基因诊疗医学知识专家讲座

第十四章基因诊疗第一节概述一、

什么是基因诊疗所谓基因诊疗，就是在基因水平上对疾病或人体状态进行诊疗，它包含产前诊疗，是一个新临床诊疗方法。是以DNA和RNA为诊疗材料，利用分子生物学技术，经过检验基因结构或表型来诊疗疾病方法和过程；其临床意义在于能检测DNA或RNA结构变动是否，量多少及表示情况等，以确定被检验者是否存在基因水平异常改变，以此作为疾病确诊或进行基因治疗依据。基因诊疗医学知识专家讲座第1页二、基因诊疗概念界定以下6个方面内容：

（一）诊疗水平基因水平（二）诊疗技术从方法学来说，没有特殊基因诊疗方法，就是分子生物学技术在临床上应用。

（三）诊疗材料DNA和RNA。（四）诊疗内容1、对于内源性基因来说：基因结构和表示是否异常。2、对于外源性基因来说：入侵基因种类，是病毒核酸、细菌质粒还是寄生虫DNA.

（五）诊疗路径

1、直接检验基因结构是否存在：DNA点突变、缺失插入、基因重排、染色体畸变、mRNA剪接缺失错位或结构改变等。

2、检验基因转录产物mRNA：1）已经转录还是没有转录？2）应该转录还是不应该转录？3）

转录正常、过量还是过少？3、检验基因表型：正常还是异常，进行分析研究。

（六）诊疗目标1、

确诊对应疾病或得出对应结论。2、

是防治疾病或基因治疗依据。基因诊疗医学知识专家讲座第2页三、基因诊疗思绪（一）基因是随便能诊疗吗？总不能乱诊疗吧？（二）基因诊疗和传统疾病诊疗方法有什么区分和联络？（三）基因诊疗理论基础和技术能不能诊疗诊疗学基础怎样诊疗？为此，作下述讨论。希望对大家有所帮助。基因诊疗医学知识专家讲座第3页四、基因诊疗方法和传统疾病诊疗方法

表1表型诊疗（传统方法）基因诊疗（一）诊疗依据疾病表型改变基因结构异常和表示异常（二）分类临床诊疗（病因、病解、病生）DNA诊疗血清学诊疗RNA诊疗生化学诊疗（三）特异性表型改变在很多情况下是非特以探测基因为目标，只要异性，往往难以明确诊疗，有特异性探针，利用分子延误病情如FOU?杂交原理即可诊疗，含有很高特异性。

（四）敏感性探针可用“放标”或“非放诊疗灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可。

（五）早期诊疗因为表型改变往往出现较晚，在表型改变之前，基因难以早期诊疗结构或表示已发生改变，故往往能够早期诊疗。

基因诊疗医学知识专家讲座第4页（六）基因诊疗范围广因为：①探针可为任何起源和种类，序列可为已知或未知，目标可为特定基因或特定基因组合，外源性或内源性基因，所以适应性强，诊疗范围广。②被检验基因是否处于活化状态并不主要，故可对分化阶段表示特异性基因及其异常进行检测和诊疗，这对肿瘤（如CML）疗效及预后尤为主要。③在感染性疾病诊疗，能检验正在生长或潜伏病原体，能明确既往感染或现行感染，对不易诊疗（如产毒性E.coli）和不能安全培养（如立克次体）进行基因诊疗，扩大了试验室诊疗范围。基因诊疗医学知识专家讲座第5页（七）二者关系1.基因诊疗必须建立在临床普通检验基础上，它必须是临床检验第二步或第三步伎俩。（不是随便诊疗）2.基因诊疗是分子生物学和医学遗传学发展到今天人们一个构想，现在逐步走向临床，变成现实。3.尽管试验研究和临床应用技术原理相同，但诊疗对象是人时候应该慎重！（不能乱诊疗）4.同临床诊疗一样，忌不独立思索，人云亦云（举例）。基因诊疗医学知识专家讲座第6页

细胞膜

细胞核DNAmRNA转录翻译（protein）临床表现基因诊疗生化诊疗血清学诊疗临床诊疗图一基因诊疗与表型诊疗基因诊疗医学知识专家讲座第7页（五）基因诊疗与诊疗学（一）诊疗是用医学科学方法对疾病表现所作出辩证逻辑结论。诊疗目标：为了防御疾病和进健康。（二）诊疗学是叙述诊疗疾病基本标准和方法一门课程。其基本标准就是研究症状体征发生基本规律和机理以及建立诊疗思维程序。基本诊疗方法包含：问询病史、体检、试验室检验、以及其它检验如：心电图、超声检验、内窥镜、CT、核磁共振等等。（三）基因诊疗是诊疗学续写，是诊疗学新篇章，从这个意义上来说：基因诊疗遵照诊疗学基本标准；基因诊疗基础是医学基础，专业基础是医学分子生物学和医学遗传学，不一样是我们在基因水平上，学习和研究：基因解剖（结构）、基因生理（转录翻译等）、基因病解（结构异常），基因病生（表示异常），然后主要应用分子生物学技术伎俩进行基因诊疗。基因诊疗医学知识专家讲座第8页（六）基因诊疗思维程序：第一套：逆向遗传学（reversegenetics）思维程序1.

