限进性纳米粒子薄膜卷柱固相萃取联合高效液相色谱测定大鼠血浆中去氢吴茱萸碱和柠檬苦素

限进性纳米粒子薄膜卷柱固相萃取联合高效液相色谱测定大鼠血浆中去氢吴茱萸碱和柠檬苦素【摘要】目的：建立一种限进性固相萃取联合高效液相色谱快速、准确地测定大鼠血浆中去氢吴茱萸碱和柠檬苦素含量的新方法。方法：本实验利用课题组前期制备的限进性纳米粒子薄膜卷柱对大鼠血浆进行前处理，萃取并富集血样中的去氢吴茱萸碱和柠檬苦素，后续采用HPLC-UV进行检测。色谱条件：WondasilC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：0.1%磷酸-水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）；采用梯度洗脱，时间程序：0~15min：68~28%（A），17~37%（B），15~35%（C）），15~25min：维持28%（A）、37%（B）、35%（C）不变；进样量20μL，流速1.0mL/min，检测波长：去氢吴茱萸碱366nm，柠檬苦素208nm。结果：去氢吴茱萸碱标准曲线为A=99.304c+3.356，相关系数R=0.9992，线性范围：0.118~11.8μg/mL。柠檬苦素标准曲线为A=5.8048c+0.6346，相关系数R=0.9991，线性范围：0.114~11.4μg/mL。采用2个浓度水平（1和5μg/mL）的混合血浆工作液为样品进行方法学验证。去氢吴茱萸碱日内浓度测定值RSD5.99~6.93%，相对回收率89.4~100%，面积绝对回收率78.3~88.0%；日间浓度测定值RSD1.95~3.69%，浓度相对回收率90.8~94.7%，面积绝对回收率85.8~91.7%。柠檬苦素日内浓度测定值RSD2.78~14.4%，浓度相对回收率76.5~84.8%，面积绝对回收率57.6-75.5%；日间浓度测定值RSD11.3~11.6%，浓度相对回收率64.8~76.8%，面积绝对回收率67.0~87.2%。【关键词】限进性纳米粒子；薄膜卷柱；固相萃取；高效液相色谱；血浆；去氢吴茱萸碱和柠檬苦素

DeterminationofDehydroevodiamineandLimonininRatPlasmabyRestrictedNanoparticleFilmRollColumnSolidPhaseExtractionCombinedwithHPLC[Abstract]Objective:Toestablishanewmethodforrapidandaccuratedeterminationofdehydroevodiamineandlimonininratplasmabyrestrictedsolidphaseextractioncombinedwithhighperformanceliquidchromatography.Methods:Inthiswork,weusedthelimitednanoparticlefilmcoilcolumnpreparedbyourresearchgrouptopretreatratplasma,extractingandenrichingdehydroevodiamineandlimoninfromplasmasamples,followedbyHPLC-UVanalysisoftheobtainedextracts.Chromatographicconditions:WondasilC18column(4.6mm×250mm,5μm);mobilephase:0.1%phosphoricacid-water(A),methanol(B),acetonitrile(C);thegradientelutionprocedure:0-12min:68~28%(A),17~37%(B),15~35%(C)),15~25min:maintaining28%(A),37%(B),35%(C);theinjectionvolumewas20μL,v=1.0mL/min,λ=366nm(dehydroevodiamine)and208nm(limonin).Results：ThecalibrationcurvewasdetectedfordehydroevodiamineasA=99.304c+3.356(R=0.9992)withagoodlinearrelationshipovertherangeof0.118~11.84μg/ml.ThecalibrationcurveoflimoninwasdetectedasA=5.8048c+0.6346(R=0.9991)