YL胶囊溶出度试验方法的初步研究

YL胶囊溶出度试验方法的初步研究【摘要】目的：建立YL胶囊溶出度试验方法，为其质量评价提供参考。方法：采用小杯法，模拟胃液的溶出介质为0.1mol/L盐酸溶液100mL，模拟肠液的溶出介质为pH=6.8的磷酸盐缓冲液100mL，转速50r·min-1，温度37±0.5℃进行溶出度试验，溶出液经孔径10μm的滤膜滤过，用紫外分光光度计测定其600nm处的吸光度。结果：YL高浓度胶囊在胃液中无溶出，在肠液中完全溶出。结论：试验结果可为YL胶囊的质量评价提供参考，保证药物的质量。【关键词】YL胶囊；溶出度；比浊法；CCK-8；活菌数PreliminaryStudyonDissolutionMethodofYLCapsules[Abstract]Objective:ToestablishamethodofthedeterminationofthedissolutionofYLcapsules,thus,toprovidereferenceforitsqualityevaluation.Methods:Thesmallglassmethodwasadoptedfortwodifferentdissolutionmedia,thedissolutionmediumofsimulatedgastricfluidwas100mLof0.1mol/Lhydrochloricacidsolution,andthedissolutionmediumofsimulatedintestinalfluidwas100mLofphosphatebufferwithpH=6.8,therotationspeedwas50r·min-1,andthetemperaturewas37±0.5℃.Thedissolutionwasfilteredthroughafiltermembranewithaporesizeof10μm。Itsabsorbanceat600nmwasdeterminedbyanultravioletspectrophotometer.Results:TheHighconcentrationofYLcapsulesdonotdissolveingastricjuice,whiletotaldissolveinintestinalfluid.Conclusion:TheexperimentalresultscanprovideareferenceforthequalityevaluationofYLcapsulesandensurethequalityofdrugs.[Keywords]YLCapsulesDissolutionTurbidimetricmethodCellCountingKit-8Numberofviablebacteria目录TOC\o"1-3"\h\u1前言 前言1.1益生菌的药理作用、临床作用及发展现状YL胶囊是一种自研的活菌胶囊，其主要的药物为益生菌。益生菌是一种肠道的共生菌群，其主要作用是调整人体免疫和肠道等健康，是目前用于调节肠道菌群失调的常见制剂产品。近年来微生物组学的研究不断深入，越来越多的研究证据显示微生物与人体的健康密切相关，人类生活质量的不断提高，促使益生菌制剂产品也逐渐走在高科技生物制品的前沿。对于日渐发展的益生菌制剂产品，确认其活菌数是确保产品质量的关键。为了满足科研部门和医院测定工作的需要，国内外在益生菌制剂的研究上给予更多的关注以及不断深入探究。1.2溶出度试验的发展现状在药物产品的开发阶段或常规的质量控制阶段,溶出度试验以反映和控制药物制剂的体内溶出行为为目的REF_Ref28207\n\h[1]，因此溶出方法都应尽可能建立良好的体内外相关性，才能较为准确地预测该药物在体内的吸收行为。美国药典是最早收载有关溶出度试验的药典，于1973年版美国药典收载地高辛片的溶出度和释放度检查，第一次引入溶出度检查的相关概念，随后在1988年正式引入溶出度检查法。而溶出度试验最初以溶出检查法在1985年被收录入中国药典，在1995年新增了小杯法装置，至最新版中国药典2020年版，收录了篮法、浆法、小杯法、桨碟法、转筒法、流池法以及往复筒法，共七种测定方法。目前中国药典溶出度检查品种数达180种，美国药典则高达515种REF_Ref28296\n\h[2]。