提取人类基因组（总）DNA；2.建立DNA文库（DNABANK）；3.克隆任一DNA片段作为探针。4.确立该探针在基因组中位置；这种探针在基因组中位置一旦被确定下来，就能够成为遗传标识（geneticmarker）.5.大量应用这类新遗传标识(用染色体步移法或染色体跳跃法)建立各条染色体连锁基因图谱，最终建立整个人类基因图谱。6.筛选遗传病病人或疑有与基因相关疾病病人；7.克隆病变基因8.比较正常基因和异常基因差异推测正常异常基因产物（蛋白质）在细胞中定位以及生理病理效应。基因诊疗医学知识专家讲座第9页第二套拿来主义1.您诊疗/研究疾病是否：与/有/知道1）基因相关；2）该基因正常/异常序列；3）该基因结构/表示异常类型；4）特异性探针/PCR引物；5）转录物；6）表示产物/表示产物功效/表示产物功效测定方法。2.

据1设计基因诊疗方案。基因诊疗医学知识专家讲座第10页第二节基因诊疗分子生物学基础一、基因诊疗理论（一）生物大分子结构和功效（二）基因组结构和功效（三）遗传信息复制和表示（四）基因表示调控（五）细胞通讯与细胞信号转导分子机制（六）癌基与抑癌基因（七）基因与疾病基因诊疗医学知识专家讲座第11页二、基因诊疗技术

（一）核酸分子杂交，在这些方法中，1.Southern印迹法是最经典基因分析方法，不但能检出特异DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因酶切图谱分析、基因突变分析等。2.Northern印迹法可用于组织细胞中总RNA或mRNA定性和定量分析。3.斑点杂交

可用基因组中特定基因及其表示定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能判定所测基因分子量，特异性不高，有一定百分比假阳性。4.原位杂交

可查明染色体中特定基因位置，用于染色体疾病诊疗；原为杂交结果是显示相关核酸序列空间位置情况，所以可检出含核酸序列详细细胞，细胞详细定位，数目和类型，可检出基因和基因产物亚细胞定位。基因诊疗医学知识专家讲座第12页(二）聚合酶链式反应（PCR）PCR技术在基因诊疗中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析，单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析，DNA序列测定等联合应用。（三）单链构象多态性

单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,sscp）检测是一个基于单链DNA构象差异来检测点突变方法，常与PCR联合应用，称为PCR—SSCP技术。基因诊疗医学知识专家讲座第13页（四）限制酶酶谱分析基因突变可能造成基因上某一限制酶位点丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，经过比较二者酶切片段长度、数量上差异就可判断待测DNA突变情况。（五）DNA序列测定DNA序列测定是进行基因突变检测最直接、最准确方法，能够确定突变部位突变性质。（六）DNA芯片技术应用DNA芯片，能够检测基因结构及其突变多态性，对基因表示情况进行分析。基因诊疗医学知识专家讲座第14页三、基因诊疗内容

（一）基因结构异常（基因突变检测）１、点突变1）已知点突变2）未知突变2、少数核首酸缺失或插入3、大片段丢失或插入4、基因重排（染色体易位）5、基因扩增（二）基因表示异常（基因转录物探测）1、mRNA相对定量2、mRNA绝对定量3、mRNA长度分析（三）连锁分析（了解内容）1、限制性片段长度2、性家系连锁分析3、连锁不平衡（四）病原体诊疗入侵基因种类基因诊疗医学知识专家讲座第15页四、基因诊疗路径（一）内源性基因诊疗路径主要有3种：即：基因突变检测mRNA探测连锁分析采取哪一条路径主要取决于：对致病基因及其分子病理学了解程度；致病基因本身突变类型复杂性。基因诊疗医学知识专家讲座第16页（二）外源基因入侵病原体诊疗1.入侵基因组DNA含有特异DNA序列，以区分于别种生物体DNA序列。2.能把这种特异DNA序列制成含有特定信号探针。五、基因诊疗基本方法（一）点突变

1、已知点突变PCR/ASO探针斑点（或缺缝）杂交法（1）据突变（位点序列：）a.设计一对引物，b.合成一对寡核苷酸探针（正常/突变序列杂合子）（2）提取患者基因组（总）DNA→PCR扩增（突变序列）DNA片段→（与ASO）斑点（或狭缝）杂交洗脱条件：完全配对（牢）不洗脱；不完全配对（不牢）易洗脱。基因诊疗医学知识专家讲座第17页（3）结果分析：①与正常探针杂交，而不和突变探针杂交表示受检者不存在这种基因；②只与突变探针杂交，说明突变基因是纯合子；③与正常/突变，探针都可杂交，说明突变基因是杂合子；④与正常/突变探针都不杂交说明不是已发觉突变。2、未知点突度SSCP—PAGE法、测序法

