药品的无菌检查技术

教学目标1、学会直接接种法无菌检验操作。2、知道无菌检验供试品溶液制备。3、熟知无菌检验结果判断。4、学习薄膜无菌检验法使用。5、掌握影响无菌检验原因和处理方法。教学重点：直接接种法无菌检验操作。教学难点：薄膜无菌检验法使用。

药品的无菌检查技术第1页第五节

直接接种检验技术

药品无菌检验法详细操作方法可分为直接接种法和薄膜过滤法。《中国药典》（年版）指出：如供试品性状允许，应优先采取薄膜过滤法。进行供试品无菌检验时，所采取检验方法和检验条件应与验证方法相同。直接接种法即每支（或瓶）供试品按要求量分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基容器中，除另有要求外，每个容器中培养基用量应符合接种供试品体积不得大于培养基体积10％，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基用量和高度同方法验证；每种培养基接种管数同供试品检验数量。药品的无菌检查技术第2页

因为直接接种法含有操作简便等优点，尤其适宜无抑菌和防腐作用药品无菌检验。据统计，《中国药典》（年版(二部)共有57种单列品种（占39.3％）采取该法要求。操作时，用适当消毒液对供试品容器表面或外包装采取浸没或擦试方法彻底消毒。假如容器内有一定真空度，可用适宜无菌器材（如带有除菌过滤器针头），向供试品容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。不论使用何种检验法，其检验操作过程均包含供试品处理及接种与培养及观察两大步骤。药品的无菌检查技术第3页

除另有要求外，供试品处理按照样品不一样用以下方法处理与接种。1．混悬液等非澄清水溶液供试品

该类供试品操作最简单，取要求量供试品直接无菌操作接种至各管培养基中。2．固体制剂供试品

取要求量供试试品，无菌操作直接接种至各管培养基中；或供试品中加入适宜溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取要求量无菌操作接种至各管培养基中。3．β-内酰胺类或磺胺类供试品

取要求量供试品，混合，加入适量无菌β-内酰胺酶溶液或对氨基苯甲酸溶液使中和，接种至各管培养基中，或直接接入含β-内酰胺酶或对氨基苯甲酸各管培养基中。4．非水溶性供试品

取要求量供试品，混合，加入适量聚山梨酯80或其它适宜乳化剂及稀释剂使其乳化，接种至各管培养基中。或直接接种至含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂各管培养基中。

一、供试品处理及接种药品的无菌检查技术第4页5．敷料供试品

取要求数量，每个包装以无菌操作拆开，于不一样部位剪取约100mg或１cm×3cm供试品；接种于各管足以浸没供试品适量培养基中。6．肠线、缝合线等供试品肠线、缝合线及其它一次性医用材料按要求量取最小包装，无菌拆开包装，接种于各管足以浸没供试品适量培养基中。7．灭菌医用器具供试品

取要求量，必要时应将其拆散或切成小碎块，接种于各管足以侵没供试品适量培养基中。8．放射性药品

取供试品1瓶（支），接种于装量为7．5ml硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中。每管接种量为0．2ml。药品的无菌检查技术第5页接种阴性对照与此同时另取1支硫乙醇酸盐培养基管，加入上述同一容器内供试品稀释液或0.9％灭菌氯化钠溶液1ml，作阴性对照。（作阴性对照目标是说明未接检品前培养基和供试品稀释液及无菌检验操作都是无菌生长，而供试品阳性检出菌确是来自检品。）[如供试品液未经验证试验，可同时进行，方法见第五节直接接种法验证试验]。药品的无菌检查技术第6页接种阳性对照依据GMP和《中国药典》要求，接种阳性对照应在阳性对照室中进行，以防交叉污染。接种时应按验证试验结果选择阳性对照菌。方法是：在对应培养基中接入小于100个cfu阳性对照菌（菌液制备和同培养基灵敏度检验菌液制备相同）。供试品用量同供试品无菌检验每份培养基接种样品量（见表6－2、表6－3）相同。阳性对照管培养48~72h应生长良好。药品的无菌检查技术第7页二、培养及观察培养基按要求温度培养14d逐日观察并统计浑浊新鲜培养基或划线斜面培养基培养液涂片，染色，镜检判断是否有菌药品的无菌检查技术第8页三、结果判断供试品符合要求培养基管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长供试品不符合要求培养基管中任何1管显浑浊并确证有菌生长除非能充分证实生长微生物非供试品所含。当满足以下最少一个条件时，判试验结果无效：⑴

