酶学及酶工程

关于酶学及酶工程第二章酶的结构与功能第三节酶的活性部位及催化机理第2页,共33页，2024年2月25日，星期天一、酶的活性部位模型假说1.锁钥模型假说锁钥模型假说提出了酶作为生物催化剂有一个重要特点，即实现催化的必要条件是底物必须在酶上特异性结合。酶上存在特定的结合部位，结合部位与底物之间存在互补的特点，就像锁和钥匙的关系，因而造成酶催化反应的很强的专一性。结合部位是酶的活性中心的组成部分。第3页,共33页，2024年2月25日，星期天底物在活性部位的结合力底物和结合部位有形状的配合，使底物的原子与结合部位的原子有尽可能多的接近到范德华半径内。除范德华力，稳定底物结合的力还有离子间引力、氢键和疏水作用，侧链、辅基和底物之间存在相应的配合。按锁钥模型假说，酶的活性中心空间结构是刚性的。第4页,共33页，2024年2月25日，星期天2.诱导契合模型假说后来的研究发现自由酶的活性部位和底物间并不精确地像锁钥匙一般配合，从而提出了诱导契合模型假说。该假说认为，酶与底物结合时，结合力促使酶和底物分别发生一些构象的变化，从而更有利于催化反应的发生。构象变化使活性部位和底物达到精确配合，结合更紧密，并使催化基团处于更有利于催化的位置上。底物形变造成应力状态会使发生反应的键变弱，降低反应的活化自由能，使反应速度增加。形变所需的能量则是由结合能提供的。

第5页,共33页，2024年2月25日，星期天诱导契合示意图底物诱导酶活性部位发生形变，反作用力使底物也相应形变，达到底物和活性部位完全契合。诱导契合模型是目前酶学界的主流认识。第6页,共33页，2024年2月25日，星期天诱导契合—锁钥新模型探索蚯蚓蛋白酶I有三种蛋白酶活性：凝血酶Th，胰凝乳蛋白酶Ch，尿激酶U。发现该酶作用Th或Ch底物后，U活性下降。但与U底物作用后不影响Th和Ch活性。而Th和Ch底物刚性，U底物相对柔性。——R.Panetal.JBC,2010；第7页,共33页，2024年2月25日，星期天该酶活性部位含有荧光基团。测定表明该酶与Th或Ch底物结合后内源荧光有较大变化，但和U底物结合后变化不大。用低浓度胍扰动该酶活性部位也造成荧光变化，但结合过Th或Ch底物后再用胍扰动荧光变化不大了。用蚯蚓蛋白酶II、枯草杆菌蛋白酶、乳酸脱氢酶也能得到类似的结果。表明这些酶活性部位有较大构象变化后会维持该构象,再作用按锁钥模型,形成先诱导契合再锁钥的机制。有无普遍性还需证明。——张子健，博士论文，2013第8页,共33页，2024年2月25日，星期天二、活性部位的催化理论1.活性部位的组成按功能，酶的活性部位包含底物结合部位和催化基团两部分。底物在酶上的结合可有效地降低反应所需的自由能，是酶反应的必要基础。降低反应自由能的因素包括邻近效应，定向效应和形变效应。

催化基团实施具体的催化反应。如酸碱催化，共价催化。第9页,共33页，2024年2月25日，星期天活性部位的组成成分形成活性部位的组成成分包括主链结构，侧链基团和辅基。主链形成活性部位的基础形状。侧链基团完成活性部位的构成，是活性部位的主要成分。很多酶还包含金属或有机辅基，它们虽不是肽链的一部分，但紧密结合在酶分子中，并实际参与了活性部位的形成，有的是结合部位的一部分，有的本身是催化基团，还有的能够传递中间产物。第10页,共33页，2024年2月25日，星期天2.酶催化的热力学原理过渡态和活化能化学反应通过过渡态完成，形成过渡态需要活化自由能。酶促进过渡态形成，并和过渡态结合更紧密。因此过渡态类似物往往是优良的专一性抑制剂。第11页,共33页，2024年2月25日，星期天活化自由能非催化反应的活化能高，反应不易进行，速度慢。与酶结合成复合物时底物变为过渡态，结合能提供了所需的活化能。由复合物进行反应所需要的活化能就少了。酶的催化功能主要是由于降低了反应活化能，从而提高了反应速度。k=(kbT/h)e–ΔG/RT第12页,共33页，2024年2月25日，星期天酶降低活化自由能的方式

ΔG=ΔH–TΔS1）熵因素：底物结合于酶使其自由度减少，ΔS是负值而增加系统自由能，据计算常温下反应所需活化自由能约一半是熵因素贡献的。底物在酶上结合时，存在临近效应和定向效应，使系统自由度减少，因此形成复合物时熵减少。活化自由能中的熵因素在此效应中实现，其后进行反应时所需的活化自由能就减少了。第13页,共33页，2024年2月25日，星期天邻近效应和定向效应