提取DNA→DNA变性→SSCP—PAGE→测序确证（二）少数较苷酸缺失或插入诊疗方法能够用（一）方法基因诊疗医学知识专家讲座第18页

（五）基因扩增限制酶酶切待测基因DNA或CDNA片段作为探针（位置改变）法光密度扫描（定量）。基因扩增→拷贝数增加（分子量）→电泳行为改变→杂交条带位置改变→与标准/正常对照定性/量扫描。（四）基因重排（染色体易位）屡次/重PCR电泳分析、其前提是已知重排基因和重排位点序列。（三）大片段丢失屡次多重失PCR电泳分析设计引物使取得产物序列长短不一样，有固定大小，据不一样长短序列存在是否，检测是否有一些基因片段缺失与突变（注意正常对照）。5′3′引物1引物3致病基因引物4引物25′3′引物1引物3基因诊疗医学知识专家讲座第19页（六）多态性分析

1、RFLP（１）基本方法：①PCR产物酶切产物电泳分析。②基因连锁分析（PCR/RFLP连锁分析法）。人群个体核苷酸序列差异性、称为DNA多态性。由此影响限制酶切部位点而致RFLP（限制性片段长度多态性）。RFLP按照孟德尔方式遗传。故：①可检测人群中个体间存在RFLP（限制酶酶谱分析）②遗传病基因诊疗（连锁分析）。假如一特定家庭（系）中，某一致病基因与特异性多态性片段紧密连锁（连锁—是指同一条染色体上相邻近基因一起被被遗传），就能够用这种多态性片段作为“遗传标志”，来判断家庭组员或胎儿基因组中是否携带有致病基因。对于某一限制酶来说：酶切位点在人群中存在共性（可能一样对核酶谱来说存在多态性（不一样）。（２）DNA多态性位点普遍存在整个人类基因组，预计每100个核苷酸便有一个发生突变，出现多态性。假如建立起一套以20CM间隔平均分布于整个基因RFLP位点，选取适当探针，理论上能够对全部遗传病进行基因诊疗。基因诊疗医学知识专家讲座第20页（3）关于基因连锁分析①多数遗传病诊疗路径，因为：经基因突变检测路径，适用病种有限，原因是：a、致病基因可在任何位点上产生突变，致使同一疾病有不一样突变类型。b、不少致病基因仅仅知道在哪一号染色体位置，还未克隆出来，对其结构和分子机制毫无能知。c、有致病基因还未确定。

②基因连锁分析必须具备先决条件：a、家系中关键组员（父母）为RFLP杂合子，才能区分两条同源染色体。连锁遗传病只要母亲为某一RFLP杂合子即可。b、子代存在患病纯合子，这么才能确定致病基因与哪条染色体RFLP共同遗传。c、任何一个遗传病、单独使用一个RFLP、都有相当一部分父母染色体无法区分、所以要联用若干种RFLP及相当探针，提交诊疗。d、待检亲代必须为生物学意义亲代。基因诊疗医学知识专家讲座第21页③连锁不平衡并不多见：指某一个多态性位点在基因和等位突变基因中分布频率有显着差异。所以可用与特异等位基因连锁这一多态性进行基因诊疗。如：正常人酶切图谱有9/9、22/9、22/22kb型，β-地贫纯合子只有9/9kb型（kan发觉撕工岛人β-珠蛋白基因3’BamHI多态性位点）故不经家系分析，仅以这一多态性即可用产前诊疗。④RFLP连锁分析可能常是可靠。连锁分析存在一定错误原因是：a、人为差错。b、RFSP连锁分析方法本身差错程度（方法本身不足。）因为在减数分裂中间传染色体一些区域能够发生重组和交换，从而使得原先共同遗传DNA突变与RFLP发生分离，这么情况下作出连锁分析结果就会发生错误。诊疗错误率能够从DNA标志与疾病共同遗传度来预计，重组率高于5%连锁探针不宜采取，事实表明，除个别情况外，因为染色体重组所致错误诊疗小于1%，所以，RFLP连锁分析通常是可靠。基因诊疗医学知识专家讲座第22页2、微小重复序列（如CA序列）多态性分析。（１）基本方法：PCR/PAGE家系分析法（教材P146）。①重复单位和重复次数不一样含有高度遗传多态性，对他们和等位基因进行家系分析，说明他们遵照孟德尔遗传规律、是一套新遗传标识系统（２）应用举例：产前基因诊疗杜氏肌营养不良（突变类型未明）。基因诊疗医学知识专家讲座第23页（七）基因表示异常诊疗。1、mRNA相对定量（1）点杂交（或狭缝杂交）光密度扫描法；（2）RT—PCR；2、mRNA绝对定量RT—PCR/竞争性PCR3、mRNA长度分析Northern杂交法，RT—PCR产物电泳分析（八）病原体诊疗PCR法基因诊疗医学知识专家讲座第24页第三节基因诊疗应用一、遗传病基因诊疗（一）血红蛋白病血红蛋白病是因为血红蛋白合成异常所致遗传性血液病。习惯上分为异常血红蛋白病和地中海贫血２类。1.异常血红蛋白病是珠蛋白肽链结构改变变造成主要功效部位氨基酸置换，影响Hb溶解度、稳定性及生物学功效。分子基础：单碱基替换，缺失、插入……

