动物细胞培养基本技术与原理

动物细胞培养基本技术与原理动物细胞培养基本技术与原理第1页细胞与组织培养（体外培养）(cellandtissueculture)：

从机体中取出组织或细胞，模拟体内生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。包含三个层面：器官培养、组织培养、细胞培养分别代表细胞水平、组织水平或器官水平培养动物细胞培养基本技术与原理第2页动物细胞培养主要领域及意义动物细胞培养特征动物细胞培养生存条件主要讲3方面问题：动物细胞培养基本技术与原理第3页一、动物细胞培养主要领域及意义

单克隆抗体与当代医学动物胚胎孵育与畜牧业动物细胞培养与当代医药业动物克隆广泛应用动物细胞培养基本技术与原理第4页1.单克隆抗体技术与当代医学单克隆抗体技术步骤：*骨髓瘤细胞(myelomacell)特定抗原免疫刺激B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合

杂交瘤细胞(hybridomacell)。动物细胞培养基本技术与原理第5页杂交瘤细胞特征：*既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又含有B淋巴细胞产生特异性抗体能力。单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology)。

动物细胞培养基本技术与原理第6页单克隆抗体特征：*含有高度特异性、灵敏性与准确性应用：临床医学疾病诊疗。生产各种免疫疫苗。用于一些肿瘤治疗。用于各种基础医学研究。

动物细胞培养基本技术与原理第7页2.胚胎孵育与畜牧业农畜动物胚胎移植：利用胚胎技术大批量生产优质胚胎，从而能够降低胚胎成本，扩充移植胚起源。体外受精：加紧农畜良种化。利用体外受精技术进行核移植、性别控制和基因导入，工厂化生产遗传性状稳定、生产性能优良家畜。动物细胞培养基本技术与原理第8页类型动物细胞培养产物

人疫苗小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗原、疱疹、一些癌症动物疫苗口蹄疫、鸡瘟病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血病酶

尿激酶、细胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶激素

促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒毛膜促性腺激素、促黄体激素、促滤泡激素、生长激素免疫调整因子白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、β-细胞生长因子

3.动物细胞规模化培养与当代医药治疗性抗体抗体药品动物细胞培养基本技术与原理第9页4.动物克隆技术有益应用动物克隆技术应用前景：（1）保留优良动物品种（2）拯救濒临灭绝珍惜动物（3）利用克隆动物工厂生产蛋白质药品（4）利用克隆技术生产人体器官动物细胞培养基本技术与原理第10页动物细胞培养基本技术与原理第11页二、动物细胞特征动物细胞在活体内特征培养条件下动物细胞生长特征培养条件下动物细胞生理特征动物细胞培养基本技术与原理第12页1.动物细胞在活体内特征在活体内，动物细胞:分化动物细胞在功效上含有明确分工，并含有显著形态学特征。

如肌肉细胞为纺锤形，方便于行使收缩伸展功效；神经细胞含有很长分支，很多纤维，方便接收和传递刺激；红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动；上皮细胞因为它要覆盖于表面，经常相互挤压成不规则形状。增殖分化动物细胞培养基本技术与原理第13页活体内动物细胞按照分裂能力能够分为三大类：第一类是能保持继续分裂能力细胞，能够继续不停地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞；第二类细胞群是永久失去分裂能力细胞，如各类高度特化细胞；第三类是静止细胞群，即所谓G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细胞分裂。如人肝脏细胞等。第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。动物细胞培养基本技术与原理第14页2.培养条件下动物细胞生长特征离体培养动物细胞可分为：

贴壁依赖型(anchorage-dependent)非贴壁依赖型(anchorage-independent)兼性贴壁细胞动物细胞培养基本技术与原理第15页1）贴壁依赖型简称为贴壁细胞，包含成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形性细胞型。

