真菌的实验诊断胡主任

关于真菌的实验诊断胡主任12真菌感染的危险因素：中心静脉插管 尿道插管广谱抗生素气管插管腹部外科肠胃外营养营养不良住院时间感染之前定殖第2页,共75页，2024年2月25日，星期天3医学重要的酵母菌分类SegalB,BowEJ,MenichettiF:InfectDisClinNAm2002;16:935-64

条件致病的酵母菌

念珠菌属

非念珠菌属白念珠菌

非白念珠菌热带念珠菌近平滑念珠菌光滑念珠菌克柔念珠菌季也蒙念珠菌葡萄牙念珠菌

隐球菌属新型隐球菌

毛孢子菌属白吉利毛孢子菌头状毛孢子菌

酵母属酿酒酵母

红酵母属第3页,共75页，2024年2月25日，星期天4

霉菌

曲霉菌属

非曲霉菌属烟曲霉非烟曲霉

黄曲霉黑曲霉土曲霉

镰刀霉

茄病镰刀霉 尖孢镰刀霉

赛多孢属

尖端赛多孢 多育赛多孢

接合菌

根霉属 毛霉属 根毛霉属 梨头霉属 小克银汉霉属

暗色孢霉

链格孢霉属

万氏霉属

双极菌属

弯孢属医学重要的霉菌分类SegalB,BowEJ,MenichettiF:InfectDisClinNAm2002;16:935-64第4页,共75页，2024年2月25日，星期天5诊断方法影像学组织病理学/细胞学培养血清学分子生物学方法：

PlateliaAspergillusELISAFungitellassayPCR（unavailable）传统的方法第5页,共75页，2024年2月25日，星期天6

TimeAxisofMethodsforDetectionofPulmonaryAspergillosisCTpositive

123456789101112131415chestX-rayantigenß-glucanculturehistologyPCRKamiMetal,ClinInfectDis2001;33:1504-12第6页,共75页，2024年2月25日，星期天7真菌病实验室诊断主要内容准确、快速检出真菌病原体真菌镜检真菌培养组织病理生理生化血清学方法分子生物学第7页,共75页，2024年2月25日，星期天8真菌感染的诊断直接涂片真菌培养组织病理＋真菌培养是“金标准”第8页,共75页，2024年2月25日，星期天9有意义的真菌培养标本非经口痰标本非插管尿标本血液或其他无菌体液(胆汁、胸腹水、脑脊液）第9页,共75页，2024年2月25日，星期天10直接镜检的浮载液和染色剂KOH-10~20%-皮肤标本Gramstain-真菌均为阳性Calcofluorwhite-荧光染色India-ink-墨汁染色LPCB-乳酸酚棉蓝Immunofluorescence-免疫荧光第10页,共75页，2024年2月25日，星期天11直接镜检对痰、窦道排泄物及气管冲洗液等标本直接镜检可以看到透明分支的菌丝、脓血或痰太粘稠用10％KOH处理后再进行镜检如果曲霉菌寄生与空气相通的器官中，镜检甚至可以看到曲霉头菌丝有隔，呈二叉型，45℃分枝。第11页,共75页，2024年2月25日，星期天12菌丝和孢子第12页,共75页，2024年2月25日，星期天13直接镜检——酵母细胞第13页,共75页，2024年2月25日，星期天14隐球菌病—直接镜检（墨汁染色）第14页,共75页，2024年2月25日，星期天15有意义的涂片结果机体内部标本如血液、腹水、CSF、脓肿穿刺液等新鲜尿液见到大量菌丝及孢子口腔、阴道、支气管灌洗液见到酵母样菌应作培养确定第15页,共75页，2024年2月25日，星期天16多细胞真菌形态sporehypha第16页,共75页，2024年2月25日，星期天17真菌培养第17页,共75页，2024年2月25日，星期天18真菌培养检查目的—提高病原体检出的阳性率，确定致病菌的种类。意义——发现肯定的致病原如新生隐球菌时，诊断即可确立。