横观国内外，美国药典是目前收录溶出度试验方法最多且各方面最详尽的药典。纵观整个溶出度试验方法发展历程，国内外不断新增溶出度试验方法，不断优化与完善现存的方法，要求越来越严格，可见溶出度试验对药物的质量保证越来越重要。目前各国药典关于药物溶出检查的政策和规定不尽相同,但总体趋势向着趋于统一的方向发展REF_Ref28397\n\h[3]。如今，相对前沿的方法如往复筒法、流通池法，基于介质的自然对流，使样品一直暴露于均匀无涡流的新鲜介质中，从而达到模拟药物体内溶出的效果。在一定程度为一般口服药物的质量评价提供参考，但装置以及操作步骤较为复杂，且有待改进与完善。而篮法和小杯法等作为较常用的溶出度试验方法，以搅拌或旋转产生的强制对流使药物溶出为原理REF_Ref28433\n\h[4]，其装置简单、操作简单，同样能建立良好的体内外相关性，故更加多地应用于药物溶出检查中。尽管当前各国还没有关于溶出方法建立与验证的详尽指导与解释，但是通常在药物溶出方法建立过程中首选篮法与浆法，在两者不适用时，才考虑采用往复筒法或流通池法等REF_Ref28465\n\h[5]。1.3活菌数测定方法的发展现状1.3.1平板菌落计数法作为一种传统的总菌数的测定方法，平板菌落计数法是取合适稀释度的菌液，滴入选择性琼脂培养基平皿上，玻棒涂布均匀后置适宜条件下培养，到期对平皿菌落进行计数REF_Ref28576\n\h[6]。该法能准确地测定出相应实验结果，故被广泛应用且多作为其他方法的验证方法。但时由于其检测过程中多因操作过程繁琐，检测周期长，容易导致测定结果受多种试验因素(如培养温度、培养时间、培养基等)的影响。1.3.2比浊法比浊法也是一种传统、常见的总菌数的测定方法，其原理是利用微生物液体培养后因活菌的增加，导致培养液浑浊度的增加，进而运用分光光度计在特定波长下测定REF_Ref28622\n\h[7]，进行浑浊度的对比。该方法优点在于简单、快速且直观，但无法确定培养液中菌的死活，故测出的数据不能准确地表明微生物的活菌数。1.3.3流式细胞分析技术（FCM）流式细胞分析技术（flowcytometryanalysisFCM）是近年来在非培养活菌定量技术中迅速崛起的一项技术，其原理基于SYTO9和PI两种核酸染料的跨膜特性进行益生菌死/活的区分，染色后孵育，使用nFCM检测，实现对细菌活性的评估。该法提供了一种极其快速且准确的单细胞计数细菌检测方法REF_Ref28655\n\h[8]，且其结果的准确性、稳定性以及重复性较高，现已被证实可用于益生菌产品总菌及活菌的计数，但目前该检测技术很难实现每种菌的活菌计数REF_Ref28684\n\h[9]，而且装置昂贵，测试条件苛刻，不易实现快速准确地检测活菌总数。1.3.4荧光法CalceinUltraGreen™AM是一种新型荧光染料，可用于标记和监测活细胞。该方法利用新型荧光染料的荧光特性及其在活细菌细胞内稳定的反应特性，根据荧光染料的光谱特性测定其荧光强度值，建立荧光强度值与活菌数的标准曲线。张宇婷REF_Ref28717\n\h[10]等用荧光法、比浊法、流式细胞计数法与平板计数法四种方法测定活菌数，实验表明上述建立的荧光法检测结果更接近于平板计数法的检测结果，而且重复性、稳定性和准确性更好。但由于该染色条件是用于染色动物细胞，目前应用该染料检测活菌数的相关文献鲜有报道，技术的成熟性未得到验证。1.3.5MTT法快速检测技术噻唑蓝[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoli-umromide，MTT]法，其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性黄色的四甲基偶氮蓝(MTT)还原为水不溶性的蓝紫色结甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，根据甲瓒生成量与活细胞数量的关系，测定相应的OD值，从而间接获得活细胞数量REF_Ref28759\n\h[11]。该法具有特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好、操作简便、节省材料、无同位素污染，便于实验室开展应用等优点REF_Ref28825\n\h[12]，从而可以用于大部分细菌以及部分益生菌的活菌测定，简化操作过程的同时满足大批量样本的处理需求。但对于其他菌种，是否也适用MTT比色法还有待进一步研究。该法还存在一个不足之处--存在浓度下限，当菌体数量太低时，由于系统误差造成的数据偏差相对于测定结果非常显著，因而线性关系弱化，方法便不再适用REF_Ref28864\n\h[13]。1.3.6CCK-8法CCK-8法，CellCountingKit-8是一种较新型的活细胞计数方法。其原理类似与MTT法，CCK-8试剂被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，可直接进行测定，且因CCK-8试剂生成的甲臢物的数量与活细胞的数量呈正比，测定的OD值可以间接反应活细胞的数量REF_Ref28893\n\h[14]。相比于应用广泛的MTT法，CCK-8法存在着优势：生成的可溶性甲臜可以直接测定，操作更加方便快捷且安全；孵育时间较MTT法短，更加省时；目前已有实验REF_Ref28916\n\h[15]证明CCK-8法重复性好、灵敏度高，明显优于MTT法。但此法尚未在活性菌增殖或药物筛选中应用，故可以在不断改进和完善该方法下尝试采用其对活菌数量进行测定。1.3.7小结对于微生物制剂的质量控制上，建立一种操作简单、快速、准确并可反映细菌活性的细菌计数方法是非常必要的，故才不断出现如以上所述的各种创新方法。对比其余几种方法，比浊法操作相较于简单便捷，但测定结果没有其他仪器法准确；流式细胞技术、荧光法、MTT法和CCK-8法都是基于试剂染色或者与细胞发生反应而产生有色的产物来进行测定，流式细胞技术和MTT法都拥有准确性高、重复性好的优点，但这两种方法所使用的仪器设备价格高，相比之下，CCK-8法不仅准确度较高，而且成本低，操作简单。故本文选取了比浊法和CCK-8法对YL胶囊进行溶出度试验，旨在选出较为适宜该药物的溶出度试验方法。2材料与仪器2.1仪器见表1。表1实验仪器仪器型号生产厂家药物溶出度仪RCZ-8上海黄海药检仪器有限公司酶标仪synergyHT美国伯腾仪器有限公司pH计FiveEasyPlusMETTLERTOLEDO公司集团细胞培养板TCP010096GuangzhouJetBio-FiltrationCo.超声波清洗器SK720LHC上海科导超声仪器有限公司千分之一天平BS423S北京赛多利斯仪器系统有限公司紫外分光光度计UV-1800岛津企业管理（中国）有限公司冰箱BCD-535WGHSSEDS9海尔智家股份有限公司微孔滤膜10μm上海兴亚净化材料厂2.2试剂与试药见表2。表2实验材料材料批号来源空白YL胶囊20230101广东南芯医疗科技有限公司低浓度YL胶囊20230102广东南芯医疗科技有限公司高浓度YL胶囊20230104广东南芯医疗科技有限公司盐酸（分析纯）2021111123广东广试试剂科技有限公司磷酸三钠（分析纯）2020072073天津市致远化学试剂有限公司CCK-8试剂MA0218-Nov-30H广州瑞舒生物科技有限公司纯水20230311广州市屈臣氏食品饮料有限公司3方法3.1溶出介质的制备3.1.1模拟胃液的溶出介质0.1mol/L盐酸溶液配制方法：量取9mL的浓盐酸于烧杯中加入适量蒸馏水，用玻璃棒搅拌，使其混合均匀，待稀释的盐酸冷却后，沿玻璃棒注入1000mL的量瓶中，加入蒸馏水至刻度线，摇匀即可。溶液使用前进行15-20min的超声，以除去气泡。3.1.2模拟肠液的溶出介质0.1mol/L盐酸溶液配制方法：同3.1.1方法一致。0.2mol/L磷酸钠溶液配制方法：精密称取76.0248g磷酸三钠于烧杯中加入适量蒸馏水，用玻璃棒搅拌，使其溶解。沿玻璃棒注入1000mL的容量瓶中，加入蒸馏水定容，摇匀。pH=6.8的磷酸盐缓冲溶液配制方法：取0.1mol/L盐酸溶液和0.2mol/L磷酸钠溶液按3:1混合均匀，必要时用0.1mol/L盐酸溶液和0.2mol/L磷酸钠溶液调节pH值至6.8，在37±0.5℃温度下保存。使用前进行15-20min的超声，以除去气泡。4溶出度试验条件的考察4.1溶出度试验方法的选择取待测胶囊6粒，根据不同的方法分别放入六杯溶出杯中，设定不同溶出度试验方法的条件，按仪器使用流程操作，对比胶囊在篮法和小杯法的溶出情况。由于胶囊为肠溶胶囊，需经历两种不同的溶出介质的溶出，观察在酸中和缓冲液中的溶出情况。