沈萍微生物学专家讲座

第六章微生物生长

繁殖与控制沈萍微生物学专家讲座第1页本节重点1、细菌生长曲线概念，几个时期，各期特点，生产上怎样应用。2、几个概念：生长，同时培养，连续培养3、微生物测定方法沈萍微生物学专家讲座第2页序：

微生物生长表现在微生物个体生长与群体生长两个水平上。

微生物个体生长表现为个体质量和体积增加。

微生物群体生长是以微生物细胞数量或微生物群体细胞物质量增加作为生长指标。因而要了解微生物生长规律，就要了解微生物个体生长和群体生长两个方面。沈萍微生物学专家讲座第3页单细胞微生物个体生长表现为细胞体积增加和细胞内物质含量增加两个方面,当细胞生长到一定时期，就分裂成为两个子细胞。多细胞微生物个体生长则反应在组成个体细胞数目增加和每个细胞个体生长两个方面。第一节细菌个体生长

沈萍微生物学专家讲座第4页（一）染色体DNA复制和分离

细菌细胞生长两种类型：依据细胞是否在分裂发生之前就开启新一轮DNA复制而将细菌细胞生长分为快速生长和慢速生长两种类型。

复制区沈萍微生物学专家讲座第5页沈萍微生物学专家讲座第6页二、细胞壁扩增“背靠背合成”方式：如链球菌和一些G+球菌

“分散合成”方式：大肠杆菌等G-杆菌

横隔形成区沈萍微生物学专家讲座第7页分裂蛋白和横隔前体成份横隔形成细胞分裂间隙期G染色体复制期C分裂期D三、细菌分裂与调整细胞周期各期开启机制（以大肠杆菌为例）：

DNA复制开启：细胞必须到达某一阈值体积或起始物质量。细胞分裂期D开启：只有当细胞到达某一阈值长度后才能进行染色体分离，分裂成为两个细胞。

DNA复制开启到达生物量阈值DNA复制与分离到达长度阈值分开DNA拷贝细胞分裂过程开启时间（min）沈萍微生物学专家讲座第8页一、生长规律（一）、生长曲线－－细菌接种到均匀液体培养基后，在不补充营养物质或移去培养物时，以时间为横座标，以菌数为纵座标，作出一条反应细菌在整个培养期间菌数改变规律曲线，这种曲线称为生长曲线(GrowthCurve)。（二）、分期－－迟缓期；对数生长久，稳定生长久，衰亡期第二节细菌群体生长繁殖沈萍微生物学专家讲座第9页1、微生物生长曲线沈萍微生物学专家讲座第10页1）迟缓期迟缓期特点•生长速率等于零细胞合成新成份–补充消耗材料–适应新培养基或别培养条件•细胞形态变大或变长对外界不良环境敏感沈萍微生物学专家讲座第11页影响迟缓期长短原因与实践意义

接种龄:对数期“种子”，迟缓期较短；迟缓期或衰亡期“种子”,迟缓期较长；接种量：接种量大，迟缓期较短；接种量小，迟缓期较长；

培养基成份:培养基成份丰富，迟缓期较短；培养基成份与种子培养基一致,迟缓期较短；沈萍微生物学专家讲座第12页2）对数生长久特点•生长速率最快，细胞呈指数增加生长速率恒定，代时最短代谢旺盛，细胞成份平衡发展,•群体生理特征较一致沈萍微生物学专家讲座第13页生长数学模型Nt=N0×2n

lgNt=lgN0+nlg2n=lgNt-lgN0=lgNt-lgN0lg20.301n=3.322(lgNt－lgN0)

t－t0

G=－－－－－－－－－-

3.322（lgNt－lgN0)沈萍微生物学专家讲座第14页世代：由1个细胞分裂成为2个细胞间隔被称为世代。代时：就是一个世代所需时间，因而也就是群体细胞数目扩大1倍所需时间，有时也被称为倍增时间。