２.地中海贫血（α地中海贫血和β地中海贫血）是珠蛋白合成速率降低，造成链和非链合成不平衡→多出珠蛋白链沉积在Rbc膜上→改变了膜通透性和硬度→造成溶血性贫血。基因诊疗医学知识专家讲座第25页4.诊疗要求HbPunjabα地中海贫血（α珠蛋白合成↓）β地中海贫血（β珠蛋白合成↓）占我国新疆异常Hb病55.6%（1）产前诊疗为主要目标。每一民族或群体有特突变类型谱中国人主要突变类型有6种（P30）分子基础Hbβ链121密码单个碱基替换：GAA（Glu)→CAA（Gln）→改变了EccRI一个识别位点大多数是α珠蛋白基因缺失所致。点突变、缺失或插入往往不包括限制酶识别位点。DNA诊疗：PCR扩增（β珠蛋白第3个外显子和基因3´端DNA序列、全长144bp）EcoRI酶切电泳分析。（3）液体分子杂交C1限制酶谱分析，或PCR扩增电泳分析PCR/ASO探针法（主要方法）结果正常对照40/104bp两个片段HbPuNJob144bp,40/104bp两种类型杂合子（同理扩增β珠蛋白DNA片段MnlI酶谱分析诊疗HbE（β26Glu→Lys))正常对照有正常杂交信号（C1）酶切片段不缺（C2）PCR产物有（C3）α地贫与正常结果反之。PCR/RFLP连锁分析法RNA诊疗：异常Hb病人mRNART/PCR产物测序知编码区碱基改变—推导对应氨基酸改变。RT-PCR介导α珠蛋白mRNA定量↓。①PCR介导mRNA定量法。②mRNA剪切缺点检测（自学）基因诊疗医学知识专家讲座第26页（二）杜氏肌营养不良症（DMD）和贝克营养不良症（BMD）

1.DMD和BMD是常见性连锁隐性遗传病，2.主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.21—21.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不一样。DMD多在5岁发病，在20岁左右因为心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴1/3500。BMD症状较DMD为轻，寿命较长，并有生育能力，发病率为1/30000。3.分子基础：抗肌萎缩蛋白基因内（1）DNA片段缺失（60%病例→造成阅读框移码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。（2）部分重复（病例5%）（3）缺失或重复2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范围内。基因诊疗医学知识专家讲座第27页4.DMD、DNA诊疗因DMD（及BMD）大多数为基因缺失所致，该病DNA诊疗主要是抗肌萎蛋白基因缺失检测。诊疗技术：（1）基因组探针法用XP21区分离得到不一样探针如（P20）来接进行对应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。（2）cDNA探针法抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、外显子拼接改变和基因内部分重复。（3）多重PCR法如有些人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因9个易发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失DMD患者。（4）多态性分析法基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析或CA多态性分析适适用于非缺失型DMD。5.DMD、RNA诊疗：诊疗技术RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。联用测序：可定位基因缺失起始和终止。基因诊疗医学知识专家讲座第28页（三）苯酮尿症（PKU）

1、苯尿症是一个常见隐性患传性氨基酸代谢病。2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→儿茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素

（2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，不然发生不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。3、分子基础：（1）迄今约3/4造成中国人经经典重PKU突基因已被查清，它们分属11种基因PAH基因点突变。体外研究表明，这些突变造成PAH活力↓或丧失。（2）PAH第11外显子第399密码GTA（val）→GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶识别位点，故又称“序列多态性”。②这一“序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着连锁不平衡性，故可作为一个“遗传标识”应用于产前诊疗。苯丙氨酸羟化酶↓（肝、PAH）基因诊疗医学知识专家讲座第29页4、DNA诊疗：①PCR/ASO探针法。若待诊疗PKU家系基因突变类型尚属“未知”或无RFLP信息。②PCR/SSCP—直接则序法→不定时出导PKU点突变。5、序列多态性连锁分析前提是该家系存在述第399密码子序列多态性用于产前诊疗：（不知基因实变类型，也无RFLP信息。）病案—某孕妇曾生育一例PKU患者，现妊娠第二胎8周，要求对胎儿进行产前诊疗。诊疗：（1）PAH基因RFLP分析：该家庭除ECORI外，其它酶切点都不含有杂合性，而丈夫、患儿、孕妇、胎儿双均为ECORI11/17kb片段杂合子，所以胎儿可能正常，可能为PKU患者。据RFLP分析无法对胎儿作出产前诊疗（为何？缺乏基因连锁分析先决条件。（2）序列多态性：PCR/ASO探针DNA片段点杂交法。①PCR扩增父亲、孕妇/患儿、胎儿PAH基因片段。②合成ASO（对应于第399密码子中性实变序列一对等位基因特异ASO探针。③杂交：说明：①患儿扩增DNA片段与正常/中性突变ASO探针杂交;②父亲;③胎儿扩增a、患儿1个PKU，基因与密码子399A→T中性突变相偶（连锁），这个PKU基因来自母方。a.孕妇。b、胎儿没有这一中性实变，能够排除胎儿为PKLL患者，结合ECLRI位点RFLP资料，可产和诊疗胎儿完全正常。c、胎儿出生后基因分析和随方证实诊疗正确。DNA片段中能与正常ASO探针杂交。基因诊疗医学知识专家讲座第30页四、血友病是一个遗传性凝血功效障碍出血性疾病，因为正常凝血过程中血浆凝血活力有缺点所致。患者常因出血不止或继发病而夭折，治疗主要靠替换疗法，输入缺乏血浆因子。重型血友病甲和乙男性发病率为1/5000~1/50000。为甲型血友病和乙型血友病。