4.1.1篮法取待测胶囊6粒和空白胶囊1粒分别投进转篮中，照溶出度与释放度测定法（中国药典2020年版四部通则0931第一法）进行溶出度试验。分别量取规定量的0.1mol/L盐酸溶液置各大溶出杯中，待溶出介质温度恒定在37±0.5℃，转数为每分钟100转，启动仪器，依法操作，经2小时后取样，吸取溶出液5mL于安瓿中，另外吸取溶出液5mL过滤后置于EP管中。按实验设定的各方法测定，得出每粒的酸中溶出情况。上述各溶出杯酸液中加入温度为37±0.5℃规定量的0.2mol/L磷酸钠溶液，继续运转60min，于140min、160min、180min取溶出液5mL于安瓿中，另外吸取溶出液5mL过滤后置于EP管中。按实验设定的各方法测定，得到每粒的缓冲液中溶出情况。4.1.2小杯法取待测胶囊6粒和空白胶囊1粒分别放入沉降篮中，照溶出度与释放度测定法（中国药典2020年版四部通则0931第三法）进行溶出度试验。溶出介质的体积可选用250ml或100ml。除另有规定外，分别量取规定量的0.1mol/L盐酸溶液置各溶出杯内，实际量取的体积与规定体积的偏差应在±1%范围之内，待溶出介质温度恒定在37℃±0.5℃，取待测胶囊6粒分别投入溶出杯中，注意避免胶囊表面产生气泡，立即按各品种项下规定的转速50rpm启动仪器，2小时后在规定取样点吸取溶出液适量。按实验设定的各方法测定，计算每粒的酸中溶出量。弃去上述各溶出杯中酸液，立即加入规定量的温度为37℃±0.5℃的磷酸盐缓冲液（pH=6.8），继续运转60分钟，更换使用玻棒进行人工搅拌至药物分散均匀，在规定取样点吸取溶出液适量，经孔径10μm的滤膜滤过，自取样至滤过应在30秒内完成。按实验设定的各方法测定，计算每粒的缓冲液中溶出量。结果发现篮法的溶出介质体积较大导致测出的吸光度值较低，容易造成误差大，不易得出相适应的标准曲线，同时材料消耗较大。最后确定使用小杯法，浓度适宜。4.2介质的选择根据溶出度与释放度测定法（中国药典2020年版四部通则0931），肠溶制剂通常要进行酸中溶出量和缓冲液中溶出量的测定，酸中溶出时使用的溶出介质为了模拟胃液一般采用0.1mol/L的盐酸溶液，缓冲液中溶出时使用的溶出介质为了模拟肠液一般有两种方式：①在原来酸液加入适量0.2mol/L的磷酸钠溶液，调节pH至6.8；②直接弃去原酸液，更换为相同体积的新鲜配制的pH=6.8的磷酸盐缓冲液。本实验采取的为后者，使用该溶出介质具有操作简便，误差小，准确高的特点。4.3介质体积的选择根据溶出度与释放度测定法（中国药典2020年版四部通则0931），浆法的溶出杯为1000ml杯状容器，必要时溶出介质可减少至500ml。小杯法的溶出杯则为250ml杯状容器，通常溶出介质体积采用250ml，必要时溶出介质可减少至100ml。实验对比高浓度胶囊于250ml和100ml体积的溶出介质中的溶出情况，结果为于250ml的吸光度均值约0.158，于100ml的吸光度均值约0.355。表明采用100ml的溶出体积成本低，且测定数值在0.2-0.8范围内，测定较为准确，故该溶出体积选用100ml。4.4CCK-8试剂加入量的选择根据CCK-8试剂的使用说明书，为筛选出适宜的CCK-8试剂加入量，选取了三个不同试剂终浓度进行对比。取单粒低浓度YL胶囊置于250ml37℃±0.5℃的磷酸盐缓冲液（pH6.8）中，搅拌至完全溶出。按照以下三种方法对溶出液进行操作：①吸取50μl的溶出液，加入100μl的稀释10倍的CCK-8试剂，混匀，此时CCK-8试剂终浓度为6.66%；②吸取100μl的溶出液，加入50μl未稀释的CCK-8试剂，混匀，此时CCK-8试剂终浓度为33.33%；③吸取100μl的溶出液，加入100μl未稀释的CCK-8试剂，混匀，此时CCK-8试剂终浓度为50.00%。结果见表3。表3不同浓度的CCK-8放置不同时间的OD值CCK-8浓度6.66%33.33%50.00%0.5h0.0520.1790.1911h-0.1820.1941.5h-0.1850.1972h-0.1850.1993h-0.1890.20318h-0.2210.236由上表可见，CCK-8试剂终浓度在6.66%且放置半小时后，OD值低至0.051，故不采用方法①。而方法②和③结果显示，两种终浓度的OD值均大于0.100，易于测得，且CCK-8的终浓度从33.33%增大到50.00%其OD值增大不明显，CCK-8试剂的加入剂量应为33.33%。