碱性磷酸酶的分离纯化鉴定

关于碱性磷酸酶的分离纯化鉴定分离纯化的一般程序选择材料破碎细胞提取分离纯化分析及鉴定第2页,共20页，2024年2月25日，星期天AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中），AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），原理：第3页,共20页，2024年2月25日，星期天操作一、取材及匀浆取兔肝2g，剪碎，加入6ml0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分匀浆。

记录体积（取0.1ml至一新EP管留作A液，测定时稀释25倍）二、提取加入2ml正丁醇，搅拌2min，室温放置30min。过滤，留上清。计体积。第4页,共20页，2024年2月25日，星期天三、分离纯化1、50％丙酮沉淀AKP

加入等体积丙酮，3000rpm×5min，留沉淀，加4ml0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。（取0.1ml留作B液，稀释10倍）2、30％乙醇溶解AKP

每ml溶液中加入95％乙醇0.46ml2000rpm×5min，留上清（记录体积）3、60％乙醇沉淀AKP

每ml溶液中加入95％乙醇0.86ml3000rpm×5min，留沉淀，加3ml0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。（取0.1ml留作C液，使用时稀释5倍）第5页,共20页，2024年2月25日，星期天4、33％丙酮溶解AKP

每ml溶液中加入0.33ml丙酮

2000rpm×5min，留上清（记录体积）5、50％丙酮沉淀AKP

每ml溶液中加入0.36ml丙酮

3000rpm×15min，留沉淀，

5mlPh8.8的Tris-醋酸镁溶解沉淀（D液，不稀释）第6页,共20页，2024年2月25日，星期天四、分析及鉴定1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法）2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法）3、比活性及纯化倍数计算第7页,共20页，2024年2月25日，星期天分光光度法

（Spectrophotometry）根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收（即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法（Absorptionspectrometry）。不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来第8页,共20页，2024年2月25日，星期天（一）基本原理

光具有波粒二相性。波长和频率是光的波动性的特征。1、光的基本知识紫外分光光度计（200－400nm）可见光分光光度计（400－760nm）红外分光光度计（760－1000nm）第9页,共20页，2024年2月25日，星期天2、定量分析的理论基础－－Lambert—Beer定律A＝K·L·C吸光度(Aabsorbance,A)消光度(degreeofextinction,E)光密度(opticaldensity,D)K--吸光系数,是物质的特征性常数。第10页,共20页，2024年2月25日，星期天对比法进行定量分析A样

=K·L·C样A标

=K·L·C标A样A标K·L·C样K·L·C标C样C标C样

=A样·C标/A标第11页,共20页，2024年2月25日，星期天单色光、平行光（λmax）溶液均匀、清澈、无散射溶液性质稳定，比色皿中无化学反应适用于稀溶液（A0.2-0.7）Lambert—Beer定律的适用范围：第12页,共20页，2024年2月25日，星期天溶剂空白：当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液。试剂空白：当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这种方式最为常用。参比溶液的选择第13页,共20页，2024年2月25日，星期天基本组件及常见分光光度计第14页,共20页，2024年2月25日，星期天分光光度计的使用1.打开电源预热15分钟2.选择波长（λmax

）3.光标指向Trans4.打开光门，调节0％；关上光门调节100％5.重复4一次6.将光标指向ABS7.读数第15页,共20页，2024年2月25日，星期天磷酸苯二钠碱性磷酸酶苯酚

+磷酸盐碱性苯酚

+4-氨基安替吡啉+铁氰化钾红色醌式化合物AKP活性测定基本原理－－磷酸苯二钠法第16页,共20页，2024年2月25日，星期天单位（ml）空白管标准管ABCD各阶段稀释液酚标准液（0.1mg/ml）Tris-醋酸镁复合底物液//0.10.10.10.1/0.1////0.1/////333333酶活性单位（U/ml）=A样A标×0.1×稀释倍数37保温15分钟各管加入铁氰化钾液2ml，静置15min510nm比色酚标准液浓度稀释倍数(PH8.8tris醋酸镁溶液）//251051第17页,共20页，2024年2月25日，星期天蛋白含量测定基本原理－－BCA法蛋白质+Cu2＋

碱性BCA试剂紫色化合物Cu＋二喹啉甲酸，BCA第18页,共20页，2024年2月25日，星期天单位（ml）空白管标准管ABCD各阶段稀释液蛋白标准液（0.2mg/ml）

蒸馏水BCA试剂

//0.10.10.10.1/0.1////0.1/////1.51.51.51.51.51.5蛋白含量（mg/ml）=A样A标×0.2×稀释倍数37保温30分钟562nm比色蛋白