沈萍微生物学专家讲座第15页影响对数期原因

菌种：不一样菌种代时差异极大

营养成份：营养越丰富，代时越短

营养物浓度：影响微生物生长速率和总生长量

培养温度：影响微生物生长速率对数期实践意义

是代谢、生理研究良好材料是增殖噬菌体最适宿主菌龄是发酵生产中用作“种子”最正确种龄G+染色判定时采取此期微生物沈萍微生物学专家讲座第16页3）稳定生长久特点：

活细胞总数维持不变，即新繁殖细胞数与衰亡细胞数相等，菌体总数到达最高点。细胞生长速率为零细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化，细胞成份合成迟缓，G+染色发生改变。为何细胞总数不再增加？沈萍微生物学专家讲座第17页稳定生长久实践意义是发酵生产中以菌体为终产品最正确收获期；一些代谢产物尤其是次生代谢产物发生在此阶段，一些细菌芽孢也发生在此阶段，故又称作代谢产物合成期；造成了连续培养原理提出和工艺技术改进。沈萍微生物学专家讲座第18页4）衰亡期特点：

•细胞以指数速率死亡，有时细胞死亡速率降低是因为抗性细胞积累；细胞变形退化，有发生自溶，G+染色发生改变。沈萍微生物学专家讲座第19页影响衰亡期原因及实践意义与菌种遗传特征相关:有些细菌培养经历全部各个生长时期，几天以后死亡,有些细菌培养几个月乃至几年以后依然有一些活细胞；与是否产芽孢相关：产芽孢细菌更易于幸存下来；与营养物质和有毒物质相关：补充营养和能源，以及中和环境毒性，能够减缓死亡期细胞死亡速率，延长细菌培养物存活时间。沈萍微生物学专家讲座第20页（三）丝状微生物群体生长

丝状微生物包含具分支原核生物放线菌和真核生物丝状真菌。

1.丝状微生物群体生长特征

这类微生物在液体培养基中即使也能够几乎均匀分布菌丝悬浮液方式生长（丝状生长）。但大多数情况下是以分散沉淀物方式在发酵液中出现（沉淀生长），沉淀物形态从涣散絮状沉淀到堆集紧密菌丝球不等。沈萍微生物学专家讲座第21页起始培养时菌丝体培养18小时后菌丝体图示丝状真菌沉淀生长沈萍微生物学专家讲座第22页影响原因：接种体积大小、接种物是否凝集、以及菌丝体是否易于断裂等原因综合作用决定着丝状微生物是丝状生长还是沉淀生长。工业发酵意义：丝状微生物在液体培养中生长方式在工业生产中很主要，因为它影响发酵过程通气性、生长速率、搅拌能耗及菌丝体与发酵液分离难易等。沈萍微生物学专家讲座第23页2.丝状微生物群体生长曲线

丝状微生物群体生长有着与单细胞微生物类似规律。沈萍微生物学专家讲座第24页沈萍微生物学专家讲座第25页分批培养优缺点优点操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量轻易掌握缺点产率低，难以自动控制非生产时间占用多沈萍微生物学专家讲座第26页二.生长数学模型三.主要生长参数四.同时培养概念：方法

机械法：离心，过滤，硝酸纤维素滤膜环境控制：温度，营养，光暗交替五.连续培养概念：经过一定方式使微生物能以恒定比生长速率生长并能连续生长下去一个培养方法。

以一定速率流加培养基以一样速率流出培养物沈萍微生物学专家讲座第27页单罐循环式连续培养连续离心机浓缩细胞培养基流入最终流出液沈萍微生物学专家讲座第28页多罐连续培养流入流出沈萍微生物学专家讲座第29页管式反应器连续培养培养液管式反应器种子罐培养基沈萍微生物学专家讲座第30页连续培养优缺点优点控制稀释速率能够使发酵过程最优化；发酵周期长，得到高产量；便于自动控制缺点菌种不稳定话，长久连续培养会引发菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。沈萍微生物学专家讲座第31页思索题：1、细菌生长曲线，对数生长久，连续培养，同时培养，菌落形成单位（cfu），同时生长，连续发酵，2、什么是细菌生长曲线？分几个时期？各有何特点，生产上怎样应用？3、什么是分批培养和连续培养？试述其优缺点。沈萍微生物学专家讲座第32页第六章微生物生长

