第六章-基因工程抗体课件

基因工程抗体1精选课件pptEmilvonBehring,1901,

antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,

structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibodyPaulEhrlich,1908,productionofantibodyNobelPrizewinners2精选课件ppt3精选课件ppt免疫球蛋白的功能4精选课件ppt美国FDA已批准的治疗抗体药物OrthocloneReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath-1HZevalin移植排斥心绞痛B细胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥婴儿呼吸道合胞病毒类风湿关节炎乳腺癌急性复发性髓性白血病难治性慢性淋巴细胞白血病难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤198619941997199719981998199819982000200120025精选课件ppt一抗体分子结构6精选课件ppt免疫球蛋白的功能区7精选课件ppt免疫球蛋白的水解片段8精选课件pptcomplimentaritydeterminingregion,

CDR9精选课件ppthypervaribleregion

(HVR)(complimentaritydeterminingregion,

CDR):formationoftheAgbindingsite10精选课件pptpurple:HVCDR(inboththeribbonandballandstickviews)green:antigenHVsequencescontacttheantigen.antibodyantigenantigen-antibodycomplex:

epitope11精选课件ppttheantibodymolecularsurface,withthePorAantigensuperimposed.Closeupofahydrogenbond–TheTyr101oftheantibodyformsahydrogenbondwiththeGln121oftheantigen12精选课件pptIg胚系基因结构特点在Ig分子多肽链中，κ型、λ型轻链和Ig的重链分别写作Igκ、Igλ和IgH，基因依次写作IGK、IGL和IGH，其分别位于第2、22和14号染色体上。

13精选课件ppt重链:位于14号染色体，可分为4组CμV区编码基因:

VH(可变区)-----48

DH(多样性区)-----23

JH(连接区)-----6C区编码基因:

CH(恒定区):Cμ,Cδ,Cγ等10个片段14精选课件ppt轻链(--2号染色体,--22染色体)V区编码基因:

----V,J---40,5

----V,J---30,4C区编码基因:

C(1);C(4)15精选课件ppt二、细胞工程抗体和基因工程抗体第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体第三代：基因工程抗体抗体技术的发展经历了三个阶段16精选课件ppt1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。

1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白、丙种（γ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。

1975年KöhlerandMilstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)。1994年基因工程抗体。17精选课件ppt1、多克隆抗体(polyclonalantibody;PcAb)18精选课件ppt多价抗原多个克隆（致敏的B细胞）多克隆抗体19精选课件ppt

实际意义

（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清抗破伤风，胎盘球蛋白抗病毒感染等，副作用：

超敏反应。（2）临床诊断，如：肥达氏反应---伤寒、副伤寒，缺点：特异性差。20精选课件ppt2、单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。特点：具有高度均一性。杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞---无限增殖；免疫B细胞---合成、分泌特异性抗体。杂交瘤技术---HAT培养基：次黄嘌呤(H),氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。21精选课件ppt

单抗制备的流程图22精选课件ppt

实际意义：

（1）抗原的纯化和结构分析；（2）细胞发生、分化及功能的阐明；（3）临床疾病的诊断和治疗，如：免疫分子检测；免疫导向药物治疗恶性肿瘤

---McAb抗癌药物(毒素或放射核素偶联)。

23精选课件ppt多克隆抗体单克隆抗体来源动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群多为鼠源性特点来源广泛、制备容易纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应组成针对不同抗原表位的抗体的混合物针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致应用疾病的被动免疫治疗疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备缺点特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备人体应用后可导致人鼠抗体反应多克隆抗体与单克隆抗体的比较24精选课件ppt单抗体内应用和疗效受限原因：1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少3.生产成本高,难于普及应用25精选课件ppt人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，主要包括嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白和双特异性抗体。26精选课件ppt基因工程抗体27精选课件ppt1小分子抗体3鼠单抗人源化基因工程改造的抗体228精选课件ppt

第一代的抗体人源化—嵌合抗体

从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的免疫排斥反应。

特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。29精选课件pptPr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略30精选课件ppt鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体31精选课件ppt第二代的抗体人源化——改型抗体

在嵌合抗体的基础上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR(frameworkregion)替换成人的FR，保留与抗原结合部位决定簇互补区（complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)

早期的改型抗体：简单的CDR移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。32精选课件ppt33精选课件pptCDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体鼠单克隆V区人源化（CDR移植）34精选课件ppt

小分子抗体

人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体。35精选课件ppt单价小分子抗体一、Fab抗体

Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。36精选课件ppt二、单链抗体(ScFv)

定义：用基因工程方法，将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。Ag37精选课件ppt

ScFv应用：用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗研究基因结构与功能的关系38精选课件ppt小分子抗体12339精选课件ppt免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体L链表达载体共转染细胞PrVHCH1PrVLCLFab抗体分子的制备IFabantibodymolecule40精选课件ppt抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗体分子的制备41精选课件pptIIFvantibodymolecule42精选课件ppt分别构建载体L链表达载体H链表达载体共转染细胞PrVHPrVLFv[二硫键稳定的Fv(disulfide-stabilizedFv,ds-Fv)]小分子抗体的制备(1)ds-Fv43精选课件ppt抗体分泌细胞VHVL-S-S-Fv小分子抗体的制备disulfide-stabilizedFv,ds-Fv44精选课件pptVHVL接头DNA(Gly4Ser)3VH引物PCRVH接头DNA酶切、克隆ScFv(singlechainFv,scFv)的构建变性、复性VL引物(2)Sc-FvVL45精选课件ppt三、单域抗体

抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。46精选课件ppt四.超变区多肽

抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR）来实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimalrecognitionunit,MRU)。47精选课件ppt提高抗体效应功能抗体融合蛋白双特异性抗体偶连细胞毒物质细胞内抗体提高抗体效应功能48精选课件ppt双特异性抗体抗原A抗原B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVL49精选课件ppt50精选课件pptCTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B51精选课件ppt制备双特异性抗体的方法主要有3种：

（1）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的Mab细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体。52精选课件ppt它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有10种形式：重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗体分子：

LH-HL，KG-GK

重链特异性相同的配对抗体分子：

LH-HK，KH-HKKG-GL，LG-GL

重链、轻链特异性不同的配对抗体分子：

LH-GK，LH-GLKH-GL，KH-GK53精选课件ppt在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才是所需的双功能抗体分子。54精选课件ppt（2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早从事这方面的研究。化学交联的方法无需经过细胞融合，所以比较简便易行。通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半分子结合在一起。或用双功能交联剂，如邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一起。

55精选课件ppt56精选课件ppt

用于制备双功能抗体的Mab可以是完整分子，也可是经胃酶水解获得F（abˊ）2片段。后者在减少鼠源免疫原性方面，效果较好。57精选课件ppt（3）利用基因工程技术将两套重轻链基因导入骨髓瘤细胞或传染瘤细胞中。这种方法制备的双功能抗体可选择合适的稳定区和合适的类及亚类，而得到较好的产量较高的双功能抗体。由于只有较少的嵌合导入并整合到宿主基因组，故传染瘤细胞更为稳定，染色体不易丢失58精选课件ppt抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。根据构建方式的不同，主要分为两种形式：Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）由抗体的Fc段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重