成纤维细胞型

细胞形态与体内成纤维细胞形态相同，胞内呈梭形或不规则三角形，中央有园形核，胞质向外伸出2～3个长短不一样突起。细胞群常连接成网，生长时呈放射状或火焰状。除真正成纤维细胞外，心肌、平滑肌、成骨细胞培养时均属这一类型。动物细胞培养基本技术与原理第16页游走细胞型

在支持物上分散生长，不连接成片，细胞胞质常伸出伪足或突起，呈活跃游走和变形运动，速度快而方向不规则。在一定条件下，可转变为成纤维细胞型。多形性细胞型

一些组织和细胞，如神经细胞，难以确定它们稳定形态，可统归于多形细胞型。nervecell动物细胞培养基本技术与原理第17页动物细胞培养基本技术与原理第18页2）非贴壁依赖型

也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。起源于血液、淋巴组织细胞，许多肿瘤细胞等均属于这类，细胞普通呈圆形。

3）兼性贴壁细胞

动物细胞培养中，有些细胞展现双重性，既能够贴壁生长，也能够悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。

动物细胞培养基本技术与原理第19页4.培养条件下动物细胞生理特点1）动物细胞分裂周期长动物细胞分裂周期普通为12～48小时，它不但随细胞种属不一样而有差异，即使是同一个属，不一样部位细胞所需时间也不一样。另外，培养条件如温度、pH、培养基成份等，也会影响分裂周期长短。动物细胞培养基本技术与原理第20页动物细胞培养基本技术与原理第21页2）接触抑制(contactinhibition)现象除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞生长都需要在一定基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐步汇合成片即每个细胞与其周围细胞相互接触时，细胞就停顿增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。动物细胞培养基本技术与原理第22页3）有限细胞系和永久细胞系动物细胞离体培养起始物--原代培养（primaryculture）经继代培养后即成为有限细胞系(finitecellline)。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限时间内生存，普通经过30~50世代后细胞将逐步死亡。动物细胞培养基本技术与原理第23页“代”：继代次数和存活时间长短因细胞起源年纪和种族不一样而有差异。年纪越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约能够培养50代，而成年人成纤维细胞则不能继代50次，一样是成纤维细胞，取自鸡胚成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠只能培养8代。

动物细胞培养基本技术与原理第24页大多数细胞系在有限代数内以不变形式增殖，当超出有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系过分期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(invitrotransformation)。永久细胞系有以下特征：细胞形态改变，如细胞变小，黏附性降低，含有较高核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系建立是动物细胞规模化培养前体。

动物细胞培养基本技术与原理第25页4）动物细胞环境敏感性动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁保护。动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形原因都会影响动物细胞存活。动物细胞培养对营养条件要求也十分复杂。

动物细胞培养基本技术与原理第26页三、动物细胞环境要求动物细胞培养基本技术与原理第27页1.动物细胞培养环境要求1）无污染环境2）温度

昆虫细胞培养温度普通是25～28℃哺乳动物细胞培养温度普通是37℃。

总体上讲，动物细胞忍受低温能力比忍受高温能力强。如哺乳动物细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件下依然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时后，再置于适宜温度下细胞依然能够正常生长。液氮冻存。动物细胞培养基本技术与原理第28页3）pH

动物细胞培养适宜pH普通在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会造成细胞死亡。培养细胞对pH要求因培养时间长短相关，普通原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH含有较强忍耐性。

动物细胞培养基本技术与原理第29页4）气体环境及溶氧普通细胞在培养早期要求较低溶氧水平，而在对数生长久或培养后期，对溶氧水平要求增加，假如供氧不足，将造成细胞缺氧而死亡。除了氧气供给外，还应注意培养基氧气和CO2平衡。动物细胞培养基本技术与原理第30页5）渗透压动物细胞培养渗透压包含两个方面问题：培养基渗透压维持细胞体内渗透压维持

大多数动物细胞对渗透压忍耐程度较强，只要培养基渗透压改变不是很猛烈，普通对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压维持普通采取平衡盐溶液。

