生物技术概论基因工程

关于生物技术概论基因工程基因片段的获得、验证和表达载体构建为体外DNA重组，一般认为是基因工程的上游技术；转化和转化体筛选主要是进行目的基因向目标生物体内的转移、体内重组和重组体筛选鉴定，称为基因工程的下游技术。

第2页,共134页，2024年2月25日，星期天目的基因片段获得克隆载体(空)目的基因克隆载体基因克隆验证切出片段插入片段测序验证NY表达载体(空)目的基因表达载体表达载体验证N表达载体构建Y基因片段获得第3页,共134页，2024年2月25日，星期天Y导入工程菌或病毒直接转化介导生物验证YN生物介导转化转化目的基因DNA检测目的基因RNA检测目的Protein检测Protein活性检测室内\田间功能验证受体抗性筛选YNN筛选第4页,共134页，2024年2月25日，星期天一、目的基因的获得

1、目的基因 基因工程中用来改造生物个体或用于生产某种产物的有用基因。

2、目的基因获得方法

（1）化学合成法：按照预先设计的DNA序列，通过化学反应合成目的基因片段的方法。合成方向：3-5

合成长度：10-500bp

优点：目的性强，商业化程度高、自动化程度较高缺点：合成长度有限，设备昂贵第5页,共134页，2024年2月25日，星期天乙腈亚磷酸胺化学合成法Step1：对在担体上的第一个碱基进行脱保护（DMTr基）反应，用以准备附加下一个新的碱基。Step2：活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。Step3：第二个碱基附加反应到第一个碱基上。Step4：把第一个碱基没有和第二个碱基反应上的部分（反应失败部分）加帽封死（Capping反应)，不让其进行进一步延伸反应。Step5：对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反应，使3价磷变成5价磷，使合成产物变得更加稳定。如需进一步合成延伸碱基时，再回到Step1进行合成。如此循环往复，可以不断合成DNA碱基，直至合成完所需序列Step6：从CPG担体上用氨水切离合成终了的OligoDNA。第6页,共134页，2024年2月25日，星期天第7页,共134页，2024年2月25日，星期天（2）

PCR法：参照已知基因序列，在该基因序列保守区域设计两个引物，用PCR反应获得两个引物之间该基因DNA序列的方法。引物来源：已知基因序列片段获得：PCR

优点：操作容易、目的性强缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因，含内含子

第8页,共134页，2024年2月25日，星期天(3)RT-PCR法：参照已知基因序列，在该基因序列保守区域设计两个引物，用PCR反应获得两个引物之间该基因编码序列(mRNA)的方法。

引物来源：已知基因序列片段获得：RT-PCR

优点：操作容易、目的性强缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因第9页,共134页，2024年2月25日，星期天（4）基因组文库法：将基因组DNA切割成片段后，直接克隆构建成基因组文库，从基因组文库中查找有用克隆的编码序列的方法。

片段切割：识别序列为4碱基的限制性内切酶克隆载体：病毒、噬菌体、酵母人工染色体优点：能够获得未知基因，能够对基因组所有基因进行研究缺点:序列含内含子,基因通用性较差第10页,共134页，2024年2月25日，星期天第11页,共134页，2024年2月25日，星期天

（5）cDNA文库法：以生物体内mRNA合成cDNA后直接克隆构建成cDNA文库，从中查找有用基因的方法。片段来源：mRNA逆转录克隆载体：质粒载体优点：便于获得表达的基因的序列，获得得序列为编码序列无内含子，费用较低缺点：无法获得未表达或表达水平较低基因

第12页,共134页，2024年2月25日，星期天第13页,共134页，2024年2月25日，星期天（六）T-DNA标签法（七）mRNA差异显示法（八）反向克隆法第14页,共134页，2024年2月25日，星期天二、目的基因的克隆

在获得了目的基因片段后，为了便于下一步操作，常需将该片段克隆到克隆载体上，进行大量复制，并验证该片段序列是否正确。

第15页,共134页，2024年2月25日，星期天(一)克隆定义：1．克隆(名词)：通过无性繁殖形成的与其亲本一致的生物群体。2．克隆(动词)：生物的无性繁殖。3.基因克隆：将目的基因片段连接到克隆载体上并进行大量复制的过程。

