中药活性成分抑制鲍曼不动杆菌的实验研究

中药活性成分抑制耐药性鲍曼不动杆菌的实验研究摘要目的：探究中药活性成分连翘脂苷-A、木犀草素、蜂毒素对临床耐药鲍曼不动杆菌的抑制效果。方法：取8株临床分离鲍曼不动杆菌（标准株ATCC17978作为对照），应用微量肉汤稀释法检测10种抗生素的药物敏感性；挑选其中4株临床分离株和ATCC17978应用微量肉汤稀释法检测中药活性成分的最低抑菌浓度（MIC）；棋盘法检测中药活性成分和抗生素联合应用的协同抑菌效果；结晶紫染色法筛选生物膜形成能力较强的分离株，挑选其中1株，利用PCR检测其生物膜形成相关基因，检测中药活性成分对其生物膜形成能力的影响，平板菌落计数测定其对蜂毒素的剂量依赖性曲线。结果：药敏结果显示8株临床分离株药敏对10种抗生素均为耐药，ATCC17978对10种抗生素均为敏感；根据药敏结果挑选其中4株临床分离株和ATCC17978做中药活性成分的最小抑菌浓度测定，MIC结果显示连翘脂苷-A的MIC＞229μg/mL、木犀草素的MIC＞200μg/mL、蜂毒素的MIC=4μg/mL和2μg/mL,MIC(ATCC17978)=4μg/mL；单独抑菌效果显示连翘脂苷-A、木犀草素对4株临床耐药鲍曼不动杆菌效果不明显，蜂毒素有明显抑菌效果；生物膜形成能力相关的基因结果显示AB2菌株含有OMPA、BAP、pgaA和pgaC；生物膜形成能力结果显示连翘脂苷-A、木犀草素单独使用没有明显抑制效果，蜂毒素单独使用能明显地抑制生物膜形成能力。结论：中药活性成分蜂毒素可以有效抑制临床耐药鲍曼不动杆菌。关键词：鲍曼不动杆菌；最低抑菌浓度（MIC）；中药活性成分；生物膜；PCRExperimentalstudyontheinhibitoryeffectofactiveingredientsoftraditionalChinesemedicineondrμg-resistantAcinetobacterbaumanniiAbstractObjective:ToinvestigatetheinhibitoryeffectoftheactiveingredientsoftraditionalChinesemedicine,suchasforsythiaglycosideA,luteolin,andmelittin,onclinicallyresistantAcinetobacterbaumannii.Methods:Take8clinicallyisolatedAcinetobacterbaumanniistrains(standardstrainATCC17978ascontrol)andusemicrobrothdilutionmethodtodetectthedrμgsensitivityof10antibiotics;FourclinicalisolatesandATCC17978wereselectedtodetecttheminimuminhibitoryconcentration(MIC)ofactiveingredientsintraditionalChinesemedicineusingmicrobrothdilutionmethod;CheckerboardmethodfordetectingthesynergisticantibacterialeffectofthecombinationofactiveingredientsoftraditionalChinesemedicineandantibiotics;Crystalvioletstainingmethodwasusedtoscreenstrainswithstrongbiofilmformationability.Onestrainwasselected,anditsbiofilmformationrelatedgenesweredetectedusingPCR.TheinfluenceofactiveingredientsoftraditionalChinesemedicineonitsbiofilmformationabilitywastested,andthedosedependentcurveofmelittinwasdeterminedbyplatecolonycounting.Results:Thedrμgsensitivityresultsshowedthat8clinicalisolateswereresistanttoall10antibiotics,whileATCC17978wassensitivetoall10antibiotics;Accordingtothedrμgsensitivityresults,4clinicalisolatesandATCC17978wereselectedforthedeterminationoftheminimuminhibitoryconcentrationoftheactiveingredientsintraditionalChinesemedicine.TheMICresultsshowedthattheMICofforsythiaglycosideAwas>229μg/mL,theMICofluteolinwas>200μg/mL,andtheMICofmelittinwas=4μG/mLand2μg/mL,MIC(ATCC17978)=4μG/mL;TheindividualantibacterialeffectshowedthatforsythiaglycosideAandluteolinhadnosignificanteffectonthefourclinicallyresistantAcinetobacterbaumanniistrains,whilemelittinhadasignificantantibacterialeffect;ThegeneresultsrelatedtobiofilmformationabilityshowedthatAB2straincontainsOMPA,BAP,pgaA,andpgaC;TheresultsofbiofilmformationabilityshowedthattheuseofforsythiaglycosideAandluteolinalonedidnothaveasignificantinhibitoryeffect,whilemelittinalonecouldsignificantlyinhibitbiofilmformationability.Conclusion:TheactiveingredientoftraditionalChinesemedicine,melittin,caneffectivelyinhibitclinicaldrμg-resistantAcinetobacterbaumannii.Keywords:Acinetobacterbaumannii;MIC;ActiveingredientsoftraditionalChinesemedicine;Biofilm;PCR前言鲍曼不动杆菌（A.baumannii）是一种严格需氧、过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性、非运动性葡萄糖非发酵性的革兰阴性球杆菌，可引起免疫功能低下或危重症患者的医院获得性感染，尤其在重症监护病房（ICU）环境中的危重患者中ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1,2]。近年来，临床分离的多药耐药鲍曼不动杆菌愈发多见，为临床治疗该病原体感染造成极大困难，其广泛的抗生素耐药性谱，已经在医学界拉响警报ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Howard</Author><Year>2012</Year><RecNum>79</RecNum><DisplayText>[2]</DisplayText><record><rec-number>79</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685175277">79</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Howard,A.</author><author>O'Donoghue,M.</author><author>Feeney,A.</author><author>Sleator,R.D.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiologicalSciences,CorkInstituteofTechnology,Bishopstown,Cork,Ireland.</auth-address><titles><title>Acinetobacterbaumannii:anemergingopportunisticpathogen</title><secondary-title>Virulence</secondary-title></titles><periodical><full-title>Virulence</full-title></periodical><pages>243-50</pages><volume>3</volume><number>3</number><edition>2012/05/02</edition><keywords><keyword>AcinetobacterInfections/drugtherapy/*epidemiology/*microbiology</keyword><keyword>Acinetobacterbaumannii/drugeffects/*pathogenicity</keyword><keyword>CommunicableDiseases,Emerging/drugtherapy/epidemiology/microbiology</keyword><keyword>CrossInfection/drugtherapy/*epidemiology/*microbiology</keyword><keyword>DrugResistance,Multiple,Bacterial</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Incidence</keyword><keyword>OpportunisticInfