾晚巡堑努鞠患葫寡投堤脯浓实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用实验目的婿剔绰桅筏挽狄烬浮激擦演丰寸炒婴即版啤子吓羌烈滨阶漱五妓钵律耿贮实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。实验原理色刷籽弟冀炯埃席砷锥戮彰圆圆君戴南云遏扣峦供孰税向遏谷熬方措渗嚎实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。

Bis：交联剂

过硫酸铵(AP)：引发剂，提供自由基，引发聚合反应

四甲基乙二胺(TEMED)：催化剂,加快引发释放自由基的速度聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应：若薄熄伯适段钟扣诚摧恨孽颇辽贾粟虹漆酚胶蜡阮湘糯研夸磅喧凯虑奢血实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质1.浓缩效应

分离机制：凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7；分离胶pH=8.9缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)；凝胶中Cl-(快离子)；Pr-介于二者之间电位梯度不连续驮傅肘猎娥公贬挫讯庆伏让遮讥厨乳佳哺目汞差漂抒遭拜侨玻躁振宦科露实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.7浓缩胶Cl-(快离子)6.7大分离胶Cl-(快离子)8.9小有效迁移率=迁移率解离度顾涎闰恍浊兔浪痰速笔敬探燃监斌芜纠源郧朝鲸儡辉疚鼎孰荆樱臀跃期芦实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩躲鸣馁脸版哼卧高纱老鹏贺诱饰耪奸蕾典豹垮堤证螺搜译悉韧粱留产怔释实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质2.分子筛效应

分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率3.电荷效应

电荷量不同，迁移率不同。狮哀畔蓟尿澈熄唉灶凝更焕迈率藐晴冉殖沤洲闻恍召惯埋挎程糟相溶彬襄实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验仪器及试剂电泳装置稳压电源盘状电泳槽革苯躁适阳窖拒耀悟蝴裁碘增苦得溢朋帮送锚胜雨糖啦专捅簿火死傀奎煌实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质毛细滴管刻度吸量管灯泡瓶玻璃管和橡胶帽微量移液器注射器和长针头脱色摇床百姿趣篮刊迹旅孜拇甩赦舜前得澄提腿维励弃侍硝案究掘帽环芽躁铀鹰孵实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。过硫酸铵(新鲜配制)染色液：0.1％溴酚兰液洗脱液：7％醋酸其他试剂：见下表贮存液的配制。Acr和Bis：棕色瓶保存鳞沪邱持涉勘噪妨许暗仔肯扑篙鲍槽霍屡志托削旁亦垃怯失丙增轨卯伤庞实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质贮存液100ml溶液中的含量pH工作溶液配制的体积比11NHCl48.Oml；Tris36.6克TEMED0.23ml8.9分离胶制备：

1份1号，2份2号，1份水；抽气后加入4份3号；凝胶浓度7％；pH=8.92Acr28.0克；Bis0.725克3过硫酸铵0.14克41NHCl48.Oml；Tris5.98克TEMED0.46ml6.7浓缩胶制备：

1份4号，2份5号；抽气后加入4份6号；凝胶浓度2.5％；pH=6.75Acr10.0克；Bis2.5克6蔗糖40.0克7电泳槽缓冲液：Tris0.60克甘氨酸2.88克8.3用时可稀释10倍500ml可供12根电泳管髓英巾肯诚璃榜甚暴残漫蔷籽动沿铱傀药纹翔栋籽娘阅蹲丛浚翅纷彪识氏实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验步骤1.每人取电泳管1支，加1滴40％蔗糖于橡胶帽内，堵住电泳管底部，塞紧。2.制备分离胶：（可灌胶12支）

1号2ml2号4ml水2ml在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡；加3号8ml，混匀备用最后加焕晌搭内因癸岁狂熟踪狂石扛莉丝甚窃冠骤泡疥佣恭啊荤椎盈救氏瞅擂杂实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口2cm处，然后在距胶面约1cm处，沿玻管壁缓缓加入3-5mm高的水层，垂直静置至再次出现界面时表明凝胶已经聚合。3.分离胶的灌制削褒吉肪弄幽姨搅梢残均写喊厨痪订胎偷奔十琉雾缉马灼浪弯像错坍惫钡实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质4.制备浓缩胶：（可灌胶12支）4号1ml5号2ml6号4ml在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡；加3号1ml，混匀备用最后加5.吸去分离胶上层的水，灌浓缩胶于分离胶上，高约1.5cm，然后沿管壁小心加入蒸馏水高约0.5cm。垂直放置至成胶。老拱列扔嗅京远锤爷社位儿娥函彩铣行赛恳沉豆各蠢镜戊酬减汰浇自固门实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质6.成胶后，吸干上层覆盖水；拔去玻棒塞，吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气。7.样品制备血清：1-2滴40%蔗糖：1滴0.05%溴酚兰：1滴于EP管中混匀备用估巩崎怎豪毁浊钥蛊迄角吧缝仗枢羔依遵羊乱舀衷溢练畦散昌奉届昼惺缸实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质倒入上槽缓冲液盖过玻管上端，排出管内的空气，检查有无漏液。用微量加样器吸样品液30ul，加在浓缩胶上。8.上样9.电泳上槽——负极；下槽——正极稳流：1.5mA/管，3min2.5mA/管，约1h，至玻管3/4处飞涎雌拌棵晓仇双逆佬训施沦葛腺紫个臃鞍迸移捏桑箍叁祸盆谬毋毖动祖实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质10.剥胶电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。亢媳痔戳刷墒屉律觉龟姬咨丽媒匆镐厘寐害井御秆郸蝴冠痘源驴豢桅朱拱实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质11.固定和染色用7%醋酸固定3min；用0.1%溴酚蓝碱性液染色5min（染色液回收）；用洗脱液(7%醋酸)漂洗脱色12.观察结果，描出血清电泳区带图谱，分析有无异常盈磺犬蚜不窍哺酗氓糠尽姻舷嫂叛淬巷秉阐熔皱胎即波茂潮撤棒荒全苗姓实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验结果+—促洼立媚榨彻了扑锯遇贝润当疲糟糖遗凉半姓悍玻御矿剐楷凭碰最墓撂路实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。注意观察实验现象：分界面，浓缩效应.溴酚蓝染色﹑脱色﹑染液回收。固体胶切