主要特征：①是一组X连锁遗传凝血缺点疾病。②缺乏Xq远端FⅧ（凝血因子Ⅷ）所致。③基因突变具极为异质性，与β地贫不一样。（因子占X染色体全长0,1%，共186kb包含26个外显子）不存在存族和群体特异性，几乎每一个不一样甲型血友病家系都含有自已独特突变类型。（所以该病基因诊疗不宜用PCR/ASO探针直接检测点突变，而主要依赖RFLP连锁分析）①也是X连锁遗传凝血缺点疾病。②约1%左右乙型血友病人FIX基因缺失（因而在用替换疗法过程中会产生FIX抑制物）。③在非缺失（FIX基因）型中，已发觉398种不一样基因突变。（FIX基因定位在Xq26→q27，全长34kb包含8个外显子）。基因诊疗医学知识专家讲座第31页①已克隆化FIXcDNA和DNA片段，判定了FIX基因5个限制者多态性位点，故可用RFLP连锁分析进行产前诊疗和携带者检测。②病倒：乙型血友家系分析FIX基因发觉某患者缺失该基因5kbDNA序列（第2~3外显子+第2内含子全部+部分第1，第3内含子）a、对该家系一例乙型血友病变高危妊娠产前基因诊疗，诊疗胎儿为男性乙型血友病患者。b、对该孕妇第二胎产前诊疗为女性乙型血友病基因携带者。（上海医遗传所淅江乙型血友病家系）4、诊疗情况（报道）：①应用克隆化FⅧcDNA与VIII基因连锁DNA片段和DX18、St14等分析了基因或旁侧限制酶酶切位点多态性，并采取PCR/BCLI或XbaIRFLP连锁分析法进行了甲型血友病产前诊疗和携带者检测。②用PCR/SSCP法检验了FVIII内含子18处BCLI多态性。（终止妊娠对胎儿作凝血子测定和DNA分析、证实产前诊疗正确。）基因诊疗医学知识专家讲座第32页类别基因特征诊疗方法1、病毒性肝炎①甲型肝炎（HAV）①甲肝病毒基因是线状分子、约含于7500个核苷酸。②已获HAV几个毒株cDNA克隆。①CDNA探针杂交（RNA）法。②SSRNA探针杂交（RNA）法有报道。②乙型肝炎（HBV）①HBVDNA约3.3kb，是非共价闭合环状结构。①PCR斑点杂交法。②PCR电泳EB染色法③丁型肝炎（HDV①HDV基因为环状SSRNA长约1678个核苷酸①DNA或cDNA探针杂交（RNA）法②RT/PCR单抗ELISA法2、细菌引发疾病（1）产毒性Ecoli、侵袭性Ecoli;(2)霍乱弧菌；（3）痢蒺杆菌；（4）淋球菌基因诊疗用PCR扩增斑点杂交法。3、疟疾、寄生虫基因诊疗用PCR或结合探针技术。二、传染病基因诊疗基因诊疗医学知识专家讲座第33页三、肿瘤基因诊疗（一）基因重排生理和病理基因重排—指一些基因片段改变原来存在次序，经过调整相关基因片段连接次序，再重排为一个完整转录单位1.生理（1）基因表示DNA水平调控方式之一。（2）免疫球蛋白分子多样性分子机理之一。2.病理重排和重组位点之间DNA片段移除，会使在恒定区两侧一些限制酶切位点位置发生改变。可用：（1）限制性片段长度改变；（2）分子杂交（恒定区域连接区基因为探针）。确定基因重排存在是否，以对肿瘤进行基因诊疗。基因诊疗医学知识专家讲座第34页免疫球蛋白重链基因探针（J）和轻链基因探针（k，入）对B细胞淋巴瘤DNA杂交图谱。说明：1、正常对照2、B细胞淋巴瘤，入基因无重排，重排后杂交端位置试验：提取瘤细胞DNA→酶切（最少2组以上）杂交（最少两种以上）→结论（看到2组以上杂交图谱改变时，即可下诊疗结论）。12J1212k入（二）基因内部重排与B细胞淋巴瘤基因诊疗医学知识专家讲座第35页（三）基因间重排（染色体易位）淋巴样肿瘤细胞染色体易位癌基因肿瘤染色体易位发生频率C-myc……………………bc1-2囊性淋巴瘤t（14;18)(q32;qI1)85%……两个主要事实：1、囊性淋巴瘤染色体易位频率最高；2、全部易位都包括到C-onc易位。这对于诊疗，分型和预后含有主要意义。基因诊疗医学知识专家讲座第36页1.图：22号染色体和9号染色体易位造成慢性粒细胞白血病（CML）易位结果22号染色体长臂丢失，形成微小ph（费城首次发觉）染色体。（CML中90—95%病例含有ph染色体）。（四）基因重排与CML诊疗9229q+22q-基因诊疗医学知识专家讲座第37页2.说明：1.ph染色体是染色体易位t（9;22）2.C-oncC-ab和c-sis分别位于第9号和第22号染色体长臂上，易位包括到两个癌基因交换（基因间重排，但通常不包括它们基因内部重排，故普通认为重排后它们基因结构并无改变）。3.CMLDNA分子中最含有结构特点并能够用于诊疗序列区域是bcr，研究发觉，第9号染色体断裂点位置改变很大，多半出现在c-abl5’端100kb区间内；第22号染色体断裂点较集中，基本上存在于一个5.8kb区域内。这个区域叫断裂点簇区即bcr。4.CML发生染色体易位时，先在各自断裂点处断开，然后进行基因间重排，使c-abl/bcr形成融合基因，此基因可转录和翻译自己特异mRNA和蛋白质。5.为了准确测定bcr重排，须：①选择适当探针；②选择两个以上限制酶酶解产物作杂交分析。③CML含有bcr重排（多数）和bcr未重排型（少数）④Bcr重排等同ph阳性；⑤Bcr重排与CML缓解期复发有正性关系，与预后相关系，与ALL，AML相关系。PCR技术检测bcr/abl转录产物也可用作CML诊疗，预后和判断治疗效果等用途。基因诊疗医学知识专家讲座第38页（五）肿瘤异质性分子基础：基因表示图谱分析用于肿瘤分类分期（六）基因扩增与乳腺癌预后（七）原位杂交技术在肿瘤病理诊疗中应用（自学）。四、基因诊疗方法在法医学上应用（一）DNA指纹（基因指纹）