4.5酶标仪测定波长的选择根据CCK-8试剂的使用说明书，为筛选出适宜的测定波长，选取了三个不同波长进行对比。取单粒高浓度YL胶囊置于250ml37℃±0.5℃的磷酸盐缓冲液（pH6.8）中，搅拌至完全溶出。取5份100μl的溶出液，各加入50μl的CCK-8试剂，避光孵化1h后，考察450nm、562nm和600nm处的OD值。结果见图4-1。图4-1不同波长下测定高浓度胶囊的OD值由上图可见，450nm处测得的OD值明显比562nm和600nm处的OD值要大，即CCK-8试剂与活菌反应产生的甲臜在450nm处测定敏感度最高，故选用450nm的波长测定。4.6孵化时间的选择根据CCK-8试剂的使用说明书，为筛选出适宜的孵化时间，选取了六个不同时间进行对比。取单粒低浓度YL胶囊置于250ml37℃±0.5℃的磷酸盐缓冲液（pH6.8）中，搅拌至完全溶出。取100μl的溶出液，加入50μl的CCK-8试剂，避光孵化0.5h、1h、1.5h、2h、3h和18h后，在450nm处测定其OD值。结果见图4-2。图4-2加入CCK-8试剂后不同孵化时间的OD值由上图可见，OD值随着时间的增长而变大，在前3小时OD值与时间显线性关系，基于CCK-8试剂的建议孵育时间2-4h，故选用3h作为孵育时间。4.7紫外分光光度计测定波长的选择根据胶囊前期制备所提供的测定波长600nm，按照4.8.2对空白胶囊和高浓度胶囊的过滤后的溶出液进行全波长扫描，结果见图4-3和图4-4。结果显示，在可见光波长400-760nm处，待测胶囊溶出液有明显吸收值，而空白胶囊几乎没有吸收，故选择600nm是合理的。4.8含量测定方法学验证4.8.1专属性试验取1粒空白胶囊置于装有100mL0.1mol/L盐酸溶液的溶出杯中，1粒高浓度胶囊置于装有100mL0.1mol/L盐酸溶液的溶出杯中，以50rpm转速，37℃的条件下溶出2h后更换相同体积的37℃±0.5℃的磷酸盐缓冲液（pH6.8），继续运转60分钟，取其溶出液，经孔径10μm的滤膜滤过。以pH=6.8的磷酸盐缓冲液作空白对照，对空白胶囊和高浓度胶囊的过滤后的溶出液进行全波长扫描。结果见图4-3、图4-4。图4-3胶囊溶出液的全波长扫描图4-4胶囊溶出液的500-700nm处扫描由上图可见，在600nm处，空白胶囊无明显的吸收，而高浓度胶囊的吸光度值明显比空白胶囊的值要大，表明空白胶囊在选用的波长上对含药物的胶囊吸光度值无影响或不干扰。即可采用测定600nm处的波长对供试品胶囊进行吸光度的测定。4.8.2稳定性试验根据4.1.2的方法，取一粒高浓度胶囊置于装有100mL0.1mol/L盐酸溶液的溶出杯中，以50rpm转速，37±0.5℃的条件下溶出2h后更换相同体积的37℃±0.5℃的磷酸盐缓冲液（pH6.8），继续运转60分钟，取其溶出液，经孔径10μm的滤膜滤过。测定药物完全溶出后0h、18h和24h在600nm处的吸光度值。结果见图4-5。图4-5溶出液在不同时长600nm处的OD值由上图可见，在0h、18h和24h三个时间点测定的吸光度值无太大的变化，即溶出后马上测定以及放置一段时间后测定无明显差别，且三者的RSD小于15.0%，表明该法测定在24h内具有较好的稳定性。5测定方法的筛选5.1实验原理5.1.1比浊法的实验原理比浊法是测定总菌数常用而又比较简便的方法，它的原理是在微生物液体培养以后，随着活菌增多，培养液浑浊度也随之升高，再利用分光光度计对某一特定波长进行测REF_Ref28622\n\h[7]，测定值能在一定程度上反映菌数。5.1.2CCK-8法的实验原理CCK-8法，CellCountingKit-8(CCK-8法)是一种较新型的活细胞计数方法。其原理类似与MTT法，CCK-8试剂被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，可直接进行测定，且因CCK-8试剂生成的甲臢物的数量与活细胞的数量呈正比，测定的OD值可以间接反应活细胞的数量REF_Ref28759\n\h[11]。5.2方法5.2.1比浊法的测定方法根据4.1中的小杯法，采用250ml溶出体积对空白YL胶囊和高浓度YL胶囊进行溶出，取空白和不同浓度胶囊的不同时段的溶出液于96孔板中，在酶标仪450nm处测定其OD值；或根据4.1中的小杯法，分别采用250ml和100ml的溶出体积对空白YL胶囊和高浓度YL胶囊进行溶出，取120min、180min已过滤的溶出液，取空白和不同浓度胶囊的不同时段的溶出液于比色皿中，在紫外分光光度计下测定600nm处的OD值。