withagoodlinearrelationshipovertherangeof0.114~11.4μg/mL.Theconstructedmethodswerevalidatedbydetectingthecombinedplasmaworkingsolutionsattwolevelsresults(1and5μg/mL).Fordehydroevodiamine,theintradayandinter-dayconcentrationrelativerecoveryrateswereseparatelydetectedas89.4~100%(RSD5.99~6.93%)and90.8~94.7%(RSD1.95~3.69%),withtheareaabsoluterecoveryratesdetectedseparatelyas78.3~88.0%and85.8~91.7%.Forlimonin,theintradayandinter-dayconcentrationrelativerecoveryrateswereseparatelydetectedas76.5~84.8%(RSD2.78~14.4%)and76.5~84.8%(RSD11.3~11.6%),withtheareaabsoluterecoveryratesdetectedseparatelyas57.6-75.5%and67.0~87.2%.[Keywords]RestrictivenanoparticlesThinfilmrollcolumnSolidphaseextractionHighperformanceliquidchromatographyPlasmaDehydroevodiamineandlimonin

目录1前言 前言吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodiarutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吴茱萸Euodiarutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果实[1]。主产于贵州、湖南、云南、四川等地。《本草纲目》中记载，吴茱萸能解郁郁结，治酸饮，厥阴痰饮头痛，阴道腹痛，疝气，血痢，口腔疮疡。2020年版《中国药典》中记载：吴茱萸性味辛、苦，热；有小毒。吴茱萸归肝、脾、胃、肾经。可散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻；用于厥阴头痛，寒疝腹痛，寒湿脚气，脘腹胀痛，呕吐吞酸，五更泄泻等症。现代药理表明，吴茱萸可镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗氧化，对心血管系统、中枢神经系统、消化系统、生殖系统等均具有生理活性[2]。吴茱萸主要含有挥发油、生物碱、黄酮、苦味素等活性成分。研究表明，生物碱是其主要有效成分，包括去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱等[3]，具有抗肿瘤、保护心血管系统、保护神经、抗炎、抗菌等多种药理作用[4]。苦味素也是吴茱萸的主要活性成分之一，包括吴茱萸苦素、柠檬苦素等，具有抗肿瘤、保肝、镇痛、抗菌、抗炎、神经保护等作用[6]。去氢吴茱萸碱作为吴茱萸中的主要活性成分之一，具有扩张血管的作用，能抑制胆碱酯酶活性，抑制干扰素(IFN)和脂多糖(LPS)诱导的大鼠巨噬细胞NO的产生，麻醉小鼠血压[7]。去氢吴茱萸碱对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠的空间记忆和tau蛋白磷酸化有预防作用，其机理可能是脑组织海马内β淀粉样肽的生成和机体抗氧化作用的增强[8,9]；且其可改善阿尔茨海默症模型小鼠的记忆障碍和应激引起的认知障碍，被认为是改善阿尔茨海默症的候选化合物之一[10]，具有一定的开发应用前景。柠檬苦素是一类具有独特结构的高度氧化的四降三萜类化合物，具有广泛的药理作用，包括抗癌、抗炎镇痛、抗菌抗病毒、抗氧化、保肝等特性。药理学研究表明，吴茱萸中的生物碱成分可导致肝损伤[5]，这可能是吴茱萸药材具有小毒的原因之一。此外，柠檬苦素也被证实一定程度上会导致肝毒性、肾毒性和遗传损伤，其对肝脏代谢酶有复杂的影响[11]。因此，建立一种高效便捷的分析方法快速、准确检测血浆中去氢吴茱萸碱和柠檬苦素的含量，有利于对两者的吸收代谢过程及作用机制进行深入研究，对后续临床药理研究、临床治疗药物监测等均具有重要意义和价值。