丹红注射液通过调控SATB1#SLC7A11#HO-1通路抑制脑缺血过程的神经元铁死亡

丹红注射液通过调控SATB1/SLC7A11/GPX4通路抑制脑缺血损伤中的铁死亡中文摘要目的：本文的选题目的是探究丹红注射液（DanhongInjection，DHI）在脑缺血过程中铁死亡进程的作用。缺血性脑卒中具有高死亡率、高复发率和高致残率的特点。目前除了在缺血后较窄时间窗内使用的溶栓治疗手段，临床上还缺乏疗效满意的治疗药物。目前，铁死亡被发现是缺血性脑卒中治疗的关键切入点。故本课题基于前期研究基础，进一步考察了丹红注射液调控的特殊的富含AT序列结合蛋白1（SpecialAT-richsequencebindingprotein1，SATB1）对脑缺血损伤中铁死亡的作用，探讨其在治疗脑缺血等相关疾病中的潜力，既能阐明丹红注射液治疗缺血性脑卒中的新病理机制，又为寻找有效的药物作用靶点奠定基础。方法：建立雄性C57BL/6小鼠的永久性脑缺血模型（pMCAO），利用免疫印迹技术（Westernblot）测定SATB1在术后不同时间点（3h，6h，12h）的表达水平，为后续实验筛选出最佳的时间点。之后进行为期4天的丹红注射液预防给药，建立pMCAO模型，利用行为学测定评估神经缺陷，TTC染色测定脑梗死面积，H&E及尼氏染色考察脑缺血损伤后的病理损伤情况，同时利用免疫荧光技术分析丹红注射液对脑内神经细胞中SATB1蛋白的调控作用。之后，利用普鲁士蓝染色观察铁离子的蓄积、利用透射电镜观察线粒体的超微结构变化，验证丹红注射液对永久性脑缺血中铁死亡的改善作用，结合Westernblot分析铁死亡及相关通路蛋白的表达水平。结果：通过建立不同时间点的pMCAO模型，发现SATB1的表达水平逐渐降低，结合脑卒中急性治疗的时间窗，确定梗死时间6h为最佳时间点并用于后续的实验。此外，在丹红注射液给药后，pMCAO小鼠的脑梗死面积减少（p＜0.05），神经行为学障碍得到改善，并减少了脑皮层组织中神经细胞的死亡（p＜0.05），同时丹红注射液能够提高SATB1在pMCAO小鼠脑神经细胞中的表达水平（p＜0.01），这提示了丹红注射液对永久性脑缺血小鼠的神经保护作用。此外，丹红注射液改善了pMCAO小鼠脑组织中铁离子积蓄、线粒体的特征性坏死的情况。结合Westernblot结果，发现在丹红注射液给药后，小鼠脑组织中特征性抗铁死亡标志物FtH1和HO-1的表达上调（p＜0.01），铁离子转运蛋白TF和TfR1水平下调（p＜0.05），并激活了SATB1/SLC7A11/GPX4铁死亡信号通路，抑制了脑缺血损伤中的铁死亡进程。结论：本课题发现丹红注射液能够通过调控SATB1/SLC7A11/GPX4通路，抑制永久性脑缺血过程中的铁死亡，从新的角度揭示了丹红注射液对脑缺血损伤的作用。关键词：丹红注射液；缺血性脑卒中；铁死亡；SATB1。DanhonginjectionregulatestheSATB1/SLC7A11/GPX4pathwaybyinhibitingtheferroptosisduringcerebralischemiaABSTRACTObjective:ThepurposeofthisarticleistoexploretheroleofDanhongInjection(DHI)ontheprocessofferroptosisduringcerebralischemia.Ischemicstrokeprocessesthecharacteristicsofhighmortalityrate,highrecurrencerate,andhighdisabilityrate.Atpresent,thereisalackofclinicallysatisfactorytherapeuticdrugsexpectthethrombolytictherapyusedwithinanarrowtimewindowafterischemia,.Atpresent,ferroptosishasbeenfoundtobeakeypointforthetreatmentofischemicstroke.Basesonthepreviousresearch,thisstudyinvestigatedtheeffectofSpecialATrichsequencebindingprotein1(SATB1)regulatedbyDanhongInjection(DHI)onferroptosisincerebralischemia.ThisstudyaimstoelucidatethenewpathologicalmechanismofDanhongInjectionintreatingischemicstrokeandbuildupthefoundationforfindingtheeffectivedrugtarget.Methods:Byestablishingthepermanentcerebralarteryocclusion(pMCAO)inmaleC57BL/6mice,weuseWesternblottomeasuretheexpressionlevelofSATB1atdifferentpostoperativetimepoints(3h,6h,12h)toscreentheoptimaltimepointforsubsequentexperiment.Then,a4-dayprophylacticadministrationofDanhonginjectionwasconductedandestablishedthepMCAOmodel.Behavioralmeasurementswereusedtoevaluateneuraldefects,TTCstainingwasusedtomeasuretheareaofcerebralinfarction,H&EandNisslstainingwereusedtoinvestigatethepathologicaldamageafterpMCAOinjury.Atthesametime,immunofluorescencewasusedtoanalyzetheregulatoryeffectofDanhonginjectionontheSATB1proteininneuralcellsinthebrain.Atthesametime,prussianbluestainingwasusedtoobservetheaccumulationofironions,andtransmissionelectronmicroscopywasusedtoobservetheultrastructuralchangesofmitochondriawhichverifiedtheeffectofDanhonginjectiononferroptosisinpermanentcerebralischemia.Finally,Westernblotwasusedtoanalyzetheexpressionofferroptsis-relatedproteins.Results：ByestablishingpMCAOmodelatdifferenttimepoints,itwasfoundthattheexpressionlevelofSATB1graduallydecreased.Accordingtothetimewindowofacutestroke,theoptimaltimepointwasdeterminedtobe6handusedforsubsequentexperiment.Inaddition,aftertheadministrationofDHI,theinfarctareaofpMCAOmicedecreased(p<0.05),theneuroethologydisorderwasimproved,andthedeathofnervecellsinthecerebralcortexwasreduced(p<0.05).Atthesametime,DHIadministrationcouldincreasetheexpressionlevelofSATB1inthebrainneuronsofpMCAOmice(p<0.01),whichsuggestedtheneuroprotectiveeffectofDanhonginjectiononpMCAOmice.Inaddition,italsoimprovedtheaccumulationofironionsandcharacteristicmitochondrialnecrosisinthebraintissueofpMCAOmice.AccordingtotheresultsofWesternblot,itwasfoundthattheexpressionoftheFtH1wasupregulated(p<0.01),thelevelsofironiontransportersTFandTfR1weredownregulated(p<0.05),andtheSATB1/SLC7A11/GPX4ferroptosissignalingpathwaywasactivatedafterDHIadministrationwhichinhibitedtheprocessofferroptosis.Conclusion:ThisstudysuggesedthatDanhongInjectioncaninhibitferroptosisduringpermanentcerebralischemiabyregulatingtheSATB1/SLC7A11/GPX4pathway,whichrevealedtheeffectofDanhongInjectiononcerebralischemiainjuryfromanewperspective.Keywords:Danhonginjection;Ischemicstroke;Ferroptosis;SATB1。

目录TOC\o"1-3"\h\u301前言 前言缺血性脑卒中是世界范围内造成严重残疾和死亡的主要疾病之一，约占脑卒中病例的80%。缺血性脑卒中是由于脑血管的堵塞，致使氧气和葡萄糖等物质运输的急性中断，造成脑组织细胞的死亡[1]。由于人口老龄化以及脑卒中治疗时间窗的限制，临床上目前仍然缺乏安全有效的治疗药物。重组人组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）是FDA批准的唯一治疗急性缺血性中风的药物。然而，由于rt-PA治疗具有脑出血等严重的并发症，在临床应用上有严格的限制条件，故目前临床上仍缺乏安全有效的治疗药物[2]。所以，针对缺血性脑卒中的发病机制，寻找具有治疗作用的药物并阐明其作用机制具有重要的意义。丹红注射液（Danhonginjection,DHI）是由丹参和红花组成的标准化注射剂，广泛用于心脑血管疾病的治疗[3]。多项研究表明，丹红注射液对脑卒中有保护作用。在治疗150例脑卒中患者时，丹红注射液可以显著改善患者的血液流变学指标和凝血功能，从而有效延缓血栓形成[4]。此外，对脑缺血再灌注大鼠的研究显示，丹红注射液具有良好的抗氧化活性，可以改善脑组织中的氧化应激和线粒体功能障碍，进而有效缩小梗死面积。值得注意的是，这些作用机制都与铁死亡有关[5]。铁死亡是一种特殊的细胞死亡方式，具有非凋亡性，铁依赖性的特点，通常会导致脂质过度氧化物的过度累积，造成细胞的氧化性死亡，并在肿瘤、神经退行性疾病以及缺血性脑损伤过程中发挥关键的作用[6]。铁死亡的发生通常伴随着独特的形态和生化特征变化。在形态学变化上，铁死亡造成线粒体体积的萎缩，外膜破裂，嵴减少，内膜压缩等变化；在生化特征上，铁死亡造成铁离子含量超载和脂质过氧化物的累积，从而导致细胞损伤[7]。溶质载体家族7成员11（SLC7A11）作为铁死亡的关键的调节因子之一，已被揭示能够驱动铁死亡抗性，在缺血性脑卒中等疾病中发挥调控作用[8]。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），作为抗氧化损伤的关键因子，与铁死亡的进程密切相关。在脑缺血损伤过程中，谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶的合成活性受到抑制，产生大量活性氧，从而致使脑细胞出现铁死亡的现象[9]。已有研究表明，SLC7A11的下调导致细胞内胱氨酸水平降低，造成谷胱甘肽（GSH）的生物合成降低，从而抑制GPX4活性，加剧铁死亡的进程[10]。基于前期研究，我们在和蛋白质组学中，利用丹红注射液在永久性脑缺血小鼠模型中筛选出关键的转录因子SATB1[11]。