概念——在人体基因组DNA中存在高度可变小卫星区域，在同一酶解物Sou-thern印迹图上同一个体不一样组织起源DNA谱带完全一致，而不一样个体之间（除非同卵双生）谱带都不相同，如同人指纹含有高度个体特异性一样，这种southern印迹图被称为DNA指纹。基因诊疗医学知识专家讲座第39页1.Jeffreys据珠蛋白基因座近处出现RFLP频率及测定核苷酸总数，推算出人基因异质性是非常大，约100bp中就有一个差异，但并不完全均一，有次序（关键序列）比较稳定，有区域变动很大（超变区）它们都是一些很短重复次序。2.对这些重复次序酶切时，可产生16，17、32、33、3F、4、62和3F6bp长度不等限制性片段。3.人工合成很短重复序列作为探针，与酶切人体DNA作southernblot，可得出长度不等杂交带，杂交带数目和分子大小，几乎不可能有两个人是完全相同，所以，把这种杂交图形称为DNA指纹，它是基因特异诊疗有力依据。4.DNA指纹按孟德尔方式遗传。（二）DNA指纹分析在法医学应用于个体识别和亲子判定。基因诊疗医学知识专家讲座第40页自测题一、单项选择题1、1976年简悦威采取液相DNA分子杂交技术在世界上首次完成了（）A、α－地中海贫血基困诊疗B、β－地中海贫血基困诊疗C、血红蛋白病M基因诊疗D、疟原虫基因诊疗2、基因诊疗是在基因水平上对疾病或人体状态进行诊疗，它包含（）A、血清学诊疗B、生化学诊疗C、产前诊疗D、病理学诊疗3、在核酸分子杂交基因分析方法中，最经典是（）A、NorthernblotBWesternblotCdotblotD.Southernblot4、聚合酶链式反应（PCR）又称为基因体外扩增，它与基因体内扩增不一样是（）A、反应体系模板不一样B、聚合酶辅基不一样C、聚合反应方向不一样D、反应体系所需温度差异基因诊疗医学知识专家讲座第41页5、检测长度相同而构象不一样单链DNA需要进行（）A、琼脂糖凝胶电泳B、聚丙烯酰胺凝胶电泳C、琼脂粉电泳D、圆盘电泳6、限制酶酶谱分析中，惯用限制酶是指（）A、Ⅰ型限制酶B、Ⅱ型限制酶