5.2.2CCK-8法的测定方法根据4.1中的小杯法对单颗空白YL胶囊和单颗高浓度YL胶囊分别进行溶出，取180min溶出液，用移液枪分别移取空白和不同浓度胶囊不同时段的溶出液各5份100μl于96孔板，分别加入50μl的CCK-8试剂，混匀，37℃避光孵育，于3h后在酶标仪450nm处测定其OD值。5.3实验结果5.3.1比浊法的测定结果根据5.2.1中的方法，在酶标仪450nm处测定其OD值。结果见表4、表5。根据5.2.1中的方法，在紫外分光光度计的600nm处测定其OD值。溶出体积为250ml的结果见表6、表7;溶出体积为100ml的结果见表8、表9。表4120min溶出液的OD值空白123456OD10.0390.0390.0370.0390.0390.0400.039OD20.0390.0400.0370.0390.0400.0380.038OD30.0380.0390.0400.0380.0390.0380.039OD40.0390.0390.0360.0370.0400.0380.037OD50.0370.0380.0390.0360.0380.0370.036AVERAGE0.0380.0390.0380.0380.0390.0380.038RSD0.0230.0180.0430.0340.0210.0290.034减去空白-0.001-0.001-0.0010.0010.000-0.001表5180min溶出液的OD值空白123456OD10.0530.0550.0710.0560.0570.0640.057OD20.0500.0540.0530.0550.0580.0590.057OD30.0490.0540.0510.0550.0560.0590.058OD40.0480.0530.0530.0530.0560.0590.056OD50.0490.0510.0540.0530.0560.0570.058AVERAGE0.0490.0530.0560.0540.0570.0600.057RSD0.0390.0280.1500.0250.0160.0440.015减去空白-0.0040.0070.0050.0070.0100.007表6120min溶出液600nm处OD值123456OD10.0020.0000.0020.000-0.001-0.001OD20.0020.0000.0020.000-0.001-0.001OD30.0020.0000.0020.000-0.001-0.001EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)0.0020.0000.0020.000-0.001-0.001AVERAGE0.000表7180min溶出液600nm处OD值123456OD10.1740.1470.1580.1410.1440.187OD20.1740.1470.1570.1410.1440.188OD30.1740.1470.1560.1420.1440.188EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)0.1740.1470.1570.1410.1440.187AVERAGE0.158STDEV0.018RSD11.7%表8120min溶出液600nm处OD值123456OD1-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000OD2-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000OD3-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000AVERAGE0.000表9180min溶出液600nm处OD值123456OD10.4020.3880.3150.3980.3320.296OD20.4020.3890.3150.3970.3330.295OD30.4020.3900.3150.3970.3340.295EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)0.4020.3890.3150.3970.3330.296AVERAGE0.355STDEV0.046RSD13.0%结果可知，在酶标仪下测定溶出液的OD值均非常小，其结果无法准确地表明溶出液的浑浊程度，故不使用该法。