繁殖与控制（续）沈萍微生物学专家讲座第33页〖本节重点〗霉菌几类孢子及酵母菌繁殖方式温度、pH、氧对微生物生长影响平板菌落计数法沈萍微生物学专家讲座第34页第三节真菌生长与繁殖一.丝状真菌生长繁殖1.断裂繁殖2.孢子繁殖无性孢子

游动孢子，分生孢子，节孢子，厚垣孢子，孢囊孢子有性孢子卵孢子，接合孢子，子囊孢子3.丝状真菌生活史二.酵母菌生长繁殖见前叙述沈萍微生物学专家讲座第35页丝状真菌细胞顶端生长图4丝状真菌菌丝细胞顶端生长模型图示Allomycesmacrogynus菌丝顶端生长沈萍微生物学专家讲座第36页一.环境对微生物生长影响

1.营养物质(nutrient)

2.水活性(wateractivity)

微生物aw范围

aw=0.6---0.99

细菌要求aw较高霉菌要求aw较低第四节环境对生长影响及

生长测定沈萍微生物学专家讲座第37页3.温度(temperature)

生长温度三基点

温度生长速率最低最适最高沈萍微生物学专家讲座第38页影响机制：

1、影响酶活性2、影响质膜流动性3、影响物质溶解度按最适温度划分

低温菌中温菌高温菌沈萍微生物学专家讲座第39页表6-3微生物生长温度范围微生物类型生长温度(℃)最低最适最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035嗜温微生物15-2020-4545以上嗜热微生物4555-6580嗜高温微生物6580-90100以上沈萍微生物学专家讲座第40页微生物高温下能生长原因①酶蛋白及核糖体有较强抗热性，②核酸含有较高热稳定性（核酸中G+C含量高（tRNA），③细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能维持正常液晶状态。沈萍微生物学专家讲座第41页嗜冷微生物在低温下生长机理①它们体内酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活丧失②细胞膜中不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保持半流动状态，能够进行物质运输。

沈萍微生物学专家讲座第42页4.pH微生物生长pH值三基点：

pH生长速率最低最高最适pH沈萍微生物学专家讲座第43页影响机制：

◆影响膜表面电荷性质及膜通透性，进而影响对物质吸收能力。◆改变酶活、酶促反应速率及代谢路径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在pH7.6产甘油、乙醇、乙酸。◆影响培养基中营养物质离子化程度，从而影响营养物质可给性，或有毒物质毒性。沈萍微生物学专家讲座第44页微生物生长pH值范围绝大多数种类都生活在pH5.0－9.0。微生物按最适pH值分为：

嗜碱微生物：硝化细菌、、多数放线菌

耐碱微生物：许多链霉菌中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌嗜酸微生物：硫杆菌属耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌沈萍微生物学专家讲座第45页微生物生命活动对环境pH值影响分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，pH分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，pH无机盐选择性吸收：

铵盐吸收（(NH4)2SO4）pH↓硝酸盐吸收(NaNO3)，pH↑沈萍微生物学专家讲座第46页即使微生物生活环境pH值范围较宽，不过其细胞内pH值却相当稳定，普通都靠近中性。培养过程中调整pH值办法过酸时：加入碱或适量氮源，提升通气量过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量

沈萍微生物学专家讲座第47页5.氧沈萍微生物学专家讲座第48页表6-6微生物与氧关系微生物类型最适生长O2浓度(V/V)好氧等于或大于20%微好氧2-10%氧忍耐型2%以下兼性厌氧有氧或无氧专性厌氧不需要氧、有氧时死亡沈萍微生物学专家讲座第49页好氧微生物