C、Ⅲ型限制酶D、Ⅰ型和Ⅲ型限制酶7、限制酶酶切图谱经常被人们称作（）A、DNA遗传图谱B、DNA连锁图谱C、DAN消化图谱D、DNA物理图谱8、核酸序列测定方法始建立于（）A、20世纪50年代早期B、20世纪60年代早期C、20世纪70年代后期D、20世纪80年代后期基因诊疗医学知识专家讲座第42页9、Sanger双脱氧末端终止测序法链终止剂是（）A．2、3－二脱氧核糖核苷酸B、2、4－二脱氧核糖核苷酸C、3、4－二脱氧核糖核苷酸D、3、5－二脱氧核糖核苷酸10、20世纪90所代初，适应“后基因组时代”到来，基因芯片技术率先（）A、在美国开启B、在日本开启C、在欧洲开启D、在以色列开启11、基因芯片实质是一个（）A、高密度单克隆抗体列阵B、高密度多肽列阵C、高密度核酸列阵D、高密度寡核苷酸列阵12、对于突变位点已被说明一些遗传病，能够采取基因诊疗方法是（）A、PCR/ASO探针法B、PCR/SSCP/sequencing法C、RT/PCR法D、RFLP分析法基因诊疗医学知识专家讲座第43页13.α-珠蛋白质基因蔟定位于（）A、6P13.3-Pter，B、17P13.3-Pter，C、18P13.3-Pter，D、19P13.3-Pter，14、α-地中海贫血患者分子缺点主要有（）A、2种基因型B、3种基因型C、4种基因型D、5种基因型15、地中海贫血是一个（）A、巨幼红细胞贫血；B、营养性缺铁性贫血；C、遗传性溶血性贫血；D、障碍性贫血16、B-地中海贫血患者基因缺点主要有（）A、少数核苷酸缺失或插入；B、大片段丢失或插入；C、基因重排或染色体易位；D、点突变或阅读框易位

基因诊疗医学知识专家讲座第44页17、杜氏肌营养不良症（DMD）患者基因缺失主要热点区位于DMD基因（）A、起始区；B、尾区；C、中央部位；D、中央部位内含子区域18、甲型血友病基因缺点是（）A、

凝血因子Ⅷ片段缺失，点突变或插入；B、

凝血因子Ⅸ片段缺失，点突变或插入；C、

PAH严重缺乏；D、CK水平升高19、用基因诊疗方法对感染性疾病进行诊疗主要优点是：A、

诊疗过程对人体没有损伤；B、能够进行病因诊疗；C、方法简便，费用较低；D、能够早期诊疗20、当前普遍采取SOUTHERN印迹杂交进行DNA指纹分析，用于法医案检工作中个体识别和亲子判定，其分子基础是（）A、

DNA多态性；B、RNA多态性；C、蛋白质多态性；D、氨基酸多态性基因诊疗医学知识专家讲座第45页二、多项选择题1、人类疾病发生经常包括到（）A、

内源基因突变；B、外源基因入侵；C、基因重组；D、姐妹染色体交换2、机体对外源性病原体入侵防御表达在（）A、整体水平；B、细胞水平；C、分子水平；D、基因水平3、基因诊疗目标是为了（）A、

确诊对应疾病；B、得出对应结论C、作为防治疾病依据D、开展基因治疗4、从基因诊疗发展史来看，含有代表性分子生物学技术有（）A、核酸分子杂交；B、PCR；C、DNA芯片技术；D、限制性酶切图谱分析技术基因诊疗医学知识专家讲座第46页5、基因诊疗技术和方法按原理大致可分为（）A、DNA探针技术；B、PCR技术C、DNA探针和PCR结合技术D、DNA测序技术6、基因诊疗路径有：A、直接探测基因结构是否存在突变；B、检测基因转录产物mRNA是否表示异常；C、检测基因表示产物蛋白质结构改变；D、依据临床诊疗初步结论进行基因诊疗7、对感染性疾病进行基因诊疗分子生物学依据是：A、DNA或者RNA是生物遗传信息载体；B、全部生物使用相同构件分子；C、每种生物大分子在细胞中有特定功效D、每个物种特征是经过它含有一套与众不一样核酸和蛋白质而保持8、基因突变存在以下共同特点，即（）A、稀有性B、随机性C、可逆性D、有害性基因诊疗医学知识专家讲座第47页9、当前惯用基因探针有（）A、cDNA探针B、基因组探针C、人工合成DNA探针D、RNA探针10、惯用基因探针标识方法有（）A、地戈辛标识B、生物素标识C、放射性P标识D、放射性35S标识三、名词解释1、基因诊疗2、

DNA指纹3、RFLP四、答题1、简述你对基因诊疗概念了解2、简述基因诊疗基本路径3、简述基因诊疗基本技术和方法4、简述基因指纹在法医案检工作中个体识别与亲自判定分子生物学基础五、