第16页,共134页，2024年2月25日，星期天(二)基因克隆步骤1、目的基因片段的获得：PCR、酶切获得2、目的基因片段的分离纯化：电泳：分离回收：从胶内提取、纯化并定量。3、目的基因片段与克隆载体连接：平末端连接：平末端酶酶切获得的或粘末端经补平后的片段的连接。粘末端连接：粘末端酶酶切后获得的片段的连接。

T/A克隆：经常规PCR反应获得的片段的连接。4、目的基因片段重组克隆载体筛选验证5、目的基因片段复制第17页,共134页，2024年2月25日，星期天(三)基因重组克隆筛选

将已经连接外源基因的载体(DNA)向受体生物细胞中导入，从大量的受体中筛选出成功导入目的基因克隆载体的个体，称为重组克隆筛选。一般克隆载体的受体生物为大肠杆菌。常用的筛选方法有两种：

1、抗生素抗性筛选

2、菌落蓝、白斑筛选

第18页,共134页，2024年2月25日，星期天pUC19第19页,共134页，2024年2月25日，星期天筛选结果模式图第20页,共134页，2024年2月25日，星期天第21页,共134页，2024年2月25日，星期天(四)载体上插入基因片段的验证1、DNA酶切法

第22页,共134页，2024年2月25日，星期天2、PCR法第23页,共134页，2024年2月25日，星期天3、DNA测序法

模板+dNTP+测序引物+测序Taq酶ddATPddTTPddGTPddCTP第24页,共134页，2024年2月25日，星期天三、目的基因的表达载体构建目的基因片段经验证正确后，需构建适合于受体生物的基因表达载体。

表达载体的构建过程就是把目的基因的阅读框架(编码序列)插入适宜的表达载体(空)的启动子、终止子中间，形成表达框架。表达框架：启动子-目的基因的ORF-终止子第25页,共134页，2024年2月25日，星期天1、表达载体的作用：使该基因能够被导入新的生物体、进行自主或整合复制并在生物体中启动和表达。

一般情况下有三个串联的表达框架：-1-2-3-1、启动子-抗性基因的ORF-终止子

2、启动子-目的基因的ORF-终止子

3、启动子-报告基因的ORF-终止子第26页,共134页，2024年2月25日，星期天抗性基因：NptII：新霉素磷酸转移酶基因，抗卡那霉素

Hyg:潮霉素磷酸转移酶基因,抗潮霉素

gentR:庆大霉素抗性基因，抗庆大霉素

AmpR:氨苄青霉素抗性基因，抗青霉素类

TETR:四环素抗性基因,抗四环素报告基因：Gus:催化溴取代葡萄糖转化无色-蓝色反应

Gfp:绿色荧光蛋白，合成绿色荧光蛋白

Lac（z）:催化溴取代半乳糖无色-蓝色转化反应常用选择标记(编码基因):第27页,共134页，2024年2月25日，星期天2、生物表达系统的特异性

不同生物中，启动基因的表达需要不同的启动子，在原核生物中，需要原核生物启动子和终止子；在植物中，需要适合植物的启动子和终止子。在原核生物中，经常使用的启动子有：T3、T7和SP6启动子。在植物中，经常使用的启动子有：CaMV35S启动子，胭脂碱合成酶基因终止子。

第28页,共134页，2024年2月25日，星期天3、植物表达载体系统目前常用的植物表达载体系统有：

1、质粒载体系统：

2、病毒载体系统：第29页,共134页，2024年2月25日，星期天根癌农杆菌及其质粒第30页,共134页，2024年2月25日，星期天Ti质粒Vir:毒区，切割、转运、侵染区T-DNA区：被转移整合到植物的DNA区域LB:左边界RB：右边界第31页,共134页，2024年2月25日，星期天

把目的基因表达框架整合到改造后的Ti质粒(卸甲质粒)的T-DNA区域形成的质粒载体。所有基因转移、基因表达元件位于同一质粒上，称为一元表达载体。但这类载体构建困难，目的基因整合概率较低。改造Ti质粒：取代致瘤和不必要的基因。

1）一元载体系统（整合载体系统）第32页,共134页，2024年2月25日，星期天Ti质粒Vir:区:环化成辅助质粒T-DNA区：环化成微型Ti-质粒第33页,共134页，2024年2月25日，星期天

它由微型Ti质粒（mini-Tiplasmid）和辅助Ti质粒（helperTiplasmid）两个独立的质粒构成。辅助质粒：提供Vir基因的转移、切割、拼接功能微型Ti质粒：含有T-DNA边界、为一个广谱质粒，提供用于转移的基因表达框架。