动物细胞培养基本技术与原理第31页四、动物细胞培养动物细胞培养基本技术与原理第32页基础概念和基础步骤:取材分离和组织消化细胞计数常见培养法细胞常规检验细胞系与克隆动物细胞大规模培养细胞冻存与复苏动物细胞培养基本技术与原理第33页一、基础概念（generalconcept）：细胞培养（cellculture）：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖过程。原代（初代）培养：指将机体取出组织或细胞进行首次培养过程。原代培养细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞。传代（继代）培养：从原代培养细胞继续转接培养，称为传代培养。传代培养细胞称为传代细胞。动物细胞培养基本技术与原理第34页二、取材、分离和组织消化(todrawthematerialsfromtissue，separation，digestion)（一）取材——获取组织标准上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其是胚胎组织）比老龄组织轻易培养、分化程度低比分化程度高轻易培养、肿瘤组织比正常组织轻易培养。取材前要对所取组织各种情况进行详细统计；所用器皿用前严格消毒灭菌，取材时严格无菌操作。动物细胞培养基本技术与原理第35页取材方法:

处死动物→取出组织块，放入小烧杯中→用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎（1mm3），用吸管吸收Hanks液冲下剪刀上碎块，补加3~5mlHanks液，用吸管轻轻吹打；→低速离心，弃去上清液，留下组织块。（也可用手术刀片将组织块切碎，优点：对细胞损伤较小，缺点是操作时间长，轻易污染）→对一些软组织碎组织块，可放入注射器玻璃管中或1mm不锈钢/尼龙网筛挤压分离。动物细胞培养基本技术与原理第36页（二）组织消化(tissuedigestion)

用生物化学方法将剪碎组织块分散成细胞团或单细胞。1、常见消化液适用范围（1）胰蛋白酶：适合用于细胞间质较少软组织，如胚 胎、羊膜、上皮、肝、肾、传代细胞等。（2）胶原酶：适合用于纤维组织、上皮组织、癌组织等。（3）其它酶：链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等，依据酶作用特点及组织成份不一样适当选取（4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。 动物细胞培养基本技术与原理第37页2、组织消化操作方法(tissuedigestionmethodofoperation)（1）胰蛋白酶消化(trypsindigestion)①将剪碎组织块放入有玻璃珠三角烧瓶中，加入30~50倍体积0.25%胰蛋白酶；②37℃水浴内消化30~60min，每5~10min摇动一次。依据效果可中间更换消化液。（静止10min，吸去2/3上清液，补加新鲜胰蛋白酶）③Hanks液漂洗两次，每次2~3min；④800r/min离心5min，弃上清液，加入营养液。如有大块，可用纱网过滤。如消化传代细胞，可与EDTA混用。动物细胞培养基本技术与原理第38页（2）胶原酶消化(collagenaseenzymaticdigestion)①培养瓶中放入1~5mm3大小碎组织块，加5mlu/ml胶原酶溶液，使终浓度为200u/ml，pH6.5；②36.5℃水浴24~48h，视情况可适当延长，无需摇动。期间可更换酶液一次；③见组织块已变软，分散于瓶底时，轻微震荡使散成细胞团或单细胞。小心倒出培养液，瓶底可能附着一些巨噬细胞，借此可将其分开（单独培养或弃之不用）；④800r/min离心5min，弃上清液，重悬于BSS液中，再重复离心一次；⑤加入培养液制成细胞悬液，用于接种。动物细胞培养基本技术与原理第39页三、细胞计数(cellcounting) ——计数悬浮液中细胞形态及浓度，以判断消化或稀释程度（亦用于培养液中细胞浓度检验）①染色：在洁净离心管中加入9滴细胞悬液，再加入1滴0.4%台盼蓝，混匀，静置2~3min；②充池：在计数板盖片边缘加入1~2滴染色细胞悬液，使之完全充满计数板与盖玻片间空间（无气泡或溢出）动物细胞培养基本技术与原理第40页动物细胞培养基本技术与原理第41页③计数：在显微镜下统计计数板四角四个大方格中活细胞（不染色细胞）总数。一团细胞按一个细胞计数。压线细胞，数上不数下，数左不数右。④计算：