—分离出条件致病菌如白念珠菌或烟曲霉，应结合临床情况进行判断。

—无菌部位如血液或脑脊液中分离出条件致病菌常提示肯定的感染，但对来自于脓、痰或尿的标本则应谨慎解释结果。但任何一株培养物都不应轻易视为污染菌。需结合直接镜检的结果，强调直接镜检与培养检查相结合的重要性。强调临床医师与实验室检验人员之间的相互联系。第18页,共75页，2024年2月25日，星期天19092第19页,共75页，2024年2月25日，星期天20区分酵母样或霉样菌落第20页,共75页，2024年2月25日，星期天21Aspergillusfumigatus-ColonialMorphology,Sabouraud葡萄糖琼脂培养基烟曲霉菌第21页,共75页，2024年2月25日，星期天22Aspergillusfumigatus-MicroscopicMorphology,100xLactophenolcottonblue(单列)分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、瓶梗、分生孢子第22页,共75页，2024年2月25日，星期天23Aspergillusflavus-在Sabouraud葡萄糖琼脂黄曲霉菌生长快黄色表面粉末状第23页,共75页，2024年2月25日，星期天24Aspergillusflavus-MicroscopicMorphology,100xLactophenolcottonblue黄曲霉菌(二列为主)分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、瓶梗、梗基、分生孢子第24页,共75页，2024年2月25日，星期天25Penicilliumspecies-ColonialMorphology,Sabouraudagar青霉属气生菌丝密毯状第25页,共75页，2024年2月25日，星期天26Penicilliumspecies-MicroscopicMorphology,400xLactophenolcottonblue青霉属(帚狀枝,分生孢子)第26页,共75页，2024年2月25日，星期天27Aspergillusniger-ColonialMorphology,Sabouraudagar黑曲霉菌(背面)第27页,共75页，2024年2月25日，星期天28Aspergillusniger-MicroscopicMorphology,100xLactophenolcottonblue(二列为主)分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、瓶梗、梗基、分生孢子第28页,共75页，2024年2月25日，星期天29真菌体外药敏试验第29页,共75页，2024年2月25日，星期天30真菌体外药敏试验1K-B法2MIC法3E-test法第30页,共75页，2024年2月25日，星期天31液基稀释法

CLSIM27A2：致病性酵母菌

CLSIM38A：产孢丝状真菌琼脂稀释法纸片扩散法——CLSIM44-AE－test法抗真菌药物体外敏感试验第31页,共75页，2024年2月25日，星期天32第32页,共75页，2024年2月25日，星期天33E-test法：可用于酵母样真菌和丝状真菌第33页,共75页，2024年2月25日，星期天34096第34页,共75页，2024年2月25日，星期天35白色念珠菌近平滑念珠菌热带念珠菌光滑念珠菌第35页,共75页，2024年2月25日，星期天36白色念珠菌近平滑念珠菌热带念珠菌光滑念珠菌第36页,共75页，2024年2月25日，星期天37白色念珠菌近平滑念珠菌热带念珠菌光滑念珠菌第37页,共75页，2024年2月25日，星期天38白色念珠菌近平滑念珠菌热带念珠菌光滑念珠菌第38页,共75页，2024年2月25日，星期天39白色念珠菌近平滑念珠菌热带念珠菌光滑念珠菌第39页,共75页，2024年2月25日，星期天40白色念珠菌近平滑念珠菌热带念珠菌光滑念珠菌第40页,共75页，2024年2月25日，星期天41体外抗真菌药敏试验与体内疗效90-60原则—MIC值与临床疗效

药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效

MahmoudA.G,JCM1996,34:489-495；RexJ,CID2002,35:982-989第41页,共75页，2024年2月25日，星期天42

真菌特异性抗原的免疫学检测

1(1-3)-ß-D-葡聚糖

2半乳甘露聚糖

3甘露聚糖

4D-阿拉伯糖醇

5烯醇化酶

6新生隐球菌荚膜抗原第42页,共75页，2024年2月25日，星期天43(1-3)-ß-D-Glucan(葡聚糖)“G”试验第43页,共75页，2024年2月25日，星期天44(1-3)--D-Glucan生物活性(1-3)--D-Glucan作为真菌细胞壁成分之一，一旦进入机体后，将引起真菌病，严重时将会引起严重的深部真菌感染疾病，因此,深部真菌感染对患者的健康与生命构成严重威胁.传统检测方法为真菌培养，一是周期长，二是阳性率特别低．主要是抗生素类药物的滥用所引起．真菌感染出现逐渐上升趋势．第44页,共75页，2024年2月25日，星期天45“G”试验缘何而来？第45页,共75页，2024年2月25日，星期天46比浊法反应机理

细菌内毒素 （1-3）

-D-Glucan LAL-RM(反应物)因子C 活化因子C

因子B 活化因子B活化因子G

因子G

凝固酶原 凝固酶

凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶）定量浊度仪 TurbidimetrictechniqueGEL第46页,共75页，2024年2月25日，星期天47G试验1-3-β-D-Glucan葡聚糖存在于念珠菌、曲霉等的细胞壁中，能特异性激活G因子，从而激活鲎试验，此过程称为G试验。口咽部念珠菌病G试验结果阴性隐球菌,毛霉菌感染G试验假阴性第47页,共75页，2024年2月25日，星期天48(1→3)-β-D-葡聚糖检测是酵母菌及丝状真菌细胞壁上的一种成分内毒素检测方法应用范围：曲霉菌、念珠菌、镰刀霉、毛孢子菌、酵母菌、足分支菌隐球菌、毛霉菌除外已在美国FDA以及一些欧洲国家得到批准