已有研究表明，SATB1基因的表达对氧化应激反应具有一定调节作用[12]，在滋养层细胞中，氧化应激的损伤伴随着SATB1表达水平的下调，而上调其表达水平能够恢复肿瘤中滋养层细胞的生长[ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Rao</Author><Year>2018</Year><RecNum>295</RecNum><DisplayText>[19]</DisplayText><record><rec-number>295</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="sexfdwxvkwrewuef55zv2zxe552x9029d9z0"timestamp="1675088223">295</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Rao,H.Y.</author><author>Bai,Y.X.</author><author>Li,Q.S.</author><author>Zhuang,B.M.</author><author>Yuan,Y.</author><author>Liu,Y.M.</author><author>Peng,W.</author><author>Baker,P.N.</author><author>Tong,C.</author><author>Luo,X.</author><author>Qi,H.B.</author></authors></contributors><titles><title>SATB1downregulationinducedbyoxidativestressparticipatesintrophoblastinvasionbyregulatingbeta-catenin</title><secondary-title>BiologyofReproduction</secondary-title></titles><periodical><full-title>BiologyofReproduction</full-title><abbr-1>Biol.Reprod.</abbr-1><abbr-2>BiolReprod</abbr-2></periodical><pages>810-820</pages><volume>98</volume><number>6</number><dates><year>2018</year><pub-dates><date>Jun</date></pub-dates></dates><isbn>0006-3363</isbn><accession-num>WOS:000446326300008</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000446326300008</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1093/biolre/ioy033</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>13]。SATB1是一种核基质相关蛋白的转录因子，参与染色质重塑。SATB1在成熟神经元细胞中高度表达，主要表达在大脑皮质，下丘脑与海马等区域，与神经元发育和神经细胞功能具有密切关系[14]。但目前对于SATB1在脑卒中过程中的作用仍不明确，且缺少深入的研究。2实验材料2.1实验动物SPF级雄性C57BL/6小鼠，周龄6-7周，体重15-20g，购自南方医科大学动物中心。小鼠在饲养在SPF环境，提供充足的饲料和水，并进行适应性喂养，动物实验伦理已通过广东药科大学动物实验伦理委员会的批准，动物实验编号为：SPF2017416。2.2药品与试剂表2-1主要药品与试剂药品/试剂名称生产厂家/货号丹红注射液制剂山东步长制药公司依达拉奉Alorich/M70800异氟烷玉研生物/s100105332%TTC染色液Solarbio/G3005PBS缓冲液（pH7.4）Corning/210400674%多聚甲醛通用型组织固定液Biosharp/BL539AHE染液Servicebio/G1005尼氏染液Servicebio/G1036甲醇致远RIPA裂解液MCE/HYK0010蛋白酶抑制剂MCE/HYK0022磷酸酶抑制剂Thermo/23227BCA蛋白定量试剂盒Thermo/232275×蛋白上样缓冲液生工生物工程有限公司/C506032-0005蛋白预染MarkerThermo/266164×Tris-HCl/SDS缓冲液（pH6.8）生工生物工程有限公司/B546022-02504×Tris-HCl/SDS缓冲液（pH8.8）生工生物工程有限公司/B546021-0250TEMED碧云天/ST7728APSsubstitute碧云天/ST005SDS碧云天/ST627Glycine/甘氨酸碧云天/ST085Tris（ElectrophoresisGrade）碧云天/ST760脱脂奶粉美国BD公司/CND07-F0500EZ-BuffersH10×TBSTBuffer生工生物工程有限公司/C520009-0500一抗稀释液碧云天/P002A二抗稀释液碧云天/P0258DAPI染色液Servicebio/G1012PVDF膜MILLIPORE/PRO4575GAPDHantibodyPTG/60041-1-lgSATB1antibodyAbcam/ab109122NeunantibodyServicebio/G11138GoatAnti-RabbitlgG(H+L)PTG/SA00001-2Goatanti-MouseIgG(H+L)PTG/SA00001-1电镜固定液Servicebio/G1102p-SATB1antibodySAB/13538SLC7A11antibodyAbcam/ab175186HO-1antibodyPTG/27282-1-lgGPX4antibodyPTG/67763-1-lgTFR1antibodyAbmart/T56618FTH1antibodyAbmart/T55648TFantibodyPTG/17435-1-APTubulinantibodyPTG/10068-1-lgBeta-actinantibodyPTG/67763-1-lg2.3仪器与耗材表2-2主要仪器与耗材仪器与耗材名称生产厂家/货号1mL移液枪ThermoScientific200μL移液枪ThermoScientific100μL移液枪ThermoScientific