含SOD和H2O2酶，氧气是最终电子受体，增氧培养。微好氧微生物

O2分压占2-10%，氧气是最终电子受体。沈萍微生物学专家讲座第50页耐氧微生物

有SOD缺H2O2酶，氧气无毒兼性厌氧微生物

含SOD和H2O2酶，有氧—呼吸，无氧---发酵专性厌氧微生物

缺SOD和cyt酶，氧气有毒沈萍微生物学专家讲座第51页沈萍微生物学专家讲座第52页1）固体好氧培养方法

琼脂斜面和琼脂平皿培养好氧培养方法

沈萍微生物学专家讲座第53页香菇固体栽培床沈萍微生物学专家讲座第54页沈萍微生物学专家讲座第55页2）液体好氧培养方法

恒温振荡培养箱沈萍微生物学专家讲座第56页试验室小型全自动发酵罐沈萍微生物学专家讲座第57页工业发酵车间沈萍微生物学专家讲座第58页沈萍微生物学专家讲座第59页厌氧培养方法

微生物厌氧培养箱沈萍微生物学专家讲座第60页沈萍微生物学专家讲座第61页二.微生物生长测定1.计数法2.重量法3.生理指标法直接计数间接计数膜滤计数比浊计数沈萍微生物学专家讲座第62页直接计数沈萍微生物学专家讲座第63页间接计数沈萍微生物学专家讲座第64页（三）比浊法沈萍微生物学专家讲座第65页2)薄膜过滤平皿计数法沈萍微生物学专家讲座第66页（二）微生物生物量测定方法1.湿重法

搜集微生物菌体，或将微生物培养液离心，搜集细胞沉淀物，然后称重。2.干重法

将微生物菌体或离心得到细胞沉淀物置100—105℃烘箱中干燥至水份去除，然后再称重。3.细胞成份含量法

如蛋白质、还原糖、总糖、核酸等含量测定。因为每个细胞成份含量是一定，单位体积培养液中微生物群体细胞数目越多，总细胞成份含量就越多。沈萍微生物学专家讲座第67页微生物生长测定方法比较测定细胞数目方法特点与应用总细胞数血球计数板法较快速简便，但较费时薄膜过滤染色法快速简便，适于含菌数很低空气、水等中总菌计数活细胞数平皿菌落计数法简易价廉，但花费时间较长，不能立刻知道结果薄膜过滤平皿法灵敏度高,不用于高密度培养物，不能立刻知道结果测定物质量比浊法快速简便，敏感度低，适于不发酵液或液体中快速总细胞数预计，但需事先标定细胞湿重法较为简便，但含水量不定，准确度差细胞成份含量法如测定蛋白质、核酸、还原糖含量等细胞干重法较为费时，易受颗粒杂质干扰，敏感度低沈萍微生物学专家讲座第68页思索题

最适生长温度，专性厌氧菌，兼性厌氧菌，试述温度对微生物影响试述霉菌繁殖方式图示并说明酿酒酵母生活史。沈萍微生物学专家讲座第69页第六章微生物生长

繁殖与控制

（续）沈萍微生物学专家讲座第70页本节重点1、抗代谢物；抗生素作用机制2、高温灭菌方法及要求3、高压蒸汽灭菌操作与要求沈萍微生物学专家讲座第71页几个概念消毒（Disinfection)：消毒是利用某种方法杀死或灭活物质或物体中全部病原微生物一个办法。

灭菌(Sterilization)：灭菌是指利用某种方法杀死物体中包含芽孢在内全部微生物一个办法。第五节微生物生长繁殖控制沈萍微生物学专家讲座第72页防腐(Antiseptsis)：防腐是在一些化学物质或物理因子作用下，能预防或抑制微生物生长一个办法，它能预防食物腐败或预防其它物质霉变。化疗(Chemotherapy)：化疗是指利用含有选择毒性化学物质对生物体内部被微生物感染组织进行治疗，以杀死组织内病原微生物，但对机体本身无毒害作用治疗办法。