底物之间及底物对活性部位的邻近和定向增加了有序性，减小了自由度，从而降低了系统的熵，而增加了系统的自由能。双分子反应两个底物在结合部位定向结合并彼此靠近，比溶液中发生反应的可能性高得多，相当于大大提高了反应物浓度。所有酶反应底物和酶之间都有反应所需的相互作用，定向和邻近使反应加快。底物结合时墒减少所需要的自由能由底物结合时放能提供。第14页,共33页，2024年2月25日，星期天结合能第15页,共33页，2024年2月25日，星期天邻近效应和定向效应例子羧基和酯基间可反应生成酸酐。二羧酸单苯酯的的反应比双分子羧酸和酯的反应速度快得多，表现了邻近效应和定向效应。第16页,共33页，2024年2月25日，星期天而羧基和酯之间自由度越少，邻近效应和定向效应越强，反应速度越快。

作用物反应速度第17页,共33页，2024年2月25日，星期天2）焓因素：形变效应诱导契合使底物在活性部位结合时出现形变，造成底物分子内应力，相关键变弱。对于磷酸酯水解反应，有形变应力的环状磷酸酯水解比无应力的开环磷酸酯快108倍，表现了底物形变对反应速度的影响。第18页,共33页，2024年2月25日，星期天形变效应热力学键的形变需要吸收一定能量ΔH，自由能增加。所需能量也由底物在酶上的结合能提供。其后进行反应时所需的活化自由能就减少了，这使反应速度加快。第19页,共33页，2024年2月25日，星期天三、酶催化的化学机制1.酸碱催化：酸催化第20页,共33页，2024年2月25日，星期天碱催化酸碱催化的特点是由广义酸或碱（质子提供者或接受者）启动，催化反应通过质子和电子的转移而实现。酸碱催化可使反应速度提高2到5个数量级。第21页,共33页，2024年2月25日，星期天酶分子中的质子供体和受体

质子供体质子受体

-COOH-COO--NH3+-NH2-SH-S--OH-O-第22页,共33页，2024年2月25日，星期天2.共价催化催化反应中，酶的催化基团和底物形成临时共价键，使底物被激活为中间态，进而实现被催化的反应而生成产物，同时酶恢复游离态：这种催化机制称为共价催化。共价催化包括亲核催化和亲电催化。第23页,共33页，2024年2月25日，星期天亲核催化和亲电催化如酶分子富含可提供公用电子对的亲核基团，如氨基、巯基、羟基、咪唑基等，其提供电子对给带部分正电的底物而形成临时共价键，这种催化作用就是亲核催化。由于酶的侧链基团大多是亲核的，亲核催化是共价催化中的主要形式。如酶分子含有缺少电子的亲电基团，与富含未公用电子对的底物形成临时共价键而完成催化反应的称为亲电催化。第24页,共33页，2024年2月25日，星期天亲核催化例第25页,共33页，2024年2月25日，星期天四、酶的辅因子很多酶有辅因子，包括和酶牢固结合的辅基以及不牢固结合的辅酶。辅因子包括金属辅因子和有机辅因子两类。最常见的辅酶包括NAD，NADP，CoA，核苷二磷酸或三磷酸和磷酸吡哆醛等，可以把它们归于底物一类中。而辅基则可以看做是酶的一部分，一般均结合在活性中心，成为活性中心的组成部分。第26页,共33页，2024年2月25日，星期天1.金属辅因子已知酶中大约有三分之一以上需要金属离子。含金属辅基的称为金属酶。有些酶和金属离子结合不紧密，纯化时失去金属离子，但需加入金属离子才有活性，称为金属激活酶。此时金属离子应是金属辅酶。

金属离子参与酶的催化作用的方式有多种：1）接受或提供电子，或做为亲电剂或亲核剂,或激活亲电剂或亲核剂；2）通过配位键结合底物，并引起底物形变；3）保持反应基团的三维取向，稳定酶活性部位于活性构象。第27页,共33页，2024年2月25日，星期天过渡金属酶

过渡金属酶往往通过多配价键结合，结合很紧密，一般形成金属酶。较多见的金属离子包括锌、铜、钼、铁、钴等。羧肽酶A是一个典型含锌金属酶。活性中心有一个含锌而结合C末端的疏水口袋。

第28页,共33页，2024年2月25日，星期天羧肽酶AZn2＋位于该酶活性中心，和His69，Glu72，His196以及水以配位键结合。底物C末端与Arg145侧键通过静电吸引，使底物定位。Zn2＋通过吸电子作用促进肽键水解。

第29页,共33页，2024年2月25日，星期天2.有机辅基

生物素可共价结合羧基。它通过酰胺键和蛋白质的赖氨酸侧链氨基结合，形成生物素羧基载体蛋白。（BCCP）第30页,共33页，2024年2月25日，星期天乙酰辅酶A羧化酶因BCCP能和羧基键合，在羧化反应中起重