2）双元载体系统binaryvector第34页,共134页，2024年2月25日，星期天第35页,共134页，2024年2月25日，星期天(三)构建过程

1．片段获得：酶切法

2．表达载体线性化：酶切法

3、片段分离纯化：电泳、条带回收

4．连接：基因片段和载体DNA定向连接。

第36页,共134页，2024年2月25日，星期天第37页,共134页，2024年2月25日，星期天(四)表达载体验证标记基因筛选

酶切鉴定法

PCR鉴定法DNA杂交：斑点杂交、菌落原位杂交。(五)工程菌构建

表达载体：直接转化。工程菌构建：生物介导转化。把表达载体转入介导生物中。第38页,共134页，2024年2月25日，星期天一、基因转移把外源DNA导入生物体，使生物体发生某种变化的过程称为转化(Transformation)。把一种生物的基因导入到另外一个生物体内的过程称为基因转移(genetransfer)。第四节基因工程下游技术第39页,共134页，2024年2月25日，星期天（一）植物受体系统 受体:用于接收外源基因片段的生物个体、细胞或者组织。

1、植物组织：

2、原生质体：

3、生殖细胞：

第40页,共134页，2024年2月25日，星期天1、植物组织： 受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这些病毒或质粒上的某些DNA通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成完整的转化植株。 该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。

第41页,共134页，2024年2月25日，星期天2、原生质体：原生质体是植物细胞除去细胞壁后的部分，是一个质膜包围的“裸露细胞”。原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力，具有全能性。原生质体比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作，而且还可以直接高效的捕获外源基因。嵌合体少，遗传稳定性更差，培养周期长，难度大，再生频率低。第42页,共134页，2024年2月25日，星期天3、生殖细胞：是以植物生殖细胞如：花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。目前主要以两个途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用花粉细胞和卵细胞培养，从而建立单倍体的基因转化系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化

第43页,共134页，2024年2月25日，星期天优点:

一旦将外源基因导入这些细胞，可以遗传，利用植物自身的受粉过程，具有操作方法方便、简单。缺点:

不足受到季节的限制；只能花期进行，且无性繁殖的植物不能采用。

第44页,共134页，2024年2月25日，星期天（二）直接转化法 直接将纯化的携带有外源基因的DNA导入生物体的方法。根据所采用的原理，可以分为：物理转化法、化学转化法、种质介导转化法。

第45页,共134页，2024年2月25日，星期天1.物理转化法：通过物理方法打开细胞屏障(细胞壁和细胞膜)，将外源基因直接导入生物体的方法。

(1)电激法(电穿孔法)：

(2)超声法(超声穿孔法)：

(3)热激法：

(4)显微注射法：

(5)激光法(激光穿孔法)

(6)基因枪法(微弹法)

第46页,共134页，2024年2月25日，星期天(1)电激法(电穿孔法)：细胞膜在适当的外加电压作用下，细胞膜被击穿，细胞周围的溶液中的外源DNA分子会通过这些孔洞进入细胞中。移去外加电压后，膜孔在一定时间内可以自动修复，外源基因进入细胞内后少数可能会整合到染色体上。

第47页,共134页，2024年2月25日，星期天

利用这一原理，将原生质体与外源基因混合置于电激仪的样品小室中，然后在一定的电压下进行短时间直流电脉冲，电击后的原生质体被转移至培养基中培养，根据选择标记筛选带有标记基因的转化子。

超声穿孔法、热激法、显微注射法、激光法原理与此相同第48页,共134页，2024年2月25日，星期天物理转化法步骤：1、目的基因表达载体DNA溶液配制2、受体细胞准备(原生质体制备)3、物理法导致细胞穿孔4、细胞恢复培养和筛选第49页,共134页，2024年2月25日，星期天第50页,共134页，2024年2月25日，星期天基因枪法(微弹法)第51页,共134页，2024年2月25日，星期天第52页,共134页，2024年2月25日，星期天2.化学转化法(1)聚乙二醇(PEG)法

PEG与多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等多聚物和二价阳离子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）及DNA常在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吸作用而被吸收。利用PEG诱导原生质体融合时要求原生质体具有较高的活力。第53页,共134页，2024年2月25日，星期天(2)脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过内吞作用而进入细胞。