细胞悬液浓度（细胞个数/ml）=（4大格细胞总数/4）×104×稀释倍数注意：如细胞团数超出10%，说明消化不充分。细胞接种浓度：3~10×105/ml动物细胞培养基本技术与原理第42页四、常见培养法(generalcultivation)（一）组织块培养法(tissuepiececultivation)

将组织块剪切成小块，直接放入培养瓶中，贴附一段时间后，细胞从组织块长出，最终形成单层细胞。动物细胞培养基本技术与原理第43页1、悬滴培养法(dropculture)——最简单、最原始培养法悬滴培养法缺点：细胞生长空间狭小气体不足，不能连续长时间生长培养基易液化，需要常更新培养基凹玻片折光，不便于观察。动物细胞培养基本技术与原理第44页2、旋转管培养法(rotatetubeculture)①组织块或细胞可交替地接触营养液和空气，利于细胞生长；②培养管迟缓转动，使整个管内壁全部长满细胞，提升了细胞产量，适于较大量组织培养和各种长久传代细胞培养。缺点：不易在显微镜下观察。3、灌注小室培养法(dabblebooth

cultivation)为大规模培养系统提供了参考原理。动物细胞培养基本技术与原理第45页4、卡氏瓶培养法卡氏瓶(carlsberg'sflask)（以下列图）：①将组织块剪碎，BSS漂洗。②转移到另一只培养皿，在解剖显微镜下去掉不需要组织如脂肪、坏死组织等。将组织块切成1mm3小块。③用预先润湿滴管转移到消毒离心管，静置使组织小块下沉，吸去上清。以新鲜BSS漂洗。重复2~3次。动物细胞培养基本技术与原理第46页④转移到培养瓶（每个25ml培养瓶可放置20~30块组织小块），吸去液体。加入1ml生长培养液，轻斜摆动培养皿，使组织小块均匀分布。盖好瓶盖，36.5℃培养18~24h。⑤待组织块粘附瓶壁后3~5天，加入5ml培养液；然后每七天更新培养液一次。培养3~5周，细胞不停增加，肉眼或低倍镜下观察可见围绕组织周围生长如同日晕，称“生长晕”。⑥取出中央组织块，用预先湿润滴管移到另一新培养瓶。重复④~⑥操作。⑦在原生长晕培养瓶内换入新鲜培养液。待生长晕细胞扩展至约50%培养瓶底表面时，进行细胞培养。动物细胞培养基本技术与原理第47页（二）单层细胞培养法(monolayermethod)

组织块经胰酶消化分散成较小细胞团或单个细胞，在合成培养液中附在瓶壁上长成单层，即形成所谓单层细胞培养。

1、原代培养(primaryculture)（初代培养）动物细胞培养基本技术与原理第48页动物细胞培养基本技术与原理第49页2、传代培养(serialsubcultivation):传代理想时期：对数生长久，细胞80~90%或刚才全部汇合。方法：①消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶与EDTA混合液，盖满瓶底，作用2~5min；②检验：如细胞间隙变大，细胞质回缩，则终止消化。③终止消化：吸出消化液；加入Hanks液，轻轻转动，洗去残留消化液。如单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。③细胞计数：用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落，制成悬液，计数并统计其浓度；④重新稀释接种培养。动物细胞培养基本技术与原理第50页依据细胞特点，掌握细胞消化时间和选择消化方法。动物细胞培养基本技术与原理第51页（三）组织块单层细胞培养法(tissuemonolayermethod)