20μL移液枪ThermoScientific2.5μL移液枪ThermoScientific酶标仪美国BIO-RAD伯乐低温高速离心机SiGMA/TDL-80-2B-80℃超低温冰箱Haier雪花制冰机XUEKE电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司/DHG-9070A恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司液氮罐Haier/YDS-65-216-FZ小鼠脑膜具上海玉研科技仪器有限公司小鼠MCAO线栓广州佳灵生物技术有限公司手术器械等上海玉研科技仪器有限公司垂直电泳槽美国BIO-RAD伯乐电泳仪电源美国BIO-RAD伯乐摇床SCILOGEX/SK-L180-E超声波细胞粉碎仪宁波新芝生物科技股份有限公司/JY92-IIN化学发光成像仪北京赛智创业科技有限公司3实验方法3.1药物的配置丹红注射液（Danhonginjection，DHI）的配制：丹红注射液为中药注射剂，每次给药前选择未开封的试剂，现开现用。依达拉奉溶液（Edaravone）：称取适量依达拉奉粉末，用生理盐水配置成母液，终浓度为1mg/ml现配现用。3.2动物分组及给药饲养周龄为8-10周的C57小鼠达到20-25g，将其随机分为5组，分别为假手术组20只（Sham），模型组20只（Model），丹红注射液高剂量组20只（DHI-L，5ml/kg），丹红注射液低剂量组10只（DHI-L，2.5ml/kg），依达拉奉阳性药组（Edaravone，6mg/kg）。每日腹腔注射给药一次一共给药4次，假手术组和模型组按照5ml/kg的比例腹腔注射生理盐水，第四天在腹腔注射给药后1h开始造模。3.3小鼠pMCAO模型的建立基于Zea-Longa法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Longa</Author><Year>1989</Year><RecNum>307</RecNum><DisplayText>[59]</DisplayText><record><rec-number>307</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="sexfdwxvkwrewuef55zv2zxe552x9029d9z0"timestamp="1675260197">307</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Longa,E.Z.</author><author>Weinstein,P.R.</author><author>Carlson,S.</author><author>Cummins,R.</author></authors></contributors><titles><title>Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats</title><secondary-title>Stroke</secondary-title></titles><periodical><full-title>Stroke</full-title><abbr-1>Stroke</abbr-1><abbr-2>Stroke</abbr-2></periodical><pages>84-91</pages><volume>20</volume><number>1</number><dates><year>1989</year><pub-dates><date>1989</date></pub-dates></dates><isbn>0039-2499</isbn><accession-num>MEDLINE:2643202</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://MEDLINE:2643202</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1161/01.Str.20.1.84</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[15]，将健康雄性小鼠（体重在25g左右）禁食12h后，用异氟烷进行气体麻醉，在整个手术过程中保持深度麻醉的状态。将动物固定，然后沿颈部中线切开，露出颈部\o"LearnmoreaboutrightcommoncarotidarteryfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"右颈总动脉(CCA)、\o"LearnmoreaboutexternalcarotidarteryfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"颈外动脉(ECA)和\o"LearnmoreaboutinternalcarotidarteryfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"颈内动脉(ICA)。在解剖时应注意避免在解剖过程中损伤迷走神经、CCA和ECA。然后将符合小鼠体重区间的线栓插入ICA中，并轻轻推进直到线栓在ICA內有轻微阻力以封闭\o"LearnmoreaboutmiddlecerebralarteryfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"大脑中动脉。在假手术组中不插入线栓，其余的操作与模型组及给药组相同。缺血的时间根据实验目的的需要，进行相应的设计。3.4行为学评分基于Zea-Longa法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Sasaki</Author><Year>2009</Year><RecNum>306</RecNum><DisplayText>[60]</DisplayText><record><rec-number>306</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="sexfdwxvkwrewuef55zv2zxe552x9029d9z0"timestamp="1675260116">306</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Sasaki,Masanori</author><author>Honmou,Osamu</author><author>Kocsis,JefferyD.