对无菌检验试验相关设施微生物监控数据表明其不符合要求。⑵

对无菌试验过程回顾，揭示了本操作程序是错误。⑶

阴性对照管有菌生长。⑷

供试品管中生长微生物经判定后，确证微生物生长是因无菌试验中所使用物品和（或）无菌操作技术不妥引发。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合要求；若有菌生长，判供试品不符合要求。药品的无菌检查技术第9页直接接种法图示无抗菌作用供试品抽样接种于培养基硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基管

培养药品的无菌检查技术第10页天天观察观察14天汇报澄清无混浊合格混浊（疑似情况）镜检重新培养确证无菌有菌不合格培养基药品的无菌检查技术第11页直接接种法教学片药品的无菌检查技术第12页第六节

薄膜过滤法检验技术

该法是各国药典和《中国药典》要求第二种无菌检验方法，适合用于任何类型药品无菌检验。含有适用性广，准确性强特点。《中国药典》（年版）要求：如供试品性状允许，应优先采取薄膜过滤法。据统计，《中国药典》（年版二部）共有88种单列要求品种（占60.7％）要求采取该法。薄膜过滤法可采取封闭式薄膜过滤器（图6－2）或普通薄膜过滤器（图6－3），但应优先选取封闭式薄膜过滤器。

药品的无菌检查技术第13页待过滤液体滤膜接负压吸引抽滤机图6-4：HTY微孔滤膜孔径测定仪

图：滤膜阻挡细菌

药品的无菌检查技术第14页

普通新购得一批滤膜，因各厂家生产相同规格滤膜其质量不尽一致，应对滤膜任选以下三种方法中一个进行孔径大小测试，符合要求滤膜才能用于无菌检验。（一）

气泡法

其原理是测滤膜孔径大小，可用气泡压力方法（图6-4）测定。先将滤膜浸入水中，使完全湿润，然后用镊子夹住一片滤膜放于气泡点测定装置上(硬聚氯乙烯气泡点测定装置，上海化工厂生产DY＝25)或滤膜孔径测定仪上，膜上放一块与滤膜大小相同尼龙筛网，再加上多孔板，将螺旋固定圈旋紧，在多孔板上加3～5mm深水(注意排除气泡)关闭放气阀，开启空压机或氮气阀，使压力缓缓上升，注意观查水面上产生第一个气泡时，统计压力表压力，气泡点压力不应小于0.2MPa(2.2kg/cm2)。药品的无菌检查技术第15页（二）水流量法

其原理是在一定压力下，定量水在单位时间内经过滤膜流量与孔径及孔隙率相关。将滤膜装于除菌滤器上，开动真空泵，压力在93KPa(700mmHg)下，抽滤已滤清水约500ml，计算出每1mim滤速。《中国药典》对滤膜滤速未明确要求，而SP(ⅩⅩⅢ)要求在93KPa(700mmHg)压力下，滤膜直径47mm；流速55～75mm/min。此法操作简单，但误差大。药品的无菌检查技术第16页（三）