沈萍微生物学专家讲座第73页时间细胞数对数杀菌、溶菌、制菌区分总菌数活菌数沈萍微生物学专家讲座第74页1.抗微生物剂(antimicrobialagent)

概念:分类:消毒防腐剂作用机理①使微生物蛋白质凝固变性,如酒精等.②破坏菌体酶系统,如过氧化氢等.③增加细胞膜通透性,使细胞发生破裂或溶解.如来苏儿等酚类物质.一.控制微生物化学物质沈萍微生物学专家讲座第75页抗微生物剂作用范围作用机理防腐剂：

有机汞皮肤与蛋白质巯基结合0.1-1%硝酸银眼睛发炎蛋白质沉淀碘液皮肤与酪氨酸结合，氧化剂70%乙醇皮肤脂溶剂和蛋白质变性六六粉(酚)玻璃器皿破坏细胞质膜肥皂、洗液、除臭剂阳离子化合物玻璃器皿与膜上磷酯相互作用3%过氧化氢溶液皮肤氧化剂沈萍微生物学专家讲座第76页抗微生物剂作用范围作用机理消毒剂：

HgCl2桌子、地板等与巯基结合CuSO4游泳池、供水池蛋白质沉淀碘液医用器械用具与蛋白质酪氨酸结合氯气供水池氧化剂含氯化合物奶制品与食品设备，氧化剂酚化合物表面蛋白质变性阳离子去垢剂医用仪器、食品与奶制品等设备与磷酯相互作用乙烯氧化物、甲醛温度敏感塑料制品烷化剂臭氧食用水强氧化剂沈萍微生物学专家讲座第77页2.抗代谢物

(antimetabolite)

概念－－有些化合物在结构上与生物体所必需代谢物很相同，以致于能够和特定酶结合，从而妨碍酶功效，干扰代谢正常进行，这些物质叫抗代谢物．作用机理作为基本生长因子竞争性抑制剂假冒正常代谢物反馈抑制正常代谢物调整沈萍微生物学专家讲座第78页种类：磺胺药——对氨基苯甲酸；6-巯基嘌呤——嘌呤；5-甲基色氨酸——色氨酸；异烟肼——吡哆醇。

沈萍微生物学专家讲座第79页磺胺结构H2NSO2NH2H2NCOOH对氨基苯甲酸结构沈萍微生物学专家讲座第80页沈萍微生物学专家讲座第81页3.抗生素（antibiotic）概念：-----由一些生物在其生命过程中所产生一类低分子量代谢产物或其人工衍生物，在很低浓度下就能干扰它种生物生命活动。抗菌谱－－各种抗生素有其不一样制菌范围

广谱型抗生素狭谱型抗生素进展－－从抗菌素抗生素生物药品素沈萍微生物学专家讲座第82页

抗生素作用机制：

1）抑制细胞壁合成（如：青霉素）2）破坏细胞膜功效；（如：多粘菌素）3）抑制蛋白质合成；（如：氯霉素，四环素、链霉素等）4）干扰核酸代谢；（如：利福霉素)5)影响呼吸链;

(如抗霉素）沈萍微生物学专家讲座第83页沈萍微生物学专家讲座第84页微生物抗药性（1）细胞质膜透性改变（2）药品作用靶位点改变（3）修饰药品（4）药品阻断路径变异（5）排除药品沈萍微生物学专家讲座第85页二.控制微生物物理原因1.高温灭菌原理

：

干热灭菌湿热灭菌火焰灼烧热空气常压加压巴氏消毒煮沸消毒间歇灭菌常规加压连续加压方法沈萍微生物学专家讲座第86页

高压蒸汽灭菌

操作步骤

灭菌要求0.1MPa、15磅/英寸21Kg/cm2

121℃20—30min

注意事项放