</author></authors></contributors><titles><title>Aratmiddlecerebralarteryocclusionmodelandintravenouscellulardelivery</title><secondary-title>Methodsinmolecularbiology(Clifton,N.J.)</secondary-title></titles><periodical><full-title>Methodsinmolecularbiology(Clifton,N.J.)</full-title></periodical><pages>187-95</pages><volume>549</volume><dates><year>2009</year><pub-dates><date>2009</date></pub-dates></dates><isbn>1064-3745</isbn><accession-num>MEDLINE:19378204</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://MEDLINE:19378204</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1007/978-1-60327-931-4_13</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[16]，在术后6h后，进行行为学评分，评分细则见表3-1。评分时由三名实验人员分开进行评分，采用双盲法在空旷且安静的地方进行，最终的行为学评分结果为三位实验人员评分的均值。表3-1小鼠神经功能症状评分标准分数行为表现0无明显神经功能障碍1右前肢伸直障碍2右前肢有阻碍，行走时偏向右侧3原地右侧旋转4完全右瘫3.5样品收集及处理经过pMCAO造模后，深度麻醉小鼠并进行生理盐水的心脏灌流，取出大脑并将小脑、脑干和嗅球等部位进行分离，针对不同的后续实验需求进行不同的处理。进行药效指标的测定和免疫印迹的样本，需要使用手术刀将左右脑分开。对于使用TTC染色的样品，则需要保留全脑。而用于组织学检测的样品需要使用多聚甲醛进行固定，并冷藏保存。3.6免疫印迹技术（Westernblot）分析目标蛋白的差异表达取梗死侧半脑组织，加入钢珠进行组织匀浆，同时加入RIPA裂解液、\o"LearnmoreaboutproteasefromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"蛋白酶和\o"LearnmoreaboutphosphatasefromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"磷酸酶抑制剂（98:1:1）,在冰上静置30min，然后使用低温高速离心机进行离心（12000rpm，4℃，10min），取出上清液后分装备用。使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白浓度进行定量，变性后保存﹣20℃。将分子量指示剂Marker和样本分别加入到SDS胶的泳道內，进行电泳，结束之后进行电转到活化的PVDF膜，根据目标蛋白分子量剪膜后，在5%的脱脂牛奶中封闭1.5h，后续利用一抗稀释液配置目标蛋白的一抗溶液，完全覆盖PVDF膜，放入4℃过夜，隔天进行溶液的回收后使用TBST溶液清洗5次，之后即可加入对应种属的二抗溶液，在室温下孵育1.5h，之后同样用TBST溶液清洗5次，即可使用化学成像发光仪和ECL发光液将条带显影成像，之后使用ImageJ软件统计灰度值。3.7TTC染色法测定脑梗死面积首先，将“3.5”中取材的大脑放入小鼠脑模具中，然后将其放入-20℃的环境中冷冻15min。之后用手术刀片将大脑切成连续的1mm厚度的冠状段，并在37℃的0.5%TTC中孵育10min，适当翻面保证染色均匀。完成染色后，将样品固定在多聚甲醛中以便更好地成像。正常的脑组织经过染色后呈现红色，而梗死区域则呈现白色。采用ImageJ软件（ImageJ1.4,NIH,UnitedStates）按照以下公式计算脑梗死体积：梗死面积（%）=（梗死面积/全脑面积）×100%。3.8小鼠脑组织切片制备和染色3.8.1石蜡切片制作取“3.5”中取材后固定的脑组织，制成4µm左右厚度的石蜡切片，剩余脑组织利用石蜡包埋，置于室温备用，为保证最佳实验效果，需尽量在3个月内使用。3.8.2H&E染色取制备好石蜡切片脱蜡，用苏木精染色3-5min，用流水洗涤后使用分化液分化，双蒸水再次浸洗后反蓝。将切片用1%伊红染色5min后水洗，在浓度递减的乙醇中脱水，并在二甲苯中澄清。最后，用中性树脂固定切片，使用扫描仪采集图像并分析。3.8.3尼氏（Nissl）染色取制备好石蜡切片脱蜡后水洗，用尼氏染色溶液染色3min。用蒸馏水洗涤脑切片后使用0.1%的冰醋酸分化。脱水处理后使用中性树脂固定切片，使用扫描仪采集图像并分析。3.8.4组织免疫荧光染色将切片浸入EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）中，在微波中加热进行抗原修复，期间注意防止EDTA缓冲液过度蒸发导致干片的情况。冷却至室温后，将切片放置于PBS溶液，晃动洗涤三次并甩干后，用3%的过氧化氢溶液避光孵育25min以封闭内源性的过氧化物酶，再重复PBS洗涤的步骤。之后用1%牛血清白蛋白孵育以阻断非特异性结合。切片与一抗孵育在4℃过夜，之后置于PBS溶液內，在摇床中晃动洗涤三次。孵育对应种属的二抗在室温孵育1h。PBS洗涤之后，再加入DAPI进行细胞核复染色，避光孵育10min再进行PBS洗涤，后略微甩干用抗荧光猝灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察并使用扫描仪采集图像并分析。3.8.5DAB加强法的普鲁士蓝染色将各组的石蜡切片脱蜡至水，将切片浸入2%亚铁氰化钾和2%盐酸等比例混合溶液內，染色30min后用蒸馏水清洗2次。