附件2：两面针5种成分含量测定 高效液相色谱一测多评法（征求意见稿）

Q/LB.□XXXXX-XXXXII前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由广西壮族自治区药用植物园提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西壮族自治区药用植物园、广西广林正山药业有限公司、深圳市中药制造业创新中心有限公司、华润三九医药股份有限公司。本文件主要起草人：朱艳霞、乔丽娅、胡凤云、彭玉德、夏祥华、付金娥、张洪胜、马庆、陈剑洪、刘光快、陆日文、唐真郎、李浩通。引言两面针，为芸香科植物两面针（Zanthoxylumnididum(Roxb.)DC.）的干燥根，是广西大宗道地药材。两面针中含有生物碱类、黄酮类、香豆素类、倍半萜类、木脂素类等多种化学成分，具有抗炎、抗菌、抗癌、镇痛等多种药理活性。一测多评法是利用中药有效成分内在的函数关系和比例关系，通过测定其中一种成分而实现多种成分的同步测定，具有成本低、方法简便等特点，在中药材多指标质量评价中具有广泛的应用前景。现行两面针质量标准仅以氯化两面针碱为指标性成分，难以全面评价其质量。针对这一现状，项目组研究制定了两面针中5种成分的高效液相色谱一测多评测定方法，以保障两面针药材质量和安全性。两面针5种成分含量测定高效液相色谱一测多评法范围本标准规定了一测多评法测定两面针中木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱等5种化学成分的含量的原理、试剂、仪器、色谱条件、测定步骤、结果计算和精密度。本文件适用于两面针药材中木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱含量的测定。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。术语和定义下列术语和文件适用于本文件。一测多评法Quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker通过中药有效成分间存在的内在函数关系和比例关系,通过测定中药中某个代表性成分的含量，依据相对校正因子可计算出该中药中其他多种待测成分的含量，使其计算值与实测值符合定量方法学要求的一种多指标同步质量控制方法。相对校正因子Relativecorrectionfactor是一种修正因子，它的主要作用是修正测量值，以获得更准确的实验数据，提高研究质量，它的计算公式为某组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。原理在同时测定两面针多个指标质量成分的含量时，以两面针中典型成分氯化两面针碱做内参物，分别求出内参物与木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱等其它4个待测成分间的相对校正因子，并把相对校正因子作为一个常数用于相应成分的含量测定。试剂氯化两面针碱：分析标准品，HPLC≥98%，化学式C21H18ClNO4，分子量383.83。甲醇：色谱纯。乙腈：色谱纯。仪器高效液相色谱仪：含四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器、柱温箱和程序升温控制系统。分析天平：精度0.1mg。超声波清洗仪：功率≥500W。色谱条件AgilentEclipseC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相20%乙腈-0.1%甲酸（三乙胺调节pH至4.5）；体积流量1.0mL/min；柱温30℃；检测波长273、284nm；进样量10μL。测定步骤制备样品溶液精密称定两面针药材粉末（粒径≤0.5mm）1.0g，置于具塞锥形瓶中，加6mL的70%甲醇置于超声波清洗仪中超声提取30min，重复3次，合并提取液，用70%甲醇定容至50mL量瓶中，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试样品溶液。制备标准品溶液用分析天平精密称取氯化两面针碱标准品适量，用70%甲醇溶解并定容至25mL，制备成0.05mg/mL的对照品贮备液，置于4℃冰箱中保存备用。然后从贮备液中分别精确量取5、2、1、0.4mL，用70%甲醇定容至10mL，即得0.025、0.01、0.005、0.002mg/mL的标准品溶液。绘制标准曲线分别吸取10μL浓度为0.05、0.025、0.01、0.005、0.002mg/mL的氯化两面针碱标准品溶液依次注入高效液相色谱仪，按“7”的色谱条件，测定氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的峰面积As、A1、A2、A3和A4，以氯化两面针碱峰面积（As）为纵坐标，对照品浓度（Cs）为横坐标，绘制标准曲线。结果计算测定氯化两面针碱含量吸取10μL样品溶液注入高效液相色谱仪，按第“7”点的色谱条件，测定氯化两面针碱的峰面积（As），根据标准曲线计算出氯化两面针碱浓度（Cs）。计算木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的含量根据一测多评法确定木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的相对校正因子f1、f2、f3、f4分别为0.376、0.210、0.825、1.301。根据公式计算木兰花碱浓度（C1）：C1=f1×Cs×A1/As。根据公式计算橙皮苷浓度（C2）：C