第54页,共134页，2024年2月25日，星期天3.种质介导转化法(1)花粉管通道法是我国科学家周光宇等首次提出外源DNA导入植物的转基因技术。其基本原理是授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化还不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞第55页,共134页，2024年2月25日，星期天(2)生殖细胞浸泡法生殖细胞(种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、花药悬浮细胞培养物等)直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体并整合和遗传的方法。(3)胚囊、子房注射法使用显微注射仪把外源基因溶液注射到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生的压力和卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株。第56页,共134页，2024年2月25日，星期天（三）间接转化法(生物转化法)1.农杆菌介导法

有两种农杆菌:

根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens） 发根农杆菌(A.Rhizogenes)

被广泛用于植物转基因。原理：农杆菌在适宜条件下(酸性,酚类诱导物如乙酰丁香酮)，将其质粒T-DNA部分可以转入植物细胞并插入到植物基因组中。第57页,共134页，2024年2月25日，星期天2.病毒介导法

病毒通过膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用或细胞内吞进入宿主细胞，经反转录合成DNA并随机整合到宿主基因组中。可介导转基因的病毒:(1)双链DNA病毒

CaMV花椰菜花叶病毒

DaMV大丽花花叶病毒

CEKV石竹饰刻斑纹病毒

(2)单链DNA病毒

(3)单链RNA病毒

第58页,共134页，2024年2月25日，星期天症状第59页,共134页，2024年2月25日，星期天（四）农杆菌介导转化法A、整体植株接种共感染法1、原理与方法：该途径是模仿自然界农杆菌天然的转化过程，人为的在植株上造成创伤部位，然后把携带目的基因表达载体的农杆菌接种在创伤面上或植株体内，使农杆菌在植株内进行侵染转化，获得转化的植物细胞，因此也称为体内转化。2、受体材料：无菌苗、种子实生苗3、优点：试验周期短、具有较高的转化效率、4、缺点：嵌合体多、筛选困难第60页,共134页，2024年2月25日，星期天B、叶盘转化法

1、原理和方法：为了诱导农杆菌的侵染活性，把无菌苗叶片剪切成圆形或方形叶盘，人为地造成较大的伤口/面积比，叶盘浸蘸接种农杆菌后，与农杆菌共培养一段时间后，目的基因可经农杆菌整合到植物染色体上，经转接到脱菌培养基上除去农杆菌，经筛选后可得转化植株。

2、受体材料：无菌苗叶片。

3、优点：适用性广、重复性好缺点：部分材料叶盘再生困难。

第61页,共134页，2024年2月25日，星期天C、原生质体共培养转化法1、原理同上2、受体材料原生质体3、优点：易转化、无嵌合体4、缺点：再生困难第62页,共134页，2024年2月25日，星期天常用植物基因转化方法特点比较评价条件农杆菌PEG法电击法注射法基因枪法花粉管通道法受体材料组织、、原生质体原生质体原生质体原生质体组织、细胞卵细胞寄主范围有无无无无有性繁殖材料组培条件简单复杂复杂复杂简单不需要转化率1-10%10-5-410-5-410-3-210-3-210%~10嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求简单简单昂贵昂贵昂贵简单工作效率高低低低高低单子叶植物少可行可行可行广泛广泛第63页,共134页，2024年2月25日，星期天大麦转化示意图第64页,共134页，2024年2月25日，星期天二、转移植株筛选1、抗性筛选2、报告基因筛选3、DNA检测4、RNA检测5、蛋白质检测6、功能检测第65页,共134页，2024年2月25日，星期天第五节植物转基因改良的应用一、抗虫改良1、常用抗虫基因可分为三类:(1)细菌中分离的抗虫基因,主要是苏云金杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因;(2)植物中分离的抗虫基因,主要为蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因(Lec)等,应用最广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI);(3)从昆虫中分离的抗虫基因,主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。第66页,共134页，2024年2月25日，星期天2、杀虫原理(1)BT基因

Bt基因又称杀虫结晶蛋白(insecticidalcrystalprotein.ICP)基因,来自于苏云金芽孢杆菌,其杀虫毒性来自芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白(或δ内毒素)。原理:破坏昆虫的消化系统.这种蛋白通常以原毒素形式存在,当昆虫取食后,原毒素在消化道内被活化，破坏肠道细胞膜上的特异性结合蛋白,使细胞膜产生一些孔道。