把组织剪成更小小块（0.5~1mm3），因为其体积很小，无需任何粘着剂即能直接附于瓶壁上。细胞自组织块边缘向外长出，最终连接成片，形成单层细胞。优点：简化了原代单层细胞培养过程。是当前各培养室常见原代培养法。动物细胞培养基本技术与原理第52页方法：①取一定量组织置于小烧杯中，先用BSS漂洗2~3次去掉血污，然后重复剪成0.5~1mm3小块。②加入1~2ml培养液，用吸管轻轻吹打，使组织块悬浮。③移入培养瓶，并在瓶壁上吹匀。翻转，使有组织块瓶壁朝上，加入培养液，塞紧瓶口，置37℃温箱培养1~2h；待组织牢靠贴于瓶壁，再轻轻翻转，使培养液浸泡组织小块，静止培养。为促进细胞贴壁，也可先在瓶内壁涂一层血清。动物细胞培养基本技术与原理第53页动物细胞培养基本技术与原理第54页（四）悬浮细胞培养法(suspendedcellculture)

利用旋转、振摇或搅拌方法不让细胞贴壁，使其在培养液中呈悬浮状态生长。适用细胞：淋巴细胞、肿瘤细胞、传代细胞系培养基：合成培养基＋5~10%血清＋0.1%甲基纤维素培养细胞密度：5~7×105cell/ml.特点：细胞增殖快，产量高，培养过程简单，是动物细胞大规模培养理想模式。动物细胞培养基本技术与原理第55页（五）微载体培养法(microcarrierculture)载体：DEAE-交联葡聚糖微粒、DEAE-纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、无机玻璃基质微载体等微载体培养系统培养细胞步骤：1、选择适当微载体类型——取得最大量细胞，以微载体能全部悬浮在培养液内为最好2、浸泡水化及消毒 用无Ca2+、Mg2+离子磷酸缓冲液浸泡3h以上3、接种（依据细胞类型决定接种浓度）4、培养观察与细胞计数5、消化6、分离细胞或传代培养动物细胞培养基本技术与原理第56页（六）多孔载体培养(porositycarrierculture)优点：增加细胞固定化稳定性，比表面积大，确保细胞充分生长空间，细胞生长在载体内部，免受机械损伤。多孔载体被证实是用于大规模高密度细胞培养优异细胞生长支持物，含有逐步取代传统实心微载体趋势。（七）中空纤维细胞培养法(hollowfibercellculture)

模拟细胞在体内生长三维状态，利用人工“毛细血管”——中空纤维来供给细胞生长营养等条件细胞向三维空间生长繁殖，形成类似组织多层细胞群体，细胞密度可达109个/ml。适合用于细胞代谢产物和分泌物生产。动物细胞培养基本技术与原理第57页五、细胞系与克隆株（celllineandclone）1、细胞系建立

原代培养培养物中所含细胞类型多而复杂，培养早期，生长细胞类型各种多样随培养时间延长：一些细胞退化、死亡；另一些细胞适应环境而生长繁殖培养物逐步变均匀。传代培养意义：不但在于维持细胞不停地生长，而且使培养物逐步演变为含有增殖能力、特征专一、类型均匀培养细胞，即细胞系。细胞系：*指从原代培养物经传代培养后得来一群特征专一、类型均匀细胞，能够长久连续传代。动物细胞培养基本技术与原理第58页（1）限定细胞系（有限细胞系） 寿命有限，普通为20~80代（2）连续培养细胞系（无限细胞系） 细胞发生转化，可连续培养和生长，寿命变为“无限”2、克隆株（细胞株） 分离单一细胞并使其繁殖形成细胞群称为细胞株。单个细胞生活能力很弱，必须采取特殊培养办法适应和同化过程：在细胞接种到新培养液早期，细胞既从培养液中摄取营养，也要向培养液排出一定物质，其结果使得培养液更易被吸收和利用。

