课件速览-细胞色素C洗脱液的盐析

项目二细胞色素C的生产任务六细胞色素C洗脱液的盐析严格遵守GMP和执行细胞色素C盐析岗位GMP，以人造沸石的25%硫酸铵洗脱液为原料，通过加入固体硫酸铵到45%，使杂蛋白析出，过滤后收集到红色透亮的细胞色素C滤液。规范填写生产记录。任务描述细胞色素C洗脱液的盐析2任务支撑（一）细胞色素C盐析的目的与作用

盐析法可将加盐后溶解物质与析出沉淀分离，还阶梯式提高盐浓度，可用于将不同盐浓度下析出的蛋白质分开。在前面的操作单元中，对细胞色素C的提取液分别进行了等电点沉淀除杂以及人造沸石吸附除杂，初步地对提取液中的杂蛋白进行分离。本任务利用固体硫酸铵对细胞色素C与杂蛋白进行分离。3细胞色素C洗脱液的盐析（二）盐析法4盐析法又称中性盐沉淀法，其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。盐析法原理（1）中性盐离子破坏蛋白质表面水膜

在蛋白质等生物大分子表面分布着亲水基团，如-COOH、-NH2-OH等。这些基团与极性水分子相互作用形成水膜，中性盐抢夺蛋白质分子结合的自由水，水化膜层减弱乃至消失，暴露出蛋白质的疏水区域，蛋白质的溶解度也会随之减小。（2）中性盐离子中和蛋白质表面电荷

盐离子与蛋白质表面具有相反电荷的离子基团结合形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，蛋白质分子之间的排斥力作用减弱，从而使蛋白质分子之间聚集而沉淀析出。（二）盐析法盐析法原理5（二）盐析法用盐选择盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济★

盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂（1）价廉（2）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好（4）不易引起蛋白质变性6盐析影响因素（二）盐析法盐的饱和度（离子强度）影响蛋白质盐析的重要因素不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加pH值在等电点时，蛋白质溶解度最小容易沉淀析出蛋白质浓度在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀但浓度过高也容易引起其他杂蛋白的共沉作用温度一般可在室温下进行，至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件7硫酸铵加入方式（二）盐析法1.加入固体硫酸铵法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况在粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来应注意添加硫酸铵的速度，通常是在搅拌条件下，以少量多次方式加入89为方便起见，在室温及℃时所需固体硫酸铵的量可直接查表（二）盐析法室温下由S1提高到S2时每升加固体硫酸铵的克数10（二）盐析法为方便起见，在室温及℃时所需固体硫酸铵的量可直接查表0℃下由S1提高到S2时每100ml加固体硫酸铵的克数溶液的原始饱和度/%饱和度在0℃时所达到硫酸铵饱和度（%）20253035404550556065707580859095100在100毫升中欲加固体硫酸铵的克数010.613.416.419.422.625.829.132.636.139.843.647.651.655.960.365.069.757.910.813.716.619.722.926.229.633.136.840.544.448.452.657.061.566.2105.38.110.913.916.920.023.326.630.133.737.441.245.249.353.658.162.7152.65.46.211.114.117.220.423.727.130.634.338.142.046.050.354.759.22002.75.58.311.314.317.520.724.127.631.234.938.742.746.951.255.725

02.75.68.411.514.617.921.124.528.031.735.539.543.647.852.230

02.85.68.611.714.818.121.424.928.532.336.240.244.548.835

02.85.78.711.815.118.421.825.429.132.936.941.045.340

02.95.88.912.015.318.722.225.829.633.537.641.845

02.95.99.012.315.619.022.626.330.234.238.350

03.06.09.212.515.919.423.026.830.834.855

03.06.19.312.716.119.123.527.331.360

03.16.29.512.916.420.123.927.965

03.16.39.713.216.820.521.470

03.26.59.913.417.120.975

03.26.610.113.717.480

03.36.710.313.985

03.46.810.590

03.47.095

03.5硫酸铵加入方式（二）盐析法2.加入饱和溶液法--加硫酸铵饱和溶液适用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况，多用于实验室或小规模生产时优点可防止溶液局部过浓，沉淀分离效果比较好缺点是易导致待处理溶液体积增大，待分离的生物分子溶解度相对增加。1112选择适宜饱和度采用分步盐析盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH用磷酸缓冲液在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤（二）盐析法注意事项05040201生产前准备准备硫酸铵离

心清场任务实施1303盐

析细胞色素C洗脱液的盐析1.确认与填写检查记录确认是否有前批清场合格证副本，确认生产环境、卫生和设备器具是否符合要求；填写细胞色素C的盐析产前检查记录；领用原辅料和耗材，领用或配制生产用溶液（一）生产前准备14（二）准备硫酸铵15

准确计量洗脱液的体积，按照每100mL洗脱液加入20g硫酸铵的比例计算，得到需要的硫酸铵的质量，并填写记录。将吸附岗位生产的洗脱液置于适当容积的烧杯内，开启搅拌。在搅拌下分批缓缓加入硫酸铵固体，搅拌至溶液澄清停止，静置30min以上，有固体析出。（三）盐析2.盐析按照“准备硫酸铵”中计算得出的质量称取硫酸铵固体1.称量16（四）离心17用离心机处理盐析体系，收集上清液。目测上清液，应透亮，呈红色。（五）清场

检查、整理各项记录。规范地存放生产用试剂，清洗器具，维护设备，处置废物和废液，清洁、消毒工作台和洁净室。最后，填写清场合格证。注意：请在任务实施过程中规范填写《细胞色素C洗脱液的盐析操作记录》，不可补填和篡改！18知识学习反思与反馈学习成果实践操作考核与评价19拓展任务碱性蛋白酶的盐析20查阅资料，了解碱性蛋白酶的性质，理解实训中设置参数的依据。查阅设计《碱性蛋白酶的盐析沉淀操作记录》，在任务实施过程中同步填写。按照实训操作步骤，以碱性蛋白酶为实训对象，进行盐析沉淀操作，通过对酶质量的测定和收率计算，综合评价盐析沉淀的最适工艺条件。设计实操设计（一）任务描述21（二）实训材料1.材料、试剂碱性蛋白酶粗粉、硫酸铵和NaOH2.仪器设备高速冷冻离心机、离心管、电子天平、真空干燥箱、酸度计（或pH试纸）、移液吸管（或可调式移液器）、烧杯、搅拌棒和量筒。22（三）实训操作0504030201制备酶液配制溶液调节蛋白酶液pH固体硫酸铵的加入与盐析离心、干燥称量称取40g碱性蛋白酶粗粉，加入400mL40～50℃温水，在40℃水浴中浸泡并搅拌30min。用高速冷冻离心机离心，合并上清液称取24g氢氧化钠，于70mL水中溶解，加水稀释至100mL蛋白酶液用6mol/LNaOH调节pH至8.0～8.5，分别量取10mL于7只15mL离心管中加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%饱和度所需固体硫酸铵，缓慢搅拌加入酶液，全部溶解后静置5h左右，沉淀