1.1去氢吴茱萸碱和柠檬苦素的检测方法目前，已报道的有关吴茱萸活性成分检测的分析方法以液相色谱法为主。借助色谱强大的分离功能，能够实现多个中药有效成分的分离与分析，故液相色谱法已经成为中药材多组分分析、以及体内中药多组分同时分析的首选工具。1.1.1高效液相色谱法(HPLC-UV)HPLC系统中，流动相携带着样品溶液在高压输液泵作用下被泵入装有固定相的色谱柱内。在柱管内，利用样品中各个组分在固液两相间作用力的不同形成差速迁移，从而实现柱内各组分分离后可以分别进入检测器进行检测。高效液相色谱法具有流速快、检测器检测灵敏度高、分离功能强大等诸多优点，尤其适用于复杂组分样品的检测。是目前药物分析最常用的检测手段。张敏[12]等通过优化HPLC条件，建立一种去氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸碱以及吴茱萸新碱同时测定的方法，并对其进行系统验证，从而为吴茱萸质量标准的改良研究提供初步的研究依据，并为吴茱萸及其饮片的防治提供可靠信息。1.1.2液质联用法（HPLC-MS）HPLC-MS采用液相色谱为分离系统，质谱作为检测系统。样品在质谱仪中与流动相分离，电离后，离子碎片经质谱的质量分析器按质量数分开，通过检测器得到质谱图。与通常的HPLC仪器不同，液相色谱-质谱联用则是采用质谱替代紫外检测。由于质谱的检测灵敏度通常远高于紫外检测器，因而HPLC-MS具有远比HPLC-UV更低的检测限。此外，质谱技术的不断发展，利用质谱分析数据可以获得很多的有关待测组分的碎片信息和分子离子峰信息，因而液质联用仪频繁用于目标成分的定性分析。HPLC-MS体现了色谱和质谱的优势互补，它结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度，以及能够提供相对分子和结构信息等优点。被广泛应用在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域。杨雁芳[13]等建立了大鼠脑脊液和脑组织中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和去氢吴茱萸碱同时测定的HPLC-MS方法。测定结果表明，三个生物碱成分均能快速吸收进入脑脊液并分布到脑组织，并能快速清除，吴茱萸碱在脑干和小脑分布最多，而吴茱萸次碱和去氢吴茱萸碱分别在脑干、小脑和海马分布最多。UHPLC-MS是一种利用液相色谱作为质谱仪分离复杂化学成分的进样系统，使复杂的化学组分得到分离；利用质谱作为检测器进行定量和定性分析。一级质谱有时会受到仪器分辨率的影响，给定的质荷比不能准确定性，对于相同分子量的不同分子，当仪器分辨率不够高时，很难区分它们。而二次质谱可以看到目标物体的一些碎片，并可以分析其结构，可以在一定程度上降低噪声，提高信噪比，提高灵敏度，从而节省预处理步骤，提高结果的准确性。UHPLC-MS结合了HPLC的高效分离能力和MS的高灵敏度、强特异性，该分离检测技术具有应用范围广、分离能力强、灵敏度高、速度快、自动化程度高等特点。目前已成为有机物，特别是药物分析的重要方法之一。赵文燕[14]等建立了一种能高效、快速测定去氢吴茱萸碱和柠檬苦素等含量的方法，且重复性好，特异性强，灵敏度高，经过多元统计集成，能有效区分吴茱萸粗品和不同的炮制品，为吴茱萸不同饮片的鉴别和质量分析提供了一定的科学参考。程宇欣[15]等用该方法对吴茱萸水提物中生物碱，柠檬苦素等27种化合物给药后，对大鼠体内原成分及其代谢产物进行了定性分析。研究对吴茱萸水提物中各种成分的体内代谢情况有了初步的了解，为进一步阐明吴茱萸中的有效物质奠定了基础。1.2生物样品前处理的方法生物样品通常需要进行前处理后方可进行后续色谱检测。前处理的目的就是在不破坏目标成分的前提下，用适当的方法提取、浓缩样品中的目标成分，同时尽可能除去基质等杂质成分，以减少其对色谱分析的干扰，保证检测的灵敏度、准确性和可靠性。经过多年来的发展，血样前处理的技术得到了极大的提升。目前常用的血样前处理技术有蛋白沉淀法、液-液萃取法、固相萃取法等。以下着重介绍当前常用血样前处理方法的特点及其技术现状。1.2.1液-液萃取法（LLE）液-液萃取法的原理是利用样品中不同组分在两种不混溶溶剂中溶解度的差异，来达到分离、提取或者纯化的目的。例如，以苯为溶剂从煤焦油中分离苯酚，以异丙醚为溶剂从稀乙酸溶液中回收乙酸等。其优点是应用范围广，技术成熟，处理样品量较大。但其缺点也很明显，主要有：操作繁琐，耗时长，不易实现自动化，消耗大量有机溶剂，在提取脏水样品时会发生乳化或沉淀现象，萃取多个目标组分时不能确保萃取剂对所有组分都有理想的萃取效率。