白芍标准汤剂的化学成分鉴定及其质量传递规律研究

白芍标准汤剂的化学成分鉴定及其质量传递规律研究摘要目的：系统研究白芍水煎液的化学物质基础，建立同时适用于白芍饮片及其标准煎液的多指标含量测定方法，结合转移率指标揭示两者之间的质量传递规律。方法：采用高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-OrbitrapHRMS）对白芍标准汤剂的化学成分进行鉴别，根据化合物的质谱信息，将其与标准品、标准谱图库及文献内容比对，标准谱图库可以与参考文献进行比对,以达到对药物的化学信息进行更迅速、精确地鉴定。采用高效液相色谱-二极管阵列检查方法（UPLC-PDA）建立白芍药材及其标准汤剂的含量测定方法，测定三批白芍饮片及其标准汤剂中芍药苷、芍药内酯苷的质量转移规律。结果：鉴定了白芍标准汤剂中的33个化学成分，建立了同时测定芍药苷和芍药内酯苷的UPLC含量测定方法，可同时适用于白芍饮片其标准汤剂的检测。芍药苷从白芍饮片到白芍标准煎液的转移率为70.70%～80.33%，芍药内酯苷从白芍饮片到白芍标准煎液的转移率为11.65%～24.67%。结论：本研究通过液质联用技术鉴定了白芍标准煎液的化学物质基础，建立了适用于白芍饮片及其标准汤剂中含有的芍药苷和芍药内酯苷的含量测定方法，明确了二者之间的质量传递规律，为含白芍标准煎液制剂的全程质量控制和质量评价方法的建立提供参考。关键词白芍；液质联用；质量传递规律；标准煎液StudyonchemicalcompositionidentificationandqualitytransferlawofpaeonialactiflorastandarddecoctionAbstractObjective:Tosystematicallystudythechemicalbasisofpaeonialactifloradecoction,establishamulti-indexcontentdeterminationmethodsuitableforpaeonialactifloradecoctionanditsstandarddecoction,andrevealthemasstransferlawbetweenthembycombiningthetransferrateandtheextractionrate.Methods:UHPLC-Q-OrbitrapHRMSwasusedtosystematicallyidentifythechemicalconstituentsofpaeonialactifloradecoction.AccordingtotheMS1andMS/MSinformationofthecompounds,andcomparedwiththestandard,standardspectrallibraryandreferences,thechemicalinformationofthedrugwasquicklyandaccuratelyidentified.UPLC-PDAwasusedtoestablishthecontentdeterminationmethodofpaeonialactifloradecoctionpiecesandpaeonialactiflorastandarddecoction,andthemasstransferrulesofpaeoniflorinandalbiflorininthreebatchesofpaeonialactifloradecoctionpiecesandtheirstandarddecoctionweredetermined.Results:33chemicalconstituentsinthestandarddecoctionofpaeonialactifloraweresystematicallyidentified,andaUPLCmethodforsimultaneousdeterminationofpaeoniflorinandalbiflorinwasestablished,whichcouldbeappliedtothedetectionofpaeonialactifloradecoctionanditsstandarddecoction.Thetransferrateofpaeoniflorinfrompaeonialactifloradecoctionpiecestopaeonialactiflorastandarddecoctionwas70.70%-80.33%,andthetransferrateofalbiflorinfrompaeonialactifloradecoctionpiecestopaeonialactiflorastandarddecoctionwas11.65%-24.67%.Conclusion:Inthisstudy,thechemicalbasisofthestandarddecoctionofpaeonialactiflorawasidentifiedbyliquidchromatography-massspectrometry,andthecontentdeterminationmethodsofpaeoniflorinandalbiflorinsuitableforpaeonialactifloradecoctionpiecesandtheirstandarddecoctionswereestablished.Thequalitytransferlawbetweenthetwowasclarified,whichprovidedareferencefortheestablishmentofthewholequalitycontrolandqualityevaluationmethodofthestandarddecoctionofpaeonialactiflora.KeywordspaeonialactifloraUPLC-MSqualitytransferlawstandarddecoction