之后继续用DAB显色液滴染5-10min，之后除去染液后并用蒸馏水清洗3次。再使用苏木素对细胞核进行染色，水洗后使用盐酸水溶液分化和氨水水溶液返蓝，再次水洗后进行封片，即可进行显微镜的镜检和扫片处理。3.9透视电镜观察线粒体结构收集脑组织样品后，保存于在电镜专用的固定液中，于4℃过夜，从小鼠的缺血半暗带获得1mm3立方体的组织块，保存于固定液內进行送样。之后经过一系列的漂洗程序和不同浓度的乙醇进行脱水处理，然后，用超薄切片机（LEICAEMUC7）切割包埋于环氧树脂內的样品，制成70-90nm的切片,用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行染色后水洗风干，用电子透射显微镜进行观察线粒体，拍摄其超微图像。3.10数据处理采用GraphpadPrism8.0软件对实验数据进行统计分析，结果用均数±标准差（mean±SD）表示，在多组别样本实验中，采用单因素方差分析，p<0.05表示有显著性差异，具有统计学意义；后续使用Graphpad和Photoshop软件作图。4实验结果4.1pMCAO后SATB1表达水平的动态变化如图4-1和4-2所示，我们用Westernblot考察了SATB1的表达水平在pMCAO造膜时间为3h，6h，12h的三个不同的时间点的动态变化，结果发现SATB1在3h时的表达水平没有显著性变化，但是在6h，12h的时间点的表达发生了显著性的降低（p<0.01），尤其是在6h的时间点，这提示我们SATB1在脑卒中急性治疗时间窗内的潜在作用。图4-1不同pMCAO造膜时间下SATB1蛋白的代表性图。图4-2不同pMCAO造膜时间下SATB1蛋白的定量。注：n=3，与sham组比较，##p<0.01；ns，没有显著性差异。4.2丹红注射液减少小鼠pMCAO损伤的脑梗面积如图4-3和图4-4所示，Sham组脑组织没有梗死情况，TTC染色后脑切片呈现红色，与Sham组相比，Model组的脑组织切片出现明显的白色梗死区域，脑梗死面积为32.4±3.14%，尼莫地平阳性药组能够明显改善梗死面积（p＜0.01），证明建立模型成功。丹红注射液高（DHI-H）、低剂量组(DHI-L)给药后缩小脑梗面积的效果显著（p<0.01），其中效果更佳的是高剂量组，梗死面积缩小至18.8±4.22%，而低剂量组为25.18±4.04%。、图4-3DHI各剂量给药后小鼠大脑的TTC染色代表图。图4-4DHI各剂量给药后小鼠脑梗死面积的统计。注：n≥5，与sham组比较，##p<0.01，与model组比较；**p<0.01。4.3丹红注射液改善小鼠pMCAO损伤造成的神经行为学障碍采用Longa法，测定小鼠pMCAO术后的行为学表现，神经缺陷越严重则评分越高。如图4-5所示，Model组的小鼠出现原地转圈，甚至偏瘫等行为学障碍，表明其神经功能受损严重。而相比之下Sham组的小鼠行动正常，无明显行为学障碍。丹红注射液及尼莫地平给药后，对比model组的小鼠，其行为障碍均有改善（p<0.05）。图4-5DHI各剂量给药后小鼠神经学评分结果注：n=8，与sham组比较，#p<0.05；与model组比较，*p<0.05。4.4丹红注射液对pMCAO后脑组织病理损伤的保护作用根据“4.2”结果，丹红注射液高剂量组改善脑梗死的效果最佳，因此选择该组别进行脑组织的病理损伤分析。4.4.1H&E染色结果如图4-6所示，Model组的脑组织切片显示造模后脑组织细胞出现严重坏死，细胞间隙扩大，细胞核固缩，表示脑组织损伤严重。DHI给药组则改善了上述现象。图4-6图4-6小鼠脑组织H&E染色结果。（n=3）注：40×，标尺为20μm。4.4.2Nissl染色结果如图4-7和图4-8所示，Nissl染色的结果显示，在Model组小鼠的大脑皮层中Nissl阳性神经元的数量较少，且细胞间隙较宽。相比之下，在DHI给药后小鼠大脑皮层中Nissl阳性神经元的数量增多，尼氏小体更加清晰，受损程度减弱，其形态和排列也都与Sham组正常形态相似，表明DHI改善了脑卒中损伤造成的神经元损伤。图4-7小鼠脑组织Nissl染色结果。（n=3）注：40×，标尺为20μm。图4-8各组的Nissl阳性细胞数统计结果。（n=3）注：n=3，与sham组比较，#p<0.01，与model组比较，*p<0.05。4.5丹红注射液对于SATB1表达水平的调控作用如图4-9和图4-10所示，通过观察脑组织切片的免疫荧光结果，可以发现Sham组几乎全部的NeuN阳性神经元都与SATB1强烈共定位。pMCAO后，大脑皮层中共定位的神经元显著减少，这表明神经元细胞在术后的丢失增加，SATB1在神经元细胞的表达显著降低（p<0.01），上诉情况在DHI处理后得到了显著性的改善（p<0.01）。图4-9小鼠脑组织SATB1免疫荧光染色结果。（n=3）图4-10小鼠脑组织中，各组SATB1和NeuN共定位细胞数的统计。（n=3）4.6丹红注射液抑制小鼠pMCAO损伤的铁死亡4.6.1DAB加强法普鲁士蓝染色结果如图4-11所示，根据普鲁士蓝染色结果，我们观察到与Sham组相比，Model组小鼠的梗死脑组织呈现出明显的棕黄色，这表明铁离子在该区域积累严重。然而，在DHI处理后，梗死脑组织的铁离子积累情况显著得到改善。图4-11小鼠脑组织普鲁士蓝染色结果。（n=3）注：40×，标尺为20μm。4.6.2透视电镜观察线粒体的超微结构改变线粒体超微结构的改变是铁死亡的基本特征之一。我们使用透射电镜观察了各组小鼠脑组织中线粒体的形态学变化，如图4-12所示，Model组的线粒体形态出现了膜破裂增加、线粒体嵴缺失或减少及体积减小等铁死亡特征性坏死表现。而在DHI处理后，线粒体的结构更加完整，破裂受损的线粒体数量也有所减少。图4-12小鼠脑组织的线粒体超微结构观察。（n=3）4.6.3丹红注射液通过SATB1/SLC7A11/GPX4通路抑制pMCAO损伤小鼠的铁死亡。如图4-13所示，Model组与空白对照组相比SATB1及磷酸化的p-SATB1表达明显下降（p<0.05，p＜0.01），DHI治疗后其表达水平明显升高（p<0.01，p＜0.05）），这表明丹红注射液可调控pMCAO后SATB1的表达。同时，作为调节机体铁平衡的关键蛋白，Model组的转铁蛋白TF和转铁蛋白受体TFR1的表达水平显著上升，而在DHI治疗组，它们的表达水平却明显降低（p<0.05）。铁死亡的保护性因子HO-1和FTH1在pMCAO后的蛋白表达水平显著降低（p<0.05），而在DHI治疗组中，它们的蛋白水平则显著提高。