而使用紫外分光光度法，在模拟胃液的2h内，待测胶囊无论在250ml或100ml溶出介质中进行溶出，其溶出液在600nm处基本无吸收，即表明YL胶囊在胃的环境下不溶出；在模拟肠液的1h内，胶囊壳变形、破裂，逐渐溶解，暴露出内容物，溶液逐渐变浑浊。溶出液在600nm处有吸收，且溶出体积越小吸光度值越大，即表明YL胶囊在肠的环境下完全溶出，六杯溶出液的RSD＜15%，证明其重复性较好，故可以采用该仪器法对溶出液进行测定。5.3.2CCK-8法的测定结果根据5.2.2测定溶出液在450nm处的OD值。结果见表10。表10180min溶出液450nm测定OD值编号空白高浓度对照10.0770.1890.07320.0810.1860.07530.1020.2270.07740.1520.251-50.1630.218-AVERAGE0.1150.2140.075结果可知，在模拟肠液的1h内，胶囊逐渐崩解，取180min溶出液与CCK-8反应，溶液从浅粉色经避光孵育后呈棕黄色，在450nm处有较大的OD值，即表明YL胶囊在肠液的环境下溶出且溶出液中存在活菌。6讨论溶出介质是溶出度试验的其中一个重要要素，溶出介质的pH值影响药物的溶出效果。实验选取如4.2所述的两种不同方法制备模拟肠液，方法①在溶出杯中直接按比例混合盐酸与磷酸钠溶液，无法保证让平行六杯溶出杯中的溶液同时达到pH=6.8，且操作繁杂，容易造成误差。相比之下方法②，使用当天新鲜配制的pH=6.8的磷酸盐缓冲液，操作较为简便，确保溶出杯中的溶液相同，能在一定程度降低在更换溶出液时的误差。在进行CCK-8法染色时，试剂的浓度是影响显色的一个因素。设定三个三个试剂终浓度，调整其加入量。CCK-8试剂终浓度在6.66%时，OD值非常低，推测此时CCK-8浓度太低，试剂与细胞反应不充分，以致难以显色；当CCK-8试剂终浓度在33.33%时，OD值大于0.1，显色明显。但为确保该浓度下CCK-8未饱和，将CCK-8终浓度加大到50.00%，可见OD值增加不明显，即表明在终浓度为33.33%时CCK-8试剂不存在饱和现象，且为了节省成本，最终确定CCK-8试剂的加入量为50μl。在进行吸光度值测定时，直接用紫外分光光度计测定其OD值，或用酶标仪直接测定其OD值，发现空白胶囊的值较低浓度的值大，推测空白胶囊和待测胶囊的辅料自身存在吸光度值，会对测定产生一定的干扰。为除去辅料的干扰，相关研究人员使用孔径为0.45、2、5、10μm的滤膜对溶出液进行过滤，综合实验数据，可以得到滤纸孔径大于5μm，并不会造成活菌数停留在滤膜上，活菌的通过率达100%，而辅料中其他较大颗粒会因为滤纸孔径被吸付著。故本实验采用10μm的滤膜以消除自身辅料对测定的干扰。YL胶囊的紫外分光光度计测定中，实验建立的CCK-8法和比浊法均能表现YL胶囊的溶出情况。基于实验结果，对比两种方法，CCK-8相对于比浊法操作更加复杂，耗时相对较长，且成本相对较高，所以选择了后者。本实验仅初步建立了YL胶囊的溶出度试验的方法，实验结果并不能直接呈现溶出度及其溶出的活菌数。但有相关人员研究选取OD值范围在0.1-1.0间的YL菌液，进行稀释涂布，统计平板菌落计数结果，进一步深入研究得出YL菌液的OD值在0.1~1.0的范围内，其OD值与对应的活菌数的相关性呈线性关系，其关系表现为：Y=14.216*X-1.6136(单位每毫升活菌数为10^8CPU/mL)，即随着OD值的增大，其对应的活菌数也升高。OD值与活菌数之间的关系考察，说明了本实验确立的比浊法的可行性与准确性。可根据该考察，进一步完善YL胶囊的溶出度试验及其含量测定方法，补充相应的方法学考察后，可以将其应用于大批量胶囊的溶出度试验，为YL胶囊的质量评价提供参考，保证药物的质量。7结论7.1体外溶出试验通过对溶出度试验条件的筛选，适合YL胶囊溶出度试验的方法为：以0.1mol/L盐酸溶液100mL作模拟胃液，以pH=6.8的磷酸盐缓冲液100mL作模拟