孙习鹏[16]等测定大鼠血浆及组织中多柔比星含量时，为了降低有机试剂的毒性和用量，将血浆与内标样品混合，逐步加入乙醇和二氯甲烷涡旋混匀方式进行血浆样品前处理，利用高效液相法测定多柔比星的药物浓度。1.2.2蛋白沉淀法（PPT）蛋白沉淀法的原理是利用溶剂降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出。然后高速离心，使蛋白质沉积于底部，待测组分则聚集于上清液中。蛋白沉淀的最主要的优势就是操作简便、成本低、易于实施。但是此方法主要是针对蛋白基质成分的去除，其它内源性杂质并没有去除掉，而且在得到的上清液中依然会残留大量蛋白微粒，多次进样检测后可能会沉积于色谱柱表面，从而影响其使用寿命。郭志磊[17]等利用高效液相色谱法测定万古霉素血药浓度时，血样与内标样品混合液中加入甲醇涡旋振荡，以此方式进行样品前处理。1.2.3固相萃取法（SPE）SPE通过细颗粒细小的多孔固相吸附剂定量吸附样品中的分析物，用另一种体积较小的溶剂洗脱，或用热解吸来解吸分析物，达到分离富集分析物的目的。鉴于当前绝大多数药物成分都有较强疏水性，SPE目前主要是采用疏水性萃取材料，故需要沉淀蛋白后才能进行上样萃取。其优点是便于收集组分进行无相分离操作，可处理体积小的样品，但含有胶体或固体小颗粒的复杂样品会堵塞固定相的微孔结构，造成色谱柱的损失；使穿透容量和体积固定相的萃取回收率的降低以及固定相的选择性不高。杨培[18]等采用甲醇活化后的C18固相萃取柱测定血样中芍药苷和栀子苷的药物浓度，避免了磷脂对样品的干扰。1.2.4限进性固相萃取法（RAM-SPE）限进固相萃取（RAM-SPE）材料与SPE材料的不同之处在于，RAM-SPE材料的外表面除了吸附目标化合物所用的官能团外，还通过亲水性修饰，具有阻断和干扰大分子的功能，可以防止大分子蛋白质的非特异性吸附，避免SPE萃取材料因蛋白质吸附而带来的萃取效率降低的问题。同时，疏水性目标药物分子可以渗透穿过外部的亲水限进功能层进入底层与疏水功能集团发生相互作用，从而保留在SPE萃取材料表面。因此，采用RAM直接处理血浆样品，不仅简化了血样的预处理步骤，节省了时间，还提高了提取回收率。Oliveira[19]等制备了一种新型具有限进功能的分子印迹聚合物材料，用于萃取人尿液中的雌激素。陈佩纯[20]、周经纬[21]等基于实现直接、便捷、高效的大鼠血浆样品前处理的目标,开展了新型表面限进性(RA)固相萃取(SPE)薄膜卷微柱材料的制备研究，用于直接萃取血样中的甘草黄酮类、马钱子生物碱等中药活性成分。Melissa[22]等通过RAM材料解决了当使用C18固相萃取从蛋白质中分离MHC肽时,高度疏水的肽在样品制备过程中丢失的问题。1.3研究思路目前，有关去氢吴茱萸碱和柠檬苦素的血样分析的研究文献中，血样前处理方法主要为液液萃取法[23,24]、蛋白沉淀[25,26]等，这些方法不仅需要大量有机试剂，而且还会导致样品的损失与污染。分析基质复杂的生物样品如唾液、尿液、血浆、血清等需要快速、精确、稳定的前处理方法。所以，本实验研究拟采用限进性固相萃取方法，可直接、快速处理血浆样品，得到“清洁”的色谱供试样品进色谱检测。据此建立RAM-HPLC方法，快速准确分析大鼠血浆样品中的去氢吴茱萸碱和柠檬苦素。RAM材料采用指导老师课题组制备的限进性功能化纳米粒子修饰的薄膜卷柱。纳米颗粒材料粒径小，表面积大，可有效增加萃取柱的比表面积，提高提取富集效率。薄膜卷柱至于1mL聚丙烯医用注射器内，手动抽吸、排液完成上样、淋洗、洗脱操作。本论文实验研究建立的RAM-HPLC分析方法有望应用其它中药活性成分的体内分析，未来可作为相关（临床）药理、临床治疗药物监测、新药开发研究提供有效分析工具。

2材料与方法2.1仪器与试剂本实验研究所用到的仪器与试剂材料分别见表2-1和表2-2。表2-1仪器仪器型号高效液相色谱仪色谱柱液相进样针电子天平氮吹仪台式高速小型离心机超声波清洗器斡旋震荡仪1mL医用注射器Agilent1200SeriesWondasilC18，4.6mm×250mm，5μm迪马公司，710SNR，100μL日本岛津，AUW220D型北京优晟联合科技有限公司，UGC-12T大龙兴创实验仪器（北京）有限公司，D2012plus昆山市超声仪器有限公司，KQ3200型MX-S浙江欧健医用器械有限公司表2-2试剂与材料试剂与材料规格去氢吴茱萸碱标准品柠檬苦素标准品甲醇乙腈磷酸纯净水甲酸乙酸乙酯磷酸氢二钠磷酸二氢钠限进性薄膜卷柱成都瑞芬思生物科技有限公司成都瑞芬思生物科技有限公司AR，天津市科密欧化学试剂有限公司GR，默克公司AR，天津市大茂化学试剂厂屈臣氏AR，广州牌化学试剂AR，广州牌化学试剂AR，天津市科密欧化学试剂有限公司AR，天津市科密欧化学试剂有限公司课题组制备2.2HPLC条件色谱柱：WondasilC18，4.6mm×250mm，5μm；流动相组成：0.1%磷酸-水（A），甲醇（B），乙腈（C）；梯度洗脱程序：0～15min：68%-28%（A），17%-37%（B），15%-35%（C））；15～25min：维持28%（A）、37%（B）、35%（C）不变；柱温：室温，进样体积：20μL，流速：1.0mL/min，检测波长：去氢吴茱萸碱366nm，柠檬苦素208nm。2.3溶液配制2.3.1混合标准品储备液的配制称取标准品去氢吴茱萸碱（DHE）2.96mg、吴茱萸碱（EVO）2.82mg、柠檬苦素（LIM）2.85mg、吴茱萸次碱（RUT）2.34mg一起装入5mL容量瓶中，用甲醇定容，得整体浓度为500μg/mL水平的混合标准品储备液。各成分实际浓度如表2-3所示：表2-3混合标准品储备液各成分浓度成分浓度（μg/mL）去氢吴茱萸碱（DHE）柠檬苦素（LIM）吴茱萸碱（EVO）吴茱萸次碱（RUT）5925705644682.3.2混合标准品工作液的配制取一定体积500μg/mL浓度水平混标储备液，用甲醇稀释到200μg/mL浓度水平混标工作液（DHE：237g/mL，LIM：228μg/mL）作为中间混标储备液。由此中间混标工作液分别用一定量甲醇按比例稀释，可得到一系列混标工作液。对应实际浓度如表2-4：表2-4混标工作液成分实际浓度（单位：μg/mL）混标浓度水平DHELIM1004020105511847.423.711.85.922.371.180.5920.1180.059211445.622.811.45.702.281.140.5700.1140.05702.3.3混合标准品血浆工作液的配制取50μL40μg/mL浓度水平的混标液，加入150μL血浆，得10μg/mL（DHE11.8μg/mL、LIM11.4μg/mL）血浆工作液。按照相同方法，分别配制以下不同浓度水平的血浆工作液：5μg/mL（DHE：5.92μg/mL、LIM：5.70μg/mL、EVO：5.64μg/mL、RUT：4.68μg/mL）,1μg/mL（DHE：1.18μg/mL、LIM：1.14μg/mL、EVO：1.13μg/mL、RUT：0.936μg/mL），0.5μg/mL（DHE：0.592μg/mL、LIM：0.570μg/mL、EVO：0.564μg/mL、RUT：0.468μg/mL），0.1μg/mL（DHE：0.118μg/mL、LIM：0.114μg/mL、EVO：0.113μg/mL、RUT：0.0936μg/mL）。2.3.4磷酸缓冲盐溶液（PBS）的配制称取一定量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠分别于50mL容量瓶中，纯水定容至刻度，得10mmol/L对应溶液。取一定量磷酸氢二钠置于烧杯，在搅拌状态下缓慢加入磷酸二氢钠，直至pH计显示溶液pH为4.0，同法可配制系列pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。2.4最佳固相萃取操作步骤将课题组制备的RAM薄膜材料卷成小柱，置于1mL注射器中，组装成RAM-SPE装置，标准溶液/血浆工作液置于EP管中，手动控制柱塞抽吸、排液完成SPE操作。经过实验优化后得到的最佳SPE操作条件如下：活化：1×1000μL甲醇，1×1000μL纯水，1×1000μLPBSpH=7，分别抽吸5次上样：200μL血浆工作液+400μLPBSpH=7，抽吸10次淋洗：1×1000μL纯水，抽吸5次洗脱：2×500μL0.5%氨水-甲醇:乙酸乙酯=1:1，分别抽吸7次用课题组制备的RAM薄膜卷柱置于1mL一次性医用注射器中，组装成便捷SPE装置。将SPE装置针尖置于不同溶液中，进行抽吸排液操作，依次完成上述各操作步骤，将最终的洗脱液合并，室温下用氮气吹干，然后用200μL甲醇复溶，斡旋混匀，得到色谱供试品，取20μL进样进行HPLC检测。2.5SPE操作条件评价指标用洗脱回收率ω回收（%）评价SPE操作条件的好坏。其计算公式如下：ω回收(%)=A（2-4-1）其中，A萃取为洗脱液吹干、复溶后得到的色谱供试品检测的峰面积，A标为等浓度标准品色谱峰面积。2.6精密度与准确度评价指标配制低浓度1.0μg/mL（DHE：1.18μg/mL，LIM：1.14μg/mL）、高浓度5.0μg/mL（DHE：5.92μg/mL，LIM：5.70μg/mL）水平的血浆工作液作为上样液，经SPE操作后进行HPLC检测，记录DHE、LIM峰面积。同一天内，间隔4个小时连续测定中、高浓度血浆工作液各三组，计算其日内精密度与准确度。连续三天同一时间测定中、高浓度血浆工作液各一组，计算其日间精密度与准确度。计算公式如下：ω浓度=c（2-5-1）ω面积=A测（2-5-2）其中，ω浓度为浓度相对回收率，ω面积为面积绝对回收率，所测得的峰面积代入至工作曲线可得c测，c标为混合标准品中DHE、LIM的浓度，A测为血浆工作液经SPE处理所得色谱供试品溶液的色谱峰面积，A标为同浓度混合标准品所测得的峰面积。

3结果与讨论3.1HPLC分析条件的建立高效液相色谱高效液相色谱高分辨率液相色谱气相色谱理论是20世纪60年代末在经典液相色谱的基础上提出来的，它与传统液相色谱的不同之处在于填料颗粒均匀，小颗粒柱效高但强度高，携带流动相要求高压，故又称高压液相色谱，因其速度快又称高速液相色谱。高效液相色谱应用范围广泛，对样品适用范围广，不受对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子化合物和大分子物质都可以使用高效液相色谱(HPLC)进行测定，弥补了气相色谱的不足。此外，HPLC中梯度洗脱可以缩短总色谱周期，提高分离效率，改善峰型和提高灵敏度。目前，气相色谱分析约占已知有机化合物的20%左右，高效液相色谱不受样品温度和沸点的限制，80%需要高效液相色谱，使其具有更广阔的应用前景。本论文实验研究属于指导老师的吴茱萸活性成分体内分析课题研究的一部分。HPLC-UV分析条件的建立以同时检测吴茱萸中的去氢吴茱萸碱（DHE）、柠檬苦素（LIM）、吴茱萸碱（EVO）、吴茱萸次碱（RUT）四种成分为目标。DHE、LIM两个最大吸收峰不同，选择最大吸收峰可提高检测结果准确性和良好的数据结果。DHE与LIM最大吸收波长分别在366nm和208nm左右，两者均有一定极性，故而在HPLC中可以通过调节流动相的极性实现对二者的分离并得到最大检测灵敏度（见下图3-1）。RUTLIMARUTLIMAEVO16.7615.23DHE7.23611.88L16.7615.23DHE7.23611.88LIMEVORUT图3-1混合标准品、血浆工作液色谱图A：10μg/mL混合标准品（DHE：11.8μg/mL，LIM：11.4μg/mL，EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）；B：经固相萃取的10μg/mL血浆工作液（DHE：11.8μg/mL，LIM：11.4μg/mL，EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）3.2SPE吸附原理在吴茱萸的化学成分中，生物碱类是其第一大化合物。去氢吴茱萸碱(DHE)属于吲哚喹唑啉类季胺型生物碱（见下图3-2），具有中等极性及一定的碱性，且DHE具有较强的疏水性，可溶于甲醇、乙醇等有机溶剂中。吴茱萸中萜类化合物以苦味素为主，是吴茱萸中第二大类化合物，柠檬苦素（LIM）微溶于水和乙醚，溶于乙醇、冰醋酸等溶剂，具有较强的疏水性。本实验根据DHE和LIM均具有较强疏水性这一特性，以强疏水性的苯环为功能集团，得以最大程度将这两种成分吸附保留在萃取介质表面。DehydroevodiamineLimominDehydroevodiamineLimomin图3-2去氢吴茱萸碱(DHE)和柠檬苦素（LIM）本实验研究采用的RAM-SPE薄膜卷柱是由课题组研究生先期制备。该薄膜卷柱是将表面接枝有苯甲基疏水性功能基团的SiO2纳米粒子通过亲水性高分子链固定在高分子薄膜表面制得。亲水高分子链起到限进功能层作用，可将血浆中蛋白等大分子阻隔在外，抑制其吸附在薄膜表面，而DHE、LIM等小分子则可渗入亲水限进层，进入疏水层与功能基团（苯甲基）发生相互作用从而被吸附于薄膜上。然而这种疏水相互作用并非不可逆，通过改变上样液pH、洗脱液成分等条件可破坏这种相互作用，进而达到把待测组分洗脱下来的目的。3.3SPE操作条件考察SPE初始操作条件如下：活化：1×1000μL甲醇，1×1000μL纯水，分别抽吸5次上样：200μL10μg/mL血浆工作液，抽吸8次淋洗：1×1000μL纯水，抽吸5次洗脱：2×500μL1%甲酸-甲醇:乙酸乙酯=1:1，分别抽吸7次上述步骤结束后，合并两份洗脱液，室温下N2吹干，残渣用200μL甲醇溶解，振荡，超声，取20μL进液相色谱检测。由此条件出发逐一考察上样、淋洗、洗脱条件。采用10μg/mL浓度水平的血浆工作液作为样品，改变其中某一条件时，其他条件不变，每个条件平行测定三次计算平均值。3.3.1上样条件考察DHE和LIM都有一定的极性，而且DHE具有一定碱性，上样液pH值会对疏水性相互作用产生影响，进而导致吸附效率的变化。