这一结果显示，DHI可以抑制pMCAO后脑组织的铁死亡进程。SLC7A11和GPX4蛋白作为SATB1潜在的下游调控蛋白，它们的表达水平在Model组也有明显的下降，DHI治疗后其表达水平得到明显的升高（p<0.05），这表明丹红注射液有可能通过SATB1/SCL7A11/GPX4信号通路抑制pMCAO后的铁死亡，起到保护作用。图4-13丹红注射液调控小鼠梗死侧脑组织中相关蛋白代表性图片及表达水平。（A）SATB1（B）SLC7A11（C）TFR1（D）GPX4（E）FTH1（F）p-SATB1（G）TF（H）HO-1。注：n=3-4，与sham组比较，#p<0.05，##p<0.01；与model组比较，*p<0.05,**p<0.01。5讨论在前期的核蛋白质组学中，我们发现了丹红注射液在永久性脑缺血小鼠模型中调控关键转录因子SATB1的表达[17]。最近的研究也表明，SATB1缺失会影响神经元成熟过程和神经传导系统的发展[18]。但SATB1在脑缺血损伤过程中的作用仍不明确，因此我们进一步探讨丹红注射液及SATB1对脑缺血损伤的潜在作用。永久性大脑中动脉闭塞模型（pMCAO），是脑缺血损伤的模型之一，被广泛应用于脑中风机制和药物研究。故在本章中，通过建立体内永久性脑缺血模型，进一步考察了SATB1在三个不同时间点的表达水平，发现在6h降低最为明显，与脑卒中治疗时间窗吻合，因此选择该时间点进行研究。同时，我们利用TTC染色和神经行为学评估了丹红注射液对于急性脑缺血小鼠的脑梗死面积和神经行为学评分的改善作用，发现丹红注射液能够减少急性期pMCAO小鼠的脑梗死面积，提高神经功能障碍表现。H&E染色法常用于分析组织病理损伤情况；尼氏染色法常用于观察尼氏小体的分布和神经细胞损伤情况。在脑缺血损伤时，脑组织中的神经细胞受到损伤，尼氏小体数量减少[19]。通过对脑病理切片的分析，我们发现在pMCAO模型中，丹红注射液给药组能够显著改善pMCAO小鼠的脑组织损伤，增加阳性尼氏小体的数量，证明其具有一定的神经保护作用。免疫荧光技术常用于检测目标蛋白在特定组织和细胞类型内的表达情况。在pMCAO模型中，丹红注射液能够显著提高SATB1在NeuN标记的神经元内且的表达水平，提示其可能是通过调控神经元细胞中SATB1的表达，在脑缺血过程中发挥潜在作用。近年来的研究指出，铁死亡是一种铁依赖性的非凋亡形式的细胞程序性死亡，在脑缺血治疗的重要性愈发得到重视。在生物学上，铁死亡的发生会导致铁离子的代谢功能障碍，造成铁离子含量超载，导致细胞损伤[7]。而在形态学上，铁死亡会导致线粒体形态的特征性改变，其中包括了线粒体嵴的消失或损伤，线粒体体积显著性减小以及脂质细胞膜的增厚，最终导致细胞功能的障碍，造成细胞死亡ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Chen</Author><Year>2020</Year><RecNum>293</RecNum><DisplayText>[71]</DisplayText><record><rec-number>293</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="sexfdwxvkwrewuef55zv2zxe552x9029d9z0"timestamp="1675084986">293</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Chen,J.H.</author><author>Wang,Y.H.</author><author>Wu,J.Y.</author><author>Yang,J.J.</author><author>Li,M.C.</author><author>Chen,Q.X.</author></authors></contributors><titles><title>ThePotentialValueofTargetingFerroptosisinEarlyBrainInjuryAfterAcuteCNSDisease</title><secondary-title>FrontiersinMolecularNeuroscience</secondary-title></titles><periodical><full-title>FrontiersinMolecularNeuroscience</full-title><abbr-1>Front.Mol.Neurosci.</abbr-1><abbr-2>FrontMolNeurosci</abbr-2></periodical><volume>13</volume><dates><year>2020</year><pub-dates><date>Jun</date></pub-dates></dates><isbn>1662-5099</isbn><accession-num>WOS:000546841800001</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000546841800001</url></related-urls></urls><custom7>110</custom7><electronic-resource-num>10.3389/fnmol.2020.00110</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[20]。因此，我们通过普鲁士蓝染色、透射电镜观察等方法，发现丹红注射液可减少铁离子蓄积，并改善pMCAO小鼠线粒体的特征性坏死，包括了线粒体膜、嵴和体积的变化，从而抑制铁死亡。核因子E2相关因子2（NRF2）被认为是抗氧化反应的主要调节因子，其许多下游靶基因参与了细胞中的氧化还原失衡的调节过程，而SLC7A11和GPX4作为NRF2的下游靶点，在调节脂质氧化和铁死亡的进程中发挥重要的作用[21-22]。已有研究表明，在大鼠的脑缺血损伤模型中，NRF2能够调高SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平，抑制铁死亡进程，提高脑缺血损伤大鼠的神经功能评分，从而在发挥保护作用[23]。之前研究表明，SATB1基因的表达与氧化应激过程密切相关[13]。因此，我们猜想在脑缺血损伤中，SATB1能够通过调节SLC7A11和GPX4蛋白，抑制铁死亡的进程。