目录1前言 .1.1鞣质类化学成分鉴定鞣质类结构大多数由没食子酸或其衍生物与葡萄糖结合而成，没食子酸碎片[Gallicacid-H]-可用于此类成分的靶向识别（见图2）。在保留时间为6.43min下，准分子离子峰m/z169.013[M-H]-在负离子模式下，脱去-CO2后形成特征碎片m/z125，再脱去-H2O形成m/z107-等碎片峰，根据元素组成分析，该化合物分子式C7H6O5，相对分子质量理论值为169.0143，实测值为169.013，据此推测该化合物为没食子酸。常见的中药如菝葜、白蔹、半夏、赤芍、牡丹皮、木瓜、山茱萸都含有该成分。图2单宁化合物可能的裂解规律4.1.2单萜苷类化学成分鉴定单萜苷结构通常由苯甲酸基、α-蒎烯基和葡萄糖基三部分构成，在HCD裂解过程中通常断裂三个部分直接相连的化学键。以芍药苷为例，其分子离子峰m/z479.1559[M-H]-，裂解过程逐步产生苯甲酸[C7H5O4-]和α-蒎烯[C9H9O3-]的特征碎片（见图3）。图3单萜苷类化合物可能的裂解规律4.2白芍质量传递规律研究4.2.1方法学考察4.2.2专属性试验测得样品色谱图（见图4）。检测空白溶液时，未发现与对照品及白芍药材中芍药苷、芍药内酯苷成分保留时间相同的色谱峰，表明空白溶液对这两种待测成分均没有干扰，说明该方法的专属性良好。

1:芍药内酯苷；2：芍药苷A:空白50%乙醇；B:混标溶液；C：白芍饮片供试品；D:白芍标准煎液供试品图4白芍指纹图谱4.2.3线性关系考察根据线性回归方程（见图5）和相关系数（见表5）可以得知，芍药苷和芍药内酯苷在实验条件下表现出良好的线性关系。指标成分线性关系R2线性范围芍药苷y=13948x+551660.99906.563μg/ml~210.000μg/ml芍药内酯苷y=10145x+433800.99913.344μg/ml~107.000μg/ml表5芍药苷、芍药内酯苷的线性关系及线性范围（b）（a）（μV*s（b）（a）（μV*s）（μV*s）（μg/ml）（μg/ml）图5芍药苷（a）、芍药内酯苷（b）的线性关系

4.2.4精密度考察对于同一供试品溶液进行连续进样6次，在实验条件下，芍药苷和芍药内酯苷的峰面积RSD分别为0.15%和0.14%，表明仪器具有良好的精密性（见表6）。表6精密度考察指标成分芍药内酯苷芍药苷111833651503121182185157523118679516216411859651642251183605145676118549516164RSD0.15%0.14%4.2.5重复性考察同一样品，制备6份供试品溶液，测定其中的芍药苷、芍药内酯苷含量。结果显示，供试品中芍药苷、芍药内酯苷含量的RSD（n=6）分别为0.74%、0.55%，表明供试品溶液制备方法重复性良好（详见表7）。表7重复性考察指标成分芍药内酯苷芍药苷111833651503121188695198213119295512713411721251863651173895138986119058514052RSD0.74%0.55%