第67页,共134页，2024年2月25日，星期天

目前常见的bt基因分为7类，共30多个小类，分别可以抗鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目害虫以及线虫，有些种类具有多种昆虫抗性。

第68页,共134页，2024年2月25日，星期天抗虫棉基因的转化过程第69页,共134页，2024年2月25日，星期天70由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性。与对照相比减少农药用量80％，并减少用工150个/hm2，以上两者可使每公顷节省1500元，Bt转基因棉种深受棉农的欢迎。第70页,共134页，2024年2月25日，星期天(2)胰蛋白酶抑制剂基因植物中存在三类蛋白酶抑制剂：

——丝氨酸蛋白酶抑制剂

——巯基蛋白酶抑制剂

——金属蛋白酶抑制剂。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂中的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)是目前研究得较为深入且应用最为广泛的基因。

第71页,共134页，2024年2月25日，星期天蛋白酶抑制剂杀虫机理:

蛋白酶抑制剂与昆虫消化道的蛋白酶相结合,形成酶-抑制剂复合物,使酶活性中心失活,从而阻断或减弱酶的水解作用,干扰昆虫对外来蛋白的正常消化,最终造成昆虫非正常发育或死亡。

第72页,共134页，2024年2月25日，星期天(3)植物凝集素基因(Lec)

植物凝集素是植物体普遍存在的一类保守性很强的非免疫性蛋白,能特异性识别并可逆地结合糖蛋白的糖基部分。

——麦胚凝集素(WGA),对欧洲玉米螟有良好的抗性。——雪莲花凝集素(GNA)对蚜虫、叶蝉、稻飞虱等同翅目吸食性害虫有极强的毒性。——豌豆外凝集素(p-Lec)能抑制豇豆象的生长。第73页,共134页，2024年2月25日，星期天

作用机理:

当昆虫取食外凝集素后,外源凝集素在昆虫消化道周围的细胞膜糖蛋白专一性结合,从而影响所有营养的吸收,达到抗虫目的。第74页,共134页，2024年2月25日，星期天(4)淀粉酶抑制剂

淀粉酶抑制剂能抑制昆虫消化道内α-淀粉酶活性,使食入的淀粉无法水解,阻断了昆虫主要能量来源；它与淀粉酶形成的酶-抑制剂复合物通过生理反馈调节作用,刺激昆虫分泌过量的消化酶,产生厌食反应。

第75页,共134页，2024年2月25日，星期天(5)昆虫毒素基因昆虫神经毒素控制着昆虫许多关键的生理过程,影响昆虫的生长、变态、生殖、代谢和行为等,近年来,人们已开始在基因工程中利用昆虫神经毒素防治害虫。目前,蝎毒素和蜘蛛毒素两种昆虫特异性神经毒素已被用于植物抗虫基因工程。

第76页,共134页，2024年2月25日，星期天

由于每一种抗虫基因都有其局限性,近年来正在研究或已应用于抗虫基因工程的基因还有胆固醇氧化酶基因、营养杀虫蛋白基因、几丁质酶基因、核糖体失活蛋白基因和异戊烯转移酶基因等。

第77页,共134页，2024年2月25日，星期天(二)抗真菌病改良1、抗真菌病基因根据植物的防卫机制和病原菌致病机理，已知的植物抗真菌病基因主要有以下两个方面：一是细胞壁结构增强基因，二是生成抗菌物质或激活抗菌物质活性的基因第一类基因目前应用较少，第二类基因已经开始大量应用。

第78页,共134页，2024年2月25日，星期天2、主要抗真菌病基因及作用机理(1)几丁质酶基因植物和微生物中几丁质酶基因编码的降解几丁质酶。几丁质是植物病原真菌的细胞壁主要成分之一，几丁质的降解可以导致病原细胞死亡，也可以诱导植物产生抗病反应。(2)β-1，3-葡聚糖酶基因

β-1，3-葡聚糖是植物病原真菌的细胞壁主要成分之一，的降解可以导致病原细胞死亡，也可以诱导植物产生抗病反应。

第79页,共134页，2024年2月25日，星期天(3)植物抗毒素基因植物产生的对病原真菌具有毒性的物质，称为植物抗毒素，编码此类物质合成酶的基因称为植物抗毒素基因。目前已从不同科属植物中鉴定了200多种，其中以类黄酮和萜烯类最多。其中的关键酶如苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)已经克隆。其中芪合成酶基因已从葡萄、花生等植物中克隆并转入烟草中获得了抗病性植株。