第48页,共75页，2024年2月25日，星期天49(1→3)-β-D-葡聚糖检测美国主要针对念珠菌血症进行了研究需要更多有关其它感染的研究信息（侵袭性曲霉菌病）没有真菌感染的患者血液中也会出现β-D-葡聚糖：-血液透析-使用血制品（白蛋白、丙球）-使用含有葡聚糖的纱布临床上阳性结果出现较晚使用某种抗生素是否会导致假阳性？

第49页,共75页，2024年2月25日，星期天50G试验商品化试剂盒detectsinonehour1天津滨海新区金山川公司生产产品

2Fungitec-Gglucan(Seikagaku)Obayashi1992cutoff：

20pg/ml3FungitellTMAssay(AssociatesofCAPECOD)cutoff：80pg/ml第50页,共75页，2024年2月25日，星期天511输注白蛋白或球蛋白2血液透析(纤维素滤膜）3输注抗肿瘤多糖类药物4使用磺胺类药物5外科手术后早期6标本接触纱布G试验假阳性问题第51页,共75页，2024年2月25日，星期天52酵母菌、丝状真菌细胞壁成分不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属不能检测：隐球菌和接合菌美国FDA已批准，欧洲部分国家已注册敏感性、特异性：90％左右

－D－葡聚糖的价值第52页,共75页，2024年2月25日，星期天53

－D－葡聚糖（G试验）的缺陷标本采集不能鉴定何种真菌感染第53页,共75页，2024年2月25日，星期天54

－D－葡聚糖参考值健康人：<10pg/ml

可疑感染：10~20pg/ml深部真菌感染：>20pg/ml第54页,共75页，2024年2月25日，星期天55ThecutoffofGtestCutoff(pg/ml)Sensitivity(%)Specificity(%)6069.987.18064.492.4ClinicalInfectiousDiseases2005;41:654-9ThecutoffofGtest第55页,共75页，2024年2月25日，星期天56曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）第56页,共75页，2024年2月25日，星期天57曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）Figure1-10Noncompetitivesandwichmethodofimmunoassay第57页,共75页，2024年2月25日，星期天58曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原可以从血清、脑脊、胸水、BALF检测到方法：ELISA（BioRad）：敏感性高1ng/mlLatexagglutination：15ng/ml第58页,共75页，2024年2月25日，星期天59影响GM检测的因素宿主曲霉菌疾病谱高危患者的治疗GM的其它来源GM的循环动力学抗GM抗体真菌曲霉菌种类？营养情况GM释放的动力学？策略采样频率标本种类阳性定义试验设计方法Cut-off方法/实验室内差异手工vs自动化第59页,共75页，2024年2月25日，星期天60GM试验假阳性问题以乳或乳制品为主食的婴幼儿异体骨髓移植患者菌血症患者自身抗体阳性患者使用半合成青霉素第60页,共75页，2024年2月25日，星期天61GM与β内酰胺类抗生素GM与哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、青霉素V有交叉反应错误地提高了诊断的确定性

第61页,共75页，2024年2月25日，星期天62合适的判定折点：1.0,0.7,0.5?在儿童的应用价值？食物中的GM可以被吸收，假阳性？哌拉西林/他唑巴坦治疗，假阳性？非血液病患者应用不多抗真菌治疗对结果的影响？半乳甘露聚糖(GM)检测存在的问题第62页,共75页，2024年2月25日，星期天63两种试验敏感性、特异性相当都可以在早期诊断侵袭性曲霉病，但是－D－葡聚糖可能出现更早两者结合，可以互补弥补GM假阴性可能同样在粒细胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究半乳甘露聚糖(GM)与－D－葡聚糖的比较第63页,共75页，2024年2月25日，星期天64血清抗体检测由于患者存在免疫受损，抗原递呈功能和及淋巴细胞功能受损，不能产生足够的抗体。诊断价值较低。第64页,共75页，2024年2月25日，星期天65系统性真菌感染诊断的进展第65页,共75页，2024年2月25日，星期天66检测真菌的特异性酶白念—N-乙酰

-D半乳糖苷酶白念—脯氨酸按肽酶都柏林念珠菌N-乙酰

-D半乳糖苷酶克柔酸性磷酸酶热带吡烙磷酸酶平滑

-D半乳糖苷酶新生隐球菌酚氧酶第66页,共75页，2024年2月25日，星期天67PCR

通过扩增曲霉菌特异基因片断，达到快速诊断的目的，但容易污染。第67页,共75页，2024年2月25日，星期天68PCR诊断侵袭性真菌病一种可能的全真菌检测方法可能用来进行血清学筛查（早期诊断）方法和标本不同，敏感性及特异性不同底线：有诊断潜能，但还不是最佳的方法

AlexanderB,TransplInfectDis,2002,(supply3):32第68