4.2.6稳定性考察供试品溶液室温存放30小时后，供试品中芍药苷、芍药内酯苷含量峰面积的RSD分别为0.61%、0.43%，表明供试品溶液在24小时内具有较好的稳定性。（见表8）表8稳定性考察指标成分芍药内酯苷芍药苷0h1183365150314h11908251240410h11895151497918h11811151487624h11770951724630h117176510962RSD0.61%0.43%4.2.7中间精密度考察 3位不同实验人员分别制备5份供试品溶液，芍药苷、芍药内酯苷的峰面积RSD分别为0.69%和0.47%，小于3%,说明方法中间精密度好（见表9）。表9中间精密度考察指标成分芍药内酯苷芍药苷111833651503121176975137433119117510035411775651822451177925173496117792516113711863251704081184195154439119235509881101186445145671111909351374312117602519924131192835150311411944851436115118087516267RSD0.68%0.47%4.2.8加样回收率考察芍药苷、芍药内酯苷的加样回收率在99.81%～103.26%，RSD分别为3.42%，1.57%，结果表明本研究所建立的分析方法准确性良好（见表10）。表10加样回收率考察名称比例样品量（μg）加标量（μg）实际测得量（μg）回收率平均回收率芍药内酯苷1:17.397.3914.98102.76%98.20%1:17.397.3914.5897.33%1:17.397.3914.6197.70%1:1.27.398.86816.0296.80%1:1.27.398.86816.1398.22%1:1.27.398.86816.2599.92%1:0.87.395.91213.58103.75%1:0.87.395.91212.9395.01%1:0.87.395.91213.40101.35%芍药苷1:132.9732.9765.94100.01%98.38%1:132.9732.9765.8899.82%1:132.9732.9765.4798.58%1:1.232.9739.56471.2195.99%1:1.232.9739.56473.44102.74%1:1.232.9739.56473.00101.40%1:0.832.9726.37659.44100.28%1:0.832.9726.37658.1296.29%1:0.832.9726.37659.1399.35%4.2.2白芍质量传递结果将所得各自芍药苷及芍药内酯苷色谱峰面积代入线性方程即得质量传递结果（见表11）。芍药内酯苷质量分数转移率芍药苷质量分数转移率白芍粗粉白芍标准煎液白芍粗粉→白芍水煎液白芍粗粉白芍标准煎液白芍粗粉→白芍水煎液浙江磐安白芍1.406%0.185%13.13%1.166%0.824%70.70%安徽亳州白芍0.953%0.161%24.67%2.487%1.866%75.01%四川中江白芍1.527%0.178%11.65%1.198%0.962%80.33%表11白芍质量传递结果5结论本次研究以芍药苷、芍药内酯苷两个化学成分作为指标成分，是基于化学成分特有性而决定，白芍作为毛茛科芍药属植物，芍药苷类为该属植物最为主要的单萜苷类化合物，芍药苷是芍药属植物的特征性成分之一，具有重要的化学分类学意义，它是芍药属从毛茛科中独立出来成为一个独立科和独立属的重要证据之一；是基于化学成分有效性而决定，其有效性主要从药性和药效两方面入手，白芍性苦、酸，微寒，归肝、脾经，苦寒药物主要以生物碱及苷类成分为物质基础，其中白芍所含有的白芍苷类，是其苦寒性味的来源，白芍所含有的芍药总苷类是其具有保肝以及止痛等作用的物质基础，这与传统药效认为白芍具有柔肝止痛功能相同；是基于化学成分可测性而决定，2020年版的《中国药典》明确规定了芍药苷的测量方法及限度要求，综上所述，白芍单萜类化合物与白芍的药效密切相关，因此作为主要的药效物质基础，可被选为指标成分。本次研究以芍药苷和芍药内酯苷为指标成分，建立了一种专属性的测定方法，这为白芍的质量评价标准的建立提供了科学依据。本次研究采用UPLC的方法对3批来自不同地区的白芍药材及其标准汤剂进行含量测定，并计算其各自的芍药苷、芍药内酯苷的质量转移规律。在此之前，首先建立指标成分含量测定的方法，确定其色谱条件，对照品及供试品溶剂的选择与溶液制备的方法，再进行方法学的考察，确定方法的可行性，在确定了方法具有良好的专属性、稳定性等的基础上，构建了白芍的指纹图谱，标定了2个共有峰，指认为芍药苷和芍药内酯苷，并根据其共有峰相对峰面积差异，开展指标成分转移率指标参数的计算。结果表明，芍药苷的转移率为70.70%～80.33%，芍药内酯苷的转移率为11.65%～24.67%，由于芍药内酯苷酯键存在，使得其在水中溶解度降低，转移率比芍药苷的低。此次研究中使用超高效液相色谱-二极管阵列检查方法(UPLC-PDA)对白芍样品进行全波长的扫描，UPLC-PDA是一种高效液相色谱技术，能够同时分离、定量、鉴定物质。PDA检测器是一种分光光度计，它可以进行快速而准确的多波长分析，大大提高了分析样品的效率和准确性。在UPLC-PDA检测过程中，样品通过色谱柱进行分离，通过PDA检测器检测每个样品组分在不同波长下的光谱。检测器可在各种波长下进行化合物检测，从而生成一个光谱图。这个光谱图可以用于定性和定量分析，因为每个化合物的光谱图是唯一的。通过比较白芍样品的光谱图与标准样品或者数据库中的光谱图，可以确定样品中的化合物种类和含量，并且在传统的HPLC中等的检测灵敏度进一步改善。综合比较下，230nm处光谱的基线能更稳定，色谱峰数目更多，吸收强度更均匀。因此，选择230nm作为检测波长。

6参考文献马继兴.神农本草经[M].北京:华夏出版社,2020:88,186.国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京:中国医药科技出版社,2020:108.徐佳新,许浚,曹勇,等.中药白芍现代研究进展及其质量标志物的预测分析[J].中国中药杂志,2021,46(21):5486-5495.BIXX,HANL,QUTG,etal.Anti-inflammatoryeffects,SAR,andactionmechanismofmonoterpenoidsfromRadixPaeo-niaeAlbaonLPS-stimulatedRAW264.7cells[J].Molecules,2017,22(1):1.吴丽,王丽丽,费文婷,等.芍药苷和芍药内酯苷对小鼠疼痛模型的镇痛作用及对β-EP、PGE2的影响[J].中华中医药杂志,2018,33(3):915.WANGR,XIONGAZ,TENGZQ,etal.RadixPaeoniaeRubraandRadixPaeoniaeAlbaattenuateCCl4-inducedacuteli-verinjury:anultra-performanceliquidchromatography-massspectrometry(UPLC-MS)basedmetabolomicapproachforthepharmacodynamicstudyoftraditionalChinesemedicine[J].Molecules,2016,23(1):1.ZHUYL,WANGLY,WANGJX,etal.P