因此，实验中专门考察了上样液pH值的影响。由图3-3可知，碱性条件下两者的最终回收率好于酸性条件。在pH=7、8条件下，DHE和LIM洗脱回收率最高。因为该萃取柱要同时萃取四种成分（DHE、LIM、EVO、RUT），综合考虑四种成分的萃取回收率，最终确定上样pH条件为：200μL血浆工作液+400μLPBS（pH=7）。图3-3缓冲溶液pH考察注：1.ω回收(%)=(A测/A标)×100%。2.只改变上样液中缓冲溶液pH，其余条件不变。接着又对上样抽吸次数的效果进行了考察、由图3-4可知，，DHE抽吸次数为10次时最终的洗脱回收率最好（84.1%）；LIM抽吸次数为11次时洗脱效果最好（73.0%）。综合考虑另外两种成分洗脱情况，最终确定抽吸次数为10次。图3-4上样抽吸次数考察注：1.ω回收(%)=(A测/A标)×100%。2.只改变上样液抽吸次数，上述已确定的条件与其余未测定条件均不变。3.3.2淋洗条件考察由图3-5列出了对淋洗体积的考察结果。DHE淋洗体积为2mL纯水时洗脱效果最好（90.7%），LIM淋洗体积为0mL时洗脱效果最好（90.8%）。综合其他两种成分洗脱效果，发现淋洗体积为0mL时洗脱效果最好。但若无淋洗步骤，薄膜卷柱亲水层残留吸附的大分子蛋白无法洗脱下来，容易导致薄膜卷柱压力变大。这样不仅对实验结果造成较大误差，还会造成SPE薄膜堵塞，大大降低其使用寿命，故而淋洗体积条件确定为1mL纯水，抽吸5次。图3-5淋洗液体积考察注：1.ω回收(%)=(A测/A标)×100%。2.只改变淋洗液体积，上述已确定的条件与其余未测定条件均不变。3.3.3洗脱条件考察分析DHE、LIM、EVO、RUT四者分子结构可以看出，都呈现多个环状结构的分子，故都有较强疏水性，洗脱剂的选择应以破坏其与苯环的疏水性相互作用力为主。此外，DHE、EVO、RUT都属于生物碱，具有N原子，可以接受氢质子形成氢键，所以带有氢原子的有机溶剂可以考虑作为洗脱剂。另外，LIM属于内脂，分子结构中含有多个内酯环状结构，DHE、EVO、RUT也都含有羰基，故含有酯键基团的有机溶剂应有一定洗脱效果。分别对洗脱液种类、组成、体积、以及洗脱次数对洗脱回收率的影响进行了考察（测定结果见图3-6）。首先比较了，甲醇与乙腈的洗脱效果。从表中数据可看出，相同条件下（洗脱液体积为500μL×2，抽吸次数7次），DHE乙腈洗脱回收率要好于甲醇，而LIM的则是两种溶剂洗脱效果相同，另外EVO、RUT洗脱效果均为甲醇优于乙腈，故而选择甲醇。以甲醇为基础，考察添加乙酸乙酯的洗脱效果。从表中数据可看出，添加了乙酸乙酯后的洗脱效率要好于单纯使用甲醇，且随着添加量增多，洗脱回收率不断增大。在乙酸乙酯添加比例为50%时，LIM洗脱回收率达到最大（66.6%），此时DHE也达到了81.0%，综合考虑EVO、RUT的洗脱情况，最终确定乙酸乙酯添加比例为50%（v/v）。鉴于除了LIM外，其它三种成分均为生物碱，因此实验中分别在1:1（v/v）的甲醇/乙酸乙酯洗脱液中分别添加0.5%、1.0%的甲酸（氨水），考察洗脱液酸碱性的影响。从图表中数据可看，0.5%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:1这一条件DHE和LIM的洗脱效果最好，分别为100.9%、59.3%。其中DHE洗脱率大于100%，原因可能是薄膜卷柱前期使用时未清洗干净，故而造成数据偏大。综合考虑四种成分的洗脱效果，最终确定洗脱液组成为：0.5%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:1。图3-6洗脱液种类考察注：1.ω回收(%)=(A测/A标)×100%。2.只改变洗脱液种类，上述已确定的条件与其余未测定条件均不变。其次考察了洗脱液抽吸次数对洗脱效果的影响。由图3-7可知，DHE和LIM洗脱效果最好均为抽吸次数7次，分别为105.4%、58.9%。其中DHE在抽吸次数7次和10次时洗脱率均大于100%，而在抽吸次数9次时小于100%（94.3%），且LIM洗脱率逐渐降低，推测可能为混标中其他成分转变为DHE，导致结果异常。综合考虑四种成分的情况，最终洗脱抽吸次数选择为：洗脱抽吸次数7次。图3-7洗脱抽吸次数考察注：1.ω回收(%)=(A测/A标)×100%。2.只改变洗脱抽吸次数，上述已确定的条件与其余未测定条件均不变。最后考察了洗脱液体积对洗脱效果的影响。由图3-8可知，对洗脱液体积的考察中，DHE和LIM洗脱效果最好均为500μL×2，分别为105.4%、58.9%。图3-8洗脱液体积考察注：1.