第80页,共134页，2024年2月25日，星期天(4)核糖体抑制蛋白基因(Ribosomeinhibitingprotein,RIP)

核糖体抑制蛋白是来源于植物能作用于其他远缘真核生物核糖体、抑制蛋白质合成的蛋白毒素。现已经从大麦中分离了RIP并在体外抑制了真菌的活性。(5)过氧化物酶基因参与苯丙烷代谢，形成木质素、植保素及细胞壁酚类物质。第81页,共134页，2024年2月25日，星期天(三)抗细菌性病害改良1、抗菌肽基因抗菌肽是一类从动物、植物中分离得到的具有抗菌活性并且同源性较高的小分子多肽。抗菌肽由30多个氨基酸擦残基组成，分子量大约为4kd，杀菌肽具有双亲性的α螺旋结构，是杀菌肽破坏膜活性的关键。杀菌肽具有光谱抗菌性，主要分为A、B、D三种形式，其中A、B特别对革兰氏阴性菌有强大的杀伤力2、溶菌酶基因溶菌酶能够溶解细菌细胞外一些多糖之间的糖苷键，导致细菌细胞缺乏支撑最后涨破。第82页,共134页，2024年2月25日，星期天3、病原菌本身抗性基因病原菌本身参与寄主识别的基因在寄主相互作用时其重要，将病原菌的这些基因转入植物中，使其表达，从而干扰病原菌的正常生理代谢，导致植物表现出抗性。第83页,共134页，2024年2月25日，星期天(四)抗病毒改良

1、CP基因病毒外壳蛋白(coatprotein,CP)基因是病毒编码外壳蛋白的基因，利用病毒外壳蛋白转基因增强植物抗病毒能力的原理是：病毒的裸露的核酸进入植物细胞后，立即被植物细胞中的CP包裹，阻止了翻译和复制。

CP抑制病毒脱壳。侵染信号识别，如发现CP则不侵染，未发现则侵染。第84页,共134页，2024年2月25日，星期天2、病毒复制酶基因病毒复制酶基因在病毒侵入植物后与植物核糖体结合后转录并表达成病毒复制酶。该基因导入植物后，可诱导植物产生病毒抗性。作用原理不明。病毒复制酶介导的抗性远远高于外壳蛋白基因介导的的抗性，即使病毒接种量很高，仍然存在抗性。第85页,共134页，2024年2月25日，星期天

3、病毒卫星RNA

病毒中在核苷酸序列外有时会出现病毒卫星RNA，他们不与核苷酸序列同源，但可以改变病毒的致病能力。优点：灵敏，缺点：不确定性，增强或减弱致病性，来源有限，重组风险、释放风险第86页,共134页，2024年2月25日，星期天4、核糖体抑制蛋白基因核糖体失活蛋白(ribosomeinactiveprotein,RIP)可以抑制病毒蛋白质生物合成，使病毒不能合成自身蛋白质。核糖体失活蛋白基因可以使植物获得广谱性病毒抗性。5、干扰素基因干扰素是脊椎动物在受病毒侵染后形成的一种小分子蛋白质，能结合在细胞膜上形成抗病毒状态。原理是干扰素可以抑制病毒与细胞膜的结合。第87页,共134页，2024年2月25日，星期天6、缺陷干扰颗粒缺陷干扰颗粒(defectiveinterfering,DI)是指那些序列与亲本病毒相似但必须依赖亲本病毒才能复制的RNA分子。它的序列与病毒同源。抗病毒原理：竞争病毒复制酶。第88页,共134页，2024年2月25日，星期天(五)抗除草剂改良1、各类除草剂的作用机理(作用的靶酶)(1)草甘膦(glyphosate)抑制芳香族氨基酸合成的关键酶：莽草酸羟基乙烯转移酶(EPSPS)活性。(2)磺酰脲(sulfonylurea)抑制支链氨基酸合成的关键酶：乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,ALS)活性。(3)草丁膦(phosphinothricin)是有机磷除草剂，抑制植物谷胱甘肽合成酶(Glutaminesynthase，GS)(4)三嗪除草剂(triazine)抑制光合系统II的Qb蛋白与质体醌的结合，阻断光合作用。(5)溴苯腈(bromoxyril)抑制光合作用系统的电子传递链。第89页,共134页，2024年2月25日，星期天2、抗除草剂转基因改良策略(1)靶蛋白过量产生：机理：产生过量靶蛋白，使抑制作用有限。举例：采用超量表达载体转基因表达EPSPS，可以抗草甘磷类除草剂(2)靶蛋白基因突变：机理：寻找对除草剂不敏感的植株并克隆其中的靶蛋白编码基因。但往往导致植物减产。举例：除草剂选择法，寻找靶酶EPSPS/ALS/Qb的突变体，进行繁殖，或者克隆其中的基因进行转基因育种。第90页,共134页，2024年2月25日，星期天(3)除草剂降解和解毒基因利用：