细菌过滤法其原理是利用细菌细胞大小稳定特征，可将标准菌株制备菌液，用待测滤膜过滤，其滤液经培养无菌生长，则该滤膜孔径符合要求。惯用细菌为粘质沙雷菌(CMCC(B)41002)，将该菌斜面培养物，接种于营养肉汤培养基中，30～35Ｃ培养18～20h，用0.9％氯化钠溶液稀释至10-3(约相当于7x105cfu/ml)取此菌液1ml加至50ml0.9％氯化钠溶液中，按薄膜过滤法过滤，取该滤液5ml接种于营养肉汤培养基40ml中，30～35℃培养24h，应无菌生长，而将滤膜加至营养肉汤培养基管中应有菌生长，证实该滤膜滤效合格。药品的无菌检查技术第17页三、薄膜过滤法检验操作应依据不一样供试品而用不一样样品处理法来进行。应优先选取封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径小于0.45μm，直径为47mm。依据供试品及其溶剂特征选择滤膜材质。滤器及滤膜使用前应采取适宜方法灭菌。使用时，应确保滤膜在过滤前后完整性。水溶性供试液过滤前先将少许冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，且总过滤量不宜太大，以防止滤膜上微生物受损伤。下面就不一样供试品处理操作介绍以下：药品的无菌检查技术第18页1．水溶液供试品取要求量，直接过滤，或混合至含适量稀释液无菌容器内，混匀，马上过滤。如供试品含有抑菌作用或含防腐剂，须用适量冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次。冲洗后，如用封闭式过滤器，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入对应滤筒内。假如仅用薄膜过滤器，则无菌操作取出滤膜，将其剪成3等份；分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基容器中，其中1份接种阳性对照值做阳性对照用。药品的无菌检查技术第19页2．可溶于水固体制剂供试品

取要求量，加适宜溶剂溶解或按标签说明复溶，然后照水溶液供试品项下方法操作。3．β-内酰胺类供试品取要求量，按水溶液或固体制剂供试品处理方法处理，马上过滤，用适宜冲洗液冲洗滤膜。再用含适量β-内酰胺酶冲洗液去除残留在滤筒、滤膜上抗生素后接种培养基，必要时培养基中可加入少许β-内酰胺酶；或将滤膜直接接入含适量β-内酰胺酶培养基中。接种培养基方法照水溶液供试品项下方法操作。药品的无菌检查技术第20页4．非水溶性制剂供试品取要求量，直接过滤；或混合溶于含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂稀释液中，充分混合，过滤。用含0．1%～1%聚山梨酯80冲洗液冲洗滤膜最少三次。滤膜于含或不含聚山梨酯80培养基中培养。培养基接种照水溶液供试品项下方法操作。5．可溶于十四烷酸异丙酯膏剂和粘性油剂供试品取要求量，混合至适量无菌十四烷酸异丙酯（无菌十四烷酸异丙酯制备：采取薄膜过滤法过滤除菌。选取孔径为0.22μm脂溶性滤膜，并经140℃干热灭菌2h）中，猛烈振摇，使供试品充分溶解，假如需要可适当加热，但温度不得超出44℃），趁热快速过滤。若无法过滤，应加入不少于100ml稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及培养基接种照非水溶液供试品项下方法操作。药品的无菌检查技术第21页6．无菌气（喷）雾剂供试品取要求量，将各容器置冰室冷冻约1h。以无菌操作快速在溶器上端钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，然后照水溶性制剂或非水溶性制剂项下方法操作。

7．装有药品注射器供试品取要求量，装上无菌针头（非包装中所配带），若需要可吸入稀释液或标签所表示溶剂溶解，然后照水溶性制剂或非水溶性供试品项下方法操作。同时应采取直接接种法进行包装中所配带无菌针头无菌检验。药品的无菌检查技术第22页8．含有导管医疗器具（输血、输液袋等）供试品取要求量，每个最小包状用50~100ml冲洗液分别冲洗内壁，搜集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液供试品项下方法操作。同时应采取直接接种法进行包装中所配带针头无菌检验。四、培养及观察同直接接种检验法。五、结果判断同直接接种检验法。药品的无菌检查技术第23页开

放

式

薄

膜

过

滤

法

操

作将药品加入无菌稀释剂溶液中无菌稀释剂溶剂分3次洗涤滤膜取下滤膜药品的无菌检查技术第24页除去掉上层滤纸将滤膜分成3份加硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基管按要求温度和时间进行培养药品的无菌检查技术第25页薄膜过滤法检验

教学片药品的无菌检查技术第26页第七节

无菌检验各种中和(灭活)剂作用机理一、硫乙醇酸盐、半胱氨酸、巯基化合物作用机理这类化合物因含有SH基，能够和重金属结合,因而能解除或阻止含汞、含砷盐等重金属化合物对细菌毒害或抑制作用。另外硫乙醇酸盐可维持培养基中氧化还原电位，尤其是保持培养基下层厌氧条件，有利于厌氧菌生长。而半胱氨酸可作为细菌长所需氮