ω回收(%)=(A测/A标)×100%。2.只改变洗脱抽吸次数，上述已确定的条件不变。综合上述考察实验结果，最终确定最佳SPE操作条件为：活化：1×1000μL甲醇，1×1000μL纯水，1×1000μLPBSpH=7，抽吸5次上样：200μL10μm/mL血浆工作液+400μLPBSpH=7，抽吸10次淋洗：1×1000μL纯水，抽吸5次洗脱：2×500μL0.5%氨水-甲醇:乙酸乙酯=1:1，分别抽吸7次为防止血浆样品中蛋白沉积堵塞薄膜卷柱，导致其寿命降低，上样前血浆样品使用离心机5000转高速离心5min，取上清液进行上样。根据上述步骤进行SPE操作后，合并两份洗脱液，使用N2吹干后，加入200μL甲醇进行复溶，斡旋振荡混匀，取20μL进行液相色谱检测。3.4方法学验证3.4.1工作曲线的测定将配制得到的系列浓度血浆工作液按优化的SPE操作条件进行前处理后，所得供试品进行HPLC检测，以DHE和LIM的浓度为横坐标x，其对应的峰面积为纵坐标y作线性回归。表3-1和图3-9分别列出了DHE和LIM的混合血浆工作液测定数据和工作曲线图。去氢吴茱萸碱标准曲线为A=99.304c+3.356，相关系数R=0.9992，在0.118μg/mL～11.8μg/mL呈良好线性关系。柠檬苦素标准曲线为A=5.8048c+0.6346，相关系数R=0.9991，在0.114μg/mL～11.4μg/mL呈良好线性关系。表3-1DHE和LIM工作曲线测定结果cDHE（μg/mL）ADHEcLIM（μg/mL）ALIM0.1180.5921.185.9211.812.379.5122.4560.41193.50.1140.5701.145.7011.403.99.13367AA图3-9DHE和LIM标准曲线注：A：DHE标准曲线图；B：LIM标准曲线图3.4.2日内、日间精密度测定本实验分别对1μg/mL和5μg/mL两个浓度水平的血样工作液进行检测，考察方法准确度和精密度。采用日内、日间浓度相对回收率（%）来评估本方法的准确度，相对标准偏差RSD（%）来评估本方法的精密度。表3-2DHE准确性和精密度加入量（μg/mL）日内日间c测（μg/mL）RSD(%)ω浓度(%)ω面积(%)c测（μg/mL）RSD(%)ω浓度(%)ω面积(%)1.181.325.9989.488.01.301.9590.891.75.925.926.93100994.785.8注：ω浓度(%)=(c测/c标)×100%，ω面积(%)=(A测/A标)×100%。如表3-2所示，去氢吴茱萸碱日内RSD值在5.99%-6.93%，日间RSD值在1.95%-3.69%，均符合体内药物分析的要求（RSD≤15%）。日内浓度相对回收率在89.4%-100%，面积绝对回收率在78.3%-88.0%；日间浓度相对回收率在90.8%-94.7%，面积绝对回收率在85.8%-91.7%。表3-3LIM准确性和精密度加入量（μg/mL）日内日间c测（μg/mL）RSD(%)ω浓度(%)ω面积(%)c测（μg/mL）RSD(%)ω浓度(%)ω面积(%)1.141.4914.476.557.61.7611.664.887.25.706.722.7884.875.57.4211.376.867.0注：ω浓度(%)=(c测/c标)×100%，ω面积(%)=(A测/A标)×100%。如表3-3所示，柠檬苦素日内RSD值在2.78%-14.4%，日间RSD在11.3%-11.6%，基本符合体内药物分析要求。日内浓度相对回收率在76.5%-84.8%，面积绝对回收率在57.6%-75.5%；日间浓度相对回收率在64.8%-76.8%，面积绝对回收率在67.0%-87.2%，两者基本达到体内药物分析的要求。浓度测定结果的准确度和精密度均符合药典相关规定，但两者的面积绝对回收率，特别是LIM的面积绝对回收率偏低，可能是柱子表面负载量偏低，导致其对LIM吸附性不够强。这说明柱子的制备条件还需要进一步优化。

4结论本实验探讨了以限进性纳米粒子薄膜卷柱对大鼠血浆进行前处理萃取并富集血样中的去氢吴茱萸碱和柠檬苦素的效果。实验考察优化了SPE操作条件，测定了工作曲线方程，并进行了2个浓度水平的日内日间精密度和准确度考察。根据实验结果可以看出，去氢吴茱萸碱和柠檬苦素的工作曲线均呈良好的线性关系，其精密度和准确度符合药典体内药物分析的规定。薄膜卷柱对两种成分的萃取面积绝对回收率偏低（尤其是柠檬苦素），推测可能是薄膜卷柱负载量偏低导致，此外也可能跟SPE的抽吸排液操作不均匀有关。后续需要在这些方面加以改进。

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