于是，我们通过Westernblot分析了TfR1，TF等铁死亡关键及SATB1/SLC7A11/GPX4通路相关蛋白的表达。结果表明，在pMCAO模型中，丹红注射液能够激活SATB1/SLC7A11/GPX4信号通路，抑制脑缺血损伤过程中的铁死亡进程，发挥保护作用。参考文献YuanY,ZhaiY,ChenJ,XuX,WangH.KaempferolAmelioratesOxygen-GlucoseDeprivation/Reoxygenation-InducedNeuronalFerroptosisbyActivatingNrf2/SLC7A11/GPX4Axis.Biomolecules.2021Jun22;11(7):923.doi:10.3390/biom11070923.MoorthamersS,MattarN,FrezalsL,PreseauT,GazagnesMD.ThrombolysisinanAcuteIschemicStrokePatientonDirectAnticoagulantTherapyOutsideoftheTraditionalTimeWindow:ACaseReport.Cureus.2022Sep27;14(9):e29673.doi:10.7759/cureus.29673.[3]ZengM,ZhouH,HeY,DuH,YinJ,HouY,ZhuJ,ZhangY,ShaoC,YangJ,WanH.Danhonginjectionenhancesthetherapeuticeffectofmannitolonhemisphericischemicstrokebyamelioratingblood-brainbarrierdisruption.BiomedPharmacother.2021Oct;142:112048.doi:10.1016/j.biopha.2021.112048.Epub2021Aug19.[4]JiangY,LianYJ.EffectsofDanhonginjectiononhemodynamicsandtheinflammation-relatedNF-κBsignalingpathwayinpatientswithacutecerebralinfarction.GenetMolRes.2015Dec14;14(4):16929-37.doi:10.4238/2015.December.14.21.[5]曾敏，周宏，何燕，王志，邵春，殷军，杜宏，杨军，万宏。丹红注射液通过改善缺血半暗带细胞内能量代谢偶联减轻脑缺血/再灌注损伤。生物医学药物疗法。2021年8月；140:111771.doi:10.1016/j.biopha.2021.111771.Epub2021年5月28日。[6]XuY,LiK,ZhaoY,ZhouL,LiuY,ZhaoJ.RoleofFerroptosisinStroke.CellMolNeurobiol.2023Jan;43(1):205-222.doi:10.1007/s10571-022-01196-6.[7]ZhangY,LuX,TaiB,LiW,LiT.FerroptosisandItsMultifacetedRolesinCerebralStroke.FrontCellNeurosci.2021Jun3;15:615372.doi:10.3389/fncel.2021.615372.[8]ZhuL,FengZ,ZhangJ,DuL,MengA.MicroRNA-27aRegulatesFerroptosisThroughSLC7A11toAggravateCerebralischemia-reperfusionInjury.NeurochemRes.2023May;48(5):1370-1381.doi:10.1007/s11064-022-03826-3.[9]LiuT,CuiY,DongS,KongX,XuX,WangY,WanQ,WangQ.TreadmillTrainingReducesCerebralIschemia-ReperfusionInjurybyInhibitingFerroptosisthroughActivationofSLC7A11/GPX4.OxidMedCellLongev.2022Jun6;2022:8693664.doi:10.1155/2022/8693664.

[10]YuP,ZhangJ,DingY,ChenD,SunH,YuanF,LiS,LiX,YangP,FuL,YuS,ZhangJ.Dexmedetomidinepost-conditioningalleviatesmyocardialischemia-reperfusioninjuryinratsbyferroptosisinhibitionviaSLC7A11/GPX4axisactivation.HumCell.2022May;35(3):836-848.doi:10.1007/s13577-022-00682-9.

[11]WeiJ,ZhangY,JiaQ,LiuM,LiD,ZhangY,SongL,HuY,XianM,YangH,DingC,HuangL.SystematicinvestigationoftranscriptionfactorscriticalintheprotectionagainstcerebralischemiabyDanhonginjection.SciRep.2016Jul19;6:29823.doi:10.1038/srep29823.[12]包春燕，周林裕，于晓霞，李彩霞，陈蓉.临床和实验医学杂志子痫前期胎盘和蜕膜组织中Gas6、SATB1的含量及其与氧化应激、炎性反应的相关性2018,17(09),949-952[13]RaoH,BaiY,LiQ,ZhuangB,YuanY,LiuY,PengW,BakerPN,TongC,LuoX,QiH.SATB1downregulationinducedbyoxidativestressparticipatesintrophoblastinvasionbyregulatingβ-catenin.BiolReprod.2018Jun1;98(6):810-820.doi:10.1093/biolre/ioy033.[14]BalamotisMA,TambergN,WooYJ,LiJ,DavyB,Kohwi-ShigematsuT,KohwiY.Satb1abla