——乙酰辅酶A转移酶基因-草丁膦，bar:来源于链霉素的乙酰辅酶A转移酶基因——水解酶基因及其利用：腈水解酶(nitrilase)——超氧化物岐化酶：SOD第91页,共134页，2024年2月25日，星期天(六)抗寒性改良1、抗冻蛋白基因(1)来源：生物中具有降低冰点和减少冰晶生长速度的蛋白质。其中鱼类研究较多。(2)抗冻机制：抗冻蛋白可以和冰核结合，减少冰晶生长，降低溶液冰点，从而抑制结冰伤害。2、渗透调节相关基因第92页,共134页，2024年2月25日，星期天93转基因甜椒转基因辣椒可在冬季生长(以色列)

第93页,共134页，2024年2月25日，星期天(七)抗旱、抗涝改良1、脯氨酸合成酶基因

(1)大豆(P5CR)、黑麦

(2)作用机理：渗透调节2、甜菜碱合成相关酶基因

(1)相关酶：胆碱加单氧酶(CMO)、甜菜碱醛脱氢酶(BADH)(2)作用机理：渗透调节第94页,共134页，2024年2月25日，星期天3、渗调蛋白基因(1)渗调蛋白(osmotin，OSM)，植物中普遍存在(2)作用机理：渗透调节4、胚胎后期丰富蛋白(lateralembryoaboundantprotein)基因(1)植物来源：禾本科植物(2)作用机理：渗透调节5、乙醇脱氢酶基因(1)植物中普遍存在：Adh-1,Adh-2(2)耐涝作用机理：缺氧ATP合成，解毒第95页,共134页，2024年2月25日，星期天(八)耐贮性改良1、成熟激素相关基因改良:抑制乙烯产生作用(1)反义ACC合成酶(ACCsynthase)(2)反义ACC氧化酶(ACCoxidase,EthyleneformingEnzyme,EFE)(3)反义乙烯受体(Ethylenereciptor,ER)第96页,共134页，2024年2月25日，星期天反义RNA技术AnantisenseoligobindsthesensemRNAand

preventssynthesisoftheproteincodedbythatmRNA第97页,共134页，2024年2月25日，星期天2、细胞壁降解相关基因改良：抑制细胞壁降解(1)反义多聚半乳糖醛酸酶基因（PG）：(2)反义果胶裂解酶基因（PL）(3)反义果胶甲脂化酶基因（PE）(4)反义半乳糖苷酶基因(Gal)(5)反义木聚糖内基转移酶基因(XET)：(6)反义纤维素酶基因(cellulase)(7)反义聚木糖酶基因(XGase)第98页,共134页，2024年2月25日，星期天3、软化相关胞内物质代谢基因(1)反义淀粉酶基因(amylase)(2)反义脂氧合酶基因(LOX)4、抗病性相关基因(1)PGIP第99页,共134页，2024年2月25日，星期天(九)品质改良1、营养成分改良(1)贮藏蛋白：小麦醇溶蛋白基因：增加新蛋白质(2)脂肪改良：LOX基因：脂肪酸饱和度改变2、风味改良(3)甜味蛋白：来源于甜玉米，改变风味３、外观品质改良(4)着色度改良：色素基因工程：花色素第100页,共134页，2024年2月25日，星期天101转基因西红柿散发柠檬香味和玫瑰芳香的转基因西红柿第101页,共134页，2024年2月25日，星期天102无子的转基因茄子(意大利)