动物细胞培养基本技术与原理第59页适应培养液

制备：选择生长状态良好对数生长久细胞，无死细胞和碎片，所用细胞种类应与要克隆细胞相同。吸出培养液，用G6滤器过滤贮于冰箱中备用。 制备适应性培养基时注意：选取成份齐全合成培养基，可不加抗生素。动物细胞培养基本技术与原理第60页细胞株制备方法（3种）：（1）集落形成份离法平皿中接种稀释细胞细胞贴壁繁殖成许多小群选择一个最好细胞群做标识机械法刮除全部其它细胞群培养保留下来细胞群.动物细胞培养基本技术与原理第61页克隆成功关键：①接种细胞数量要适当、细胞要分散得好。太多则使细胞操作不便，以每个平皿50~100个细胞为宜。②选择细胞克隆时，应逐日观察，能证实被选留细胞群确系来自于单个细胞。刮除和洗涤一定要彻底。动物细胞培养基本技术与原理第62页（2）琼脂分离法（agarSeparation）琼脂培养基制备：

选择质量好琼脂，用三蒸水配成3%溶液，分装，灭菌。培养方法：向琼脂平皿中接种稀释细胞悬液（适应培养基），培养后，标记出保留细胞，在显微镜下切下保留细胞处琼脂小块，在BSS中轻轻漂洗后，用适应培养基继续培养。动物细胞培养基本技术与原理第63页（3）多孔塑料板分离法（foamedplasticsSeparation） 将1ml含有7~8个细胞悬液接种到多孔无毒塑料板中，每一块板上有数十个圆形小穴。选择仅有单个细胞小孔观察，待单细胞繁殖成克隆充满小孔后，用胰酶消化分离细胞，转移至培养瓶中继续培养。动物细胞培养基本技术与原理第64页六、细胞常规检验（corpuscularroutineexamination）检验内容：细胞生长状态、培养液pH、污染、细胞活力。1、细胞生长 潜伏期：不一样组织和细胞潜伏期不一样。 胚胎组织——次日可见生长，1周内即连接成片。 老年组织、癌组织——潜伏期长。⑴游离期 细胞呈悬浮状态。细胞质回缩，胞体呈圆形。⑵吸附期：与细胞种类、培养环境相关。大多数在24h内贴壁。细胞机能状态不良或濒死细胞不贴壁培养基偏酸或偏碱、污染、胶基有毒、培养瓶洗刷不洁等均不利于细胞贴壁。支持物表面带正电荷利于贴壁。动物细胞培养基本技术与原理第65页⑶繁殖期（idiophase）细胞由圆形变成延展细胞，进而过渡成极性细胞；继之出现细胞分裂，细胞数目不停增多；同时有一定移动现象。⑷退化期（catagen）

细胞长满瓶壁后，如不及时做再培养，因为营养物消耗和代谢物积累，细胞变得粗糙（轮廓分明、胞内颗粒状物堆积），严重时甚至从瓶壁脱落。动物细胞培养基本技术与原理第66页2、细胞形态（cellularshape）生长良好细胞：倒置显微镜下观察透明度大，轮廓不清。机能不良细胞：轮廓鲜明，胞质中常出现空泡、脂滴和其它颗粒状物；细胞形态不规则，失去原有特点；细胞间隙加大。3、培养液pH正常情况下，培养液呈桃红色。随细胞生长时间延长，CO2积累增多，超出缓冲范围后酸化变黄，须及时更换。动物细胞培养基本技术与原理第67页4、微生物污染(microbialcontamination)常见起源：培养液、培养塞、血清、操作时空气污染。常见病菌：霉菌、细菌、支原体。⑴霉菌：培养基中出现对应菌落。⑵细菌：培养液混浊，镜下可见大量细菌；如怀疑污染而培养液无显著改变时，可将培养物进行细菌培养以验证。⑶支原体污染：经常发生而难以发觉。污染后细胞仍能生存，甚至无显著改变；有时可发生不一样程度病理改变。预防方法：严格恪守无菌操作。并针对不一样污染采取对应办法。动物细胞培养基本技术与原理第68页5、细胞活性(cytoactive)原理：细胞对色素吸附性方法：常见是染色排除法，即死细胞着