叙述题1、试论基因诊疗方法与传统疾病诊疗方法区分与联络？2、论基因诊疗与医学诊疗学辨证关系3、试论遗传性疾病基因诊疗思维程序4、试论感染性疾病基因诊疗思维程序基因诊疗医学知识专家讲座第48页参考答案与题解一、单项选择题1、A、液相杂交是指在溶液中进行杂交反应，杂交反应后需将杂交分子（双链）与未杂交分子（单链）分开，再判断杂交程度，通常灵敏度较低。1976年简悦威定成α-地贫基因诊疗为基因诊疗饿发展作出了开创性贡献。2、C．产前诊疗关系到优生优育和胎儿质量。有遗传病生育夫妇中有一方为常染色体显性或者父方为X连锁隐性遗传病携带者及凡可进行产前基因诊疗疾病，妊娠确立后应在适当初间接收产前诊疗。血清学诊疗、生化学诊疗和病理学诊疗均为表型诊疗（深入参考叙述题1）基因诊疗医学知识专家讲座第49页3.Dsouthernblot是经典核酸分子杂交基因分析方法，其余核酸分子杂交基因分析方法均由此发展或派生而来。4.D核酸体内扩增核酸体外扩增（1）模板DNA或RNADNA或RNA（2）酶DNA聚合酶或逆转录酶DNA聚合酶或逆转录酶（3）酶辅基Mg+等Mg+等（4）引物RNADNA（5）PH7.2±7.2±（6）温度37℃94℃（变性）、55℃（退火）、72℃延伸基因诊疗医学知识专家讲座第50页5、B．PAGE分辨率高，适合于SSCP分析，琼脂糖凝胶用于普通核酸电泳，琼脂粉普通用于细菌固体培养基配制。圆盘电泳是PAG一个古老形式，已逐步被淘汰。6、B．型限制酶能够识别DNA分子特异序列，并在该部位切割，故能取得特异DNA片段。I型和III型限制酶不具备上述特征。7、D．标明限制酶在DNA分子上限制位点数限制片段大小以及排列次序图谱通常称为DNA物理图谱或者是限制性图谱，遗传图、连锁图请参考人类基因组计划相关知识8、C由 Sanger等开始建立。基因诊疗医学知识专家讲座第51页9、Aα—脱氧核糖核苷酸分子戊糖环第三位脱氧，则无法与下一个脱氧核苷酸形成3`5`磷酸二酯键，多核苷酸链无法延伸，故为链终止剂。是否存在天然或人工2、4—二脱氧核糖核苷酸和3、4—二脱氧核糖核苷酸及其作用尚不得而知。核苷酸戊糖环第五位连接磷酸无氧可脱。10、A11、C受人类基因组计划促进和计算机芯片技术启发，基因芯片技术首先在美国开启，在对开发利用基因组计划研究结果有着深远意义。（深入参考第十五章基因芯片技术）。12、A诊疗已知点突变遗传性疾病，能够首选 PCR/ASO探针法，扩增DNA片段与对应ASO（等位基因特异性寡核苷酸）探针杂交，即可明确诊疗是否有突变及突变是化合子还是杂交子。诊疗未知点突变可用PCR/SSCP/SEQUENCING方法，经过确证性测序能够得知点突变位置。RT/PCR法用于基因表示异常诊疗，RFLP法则适合用于多态性分析。基因诊疗医学知识专家讲座第52页13、A14、B15、C地中海贫血是一个因为珠蛋白合成障碍遗传性溶血性贫血。其病理机制及巨幼红细胞贫血，营养性缺铁性贫血和障碍性贫血深入参考内科学。16、D17、C18、A19、D内源性基因突变，与基因型改变没有引发表型改变或不足以引发表型改变或感染性疾病早期，外源入侵基因，不足以引发机体表型改变（如感染量极少），用基因诊疗方法则能够进行早期诊疗。基因诊疗属于病因诊疗，但不是其主要优点。诊疗是用医学科学方法对疾病表现所作出辨证逻辑绪论。临床诊疗过程对人体都有一定影响。基因诊疗正逐步走向临床。20、A1985年Jeffreys等人在人体基因组DNA中发觉了高度可变小卫星区域，在同一酶解物Southerblot图上，不一样个体之间除非同卵双生谱带都不一样，原因是小卫星高可变区形成DNA多态性。属于蛋白质、氨基酸和RNA尚没有多态性这一说法。基因诊疗医学知识专家讲座第53页一、

多项选择题1、

AB人类疾病发生往往包括内源性基因突变，如遗传病和外源性基因入侵，如感染性疾病（细菌、寄生虫感染等）。基因重组和姊妹染色体交换是基因“生理”过程，可能产生疾病，不过从遗传学上来说是希有事件。2、ABCD机体抵抗外源性病原体表示在整体水平，表现为机体调动本身免御系统整体防御。在细胞水平如Mφ吞噬异物，分子水平则有抗原抗体反应。基因水平则表现为限制修饰系统对入侵DNA水解作用。3、ABCD4、ABC5、ABC6、ABD检测基因表示产物蛋白质结构改变属于表型诊疗。基因诊疗必须建立在临床诊疗初步结论基础上，不是随意诊疗。AD依据生命状态基本逻辑原理每个物种都有一套与众不一样核酸，此为感染性疾病诊疗分子学依据。基因诊疗医学知识专家讲座第54页7、AD据生命状态基本逻辑原理，每个物种都有一套与众不一样核酸，此为感染性疾病诊疗分子生物学依据。8、ABCD从遗传学上来说，基因突变有以下特点：（1）希有性基因突变在任何一个生物都是一个希有事件，对人类来说，其突变频率约为10-5~10-6/细胞代，细菌为10-7~10-8/细胞代；（2）随机性基因突变不论对细胞、个体或是对基因或是对基因表型影响方向来说，都是随机事件；（3）可逆性基因能够发生正突变，也可发生回复突变，只不