第102页,共134页，2024年2月25日，星期天103第103页,共134页，2024年2月25日，星期天(十)丰产性改良1、RuBP羧化酶Rubisco基因改良：提高二氧化碳的羧化效率，提高光合，进而提高产量2、磷酸烯醇式丙酮酸异构化酶PEPCase基因改良：提高二氧化碳羧化效率，进而提高光合、产量3、磷酸蔗糖合成酶基因改良：促进光合产物运输，减少反馈抑制4、ADPG焦磷酸酶基因改良：促进运输，减少反馈抑制第104页,共134页，2024年2月25日，星期天(十一)早实性改良１、lfy基因：缩短童期(植物不能开花结果的阶段)(十二)农艺性状改良１、矮化性状：矮化基因(dw)２、柱形性状：柱形基因(co)３、短枝性状：短枝基因(sp)４、生根能力：生根基因(rol)第105页,共134页，2024年2月25日，星期天第七节植物性状分子标记及应用一、植物的性状标记二、植物性状的分子标记三、植物性状分子标记的方法四、植物性状分子标记的应用

第106页,共134页，2024年2月25日，星期天一、植物的性状标记

植物的某些遗传性状和植物的某一外在形态特征、生理生化指标、生物大分子特征等存在对应关系。 当这个特征与这个遗传性状存在较严格的遗传连锁关系时，这个特征就是该性状的遗传标记。第107页,共134页，2024年2月25日，星期天早熟晚熟绿叶红叶红叶是早熟性状的标记第108页,共134页，2024年2月25日，星期天标记分类：1、形态标记：如针叶，气孔小抗旱性状的标记2、生理生化标记：含水量、含糖量3、分子标记：与性状相关的生物大分子有无 同工酶标记：与性状相关的同工酶的有无

DNA标记：有无某个特定的DNA片段或序列第109页,共134页，2024年2月25日，星期天二、植物的分子标记

(一)概念

广义的分子标记(molecularmarker)是指可遗传的与生物的表性性状连锁的可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括:

种子贮藏蛋白 同工酶:催化同一反应的不同的酶分子.

狭义的分子标记概念只是指DNA标记。

第110页,共134页，2024年2月25日，星期天(二)DNA分子标记的优点

DNA分子标记有其独特的优势:1、直接检测DNA分子,无表型效应,不受组织类别、发育阶段、环境条件等的影响;2、多态性强;3、源于基因组DNA自身的突变,因而数量极多;4、与不良性状无必然的连锁遗传,不影响目标性状的表达;

第111页,共134页，2024年2月25日，星期天（三）植物分子标记的种类

1、限制性片段长度多态性标记

(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP),2、随机扩增多态性DNA标记

(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD),3、DNA指纹标记

DNAFingerprint,DNF4、简单重复序列标记

(simplesequencerepeat,SSR),5、序列特异性扩增区域标记

(sequencecharacterizedamplifiedregion,SCAR),6、扩增片段长度多态性标记

(amplifiedfragmentlengthpolymorphicDNA,AFLP),.

第112页,共134页，2024年2月25日，星期天三、植物性状分子标记方法(一)酶切基础上的分子标记

1、限制性片段长度多态性标记，RFLPRFLP标记获得的原理是用DNA限制性内切酶比较具有相对性状的两个群体在DNA序列上的不同。这个不同表现为酶切后形成DNA片段的大小不同。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变、DNA的重组如插入和缺失等均可导致RFLP标记的产生。

第113页,共134页，2024年2月25日，星期天

此技术及其从中发展出来的一些变型均包括以下基本步骤：

1、DNA的提取

2、用限制性内切酶酶切DNA3、用凝胶电泳分开DNA片段

4、查找特异的与目的性状共分离的DNA片段

5、在分离群体中验证片段与性状之间的遗传距离。

第114页,共134页，2024年2月25日，星期天RFLPR.E.allelesagarosegelAaalleles第115页,共134页，2024年2月25日，星期天(二)以PCR为基础的分子标记

1、随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)

以随机引物对两个相对性状的基因组DNA进行PCR扫描，差别通过PCR产物条带的不同(多态性)体现出来,该多态性条带与目的性状存在连锁关系时,该条带为该性状的RAPD标记。第116页,共134页，2024年2月25日，星期天RAPD第117页,共134页，2024年2月25日，星期天

对于任一特定的引物，它在DNA两条链上有特定的结合位点，如果这些特定的结合位点的分布符合PCR反应的条件，且引物的3‘-端相距在一定的长度范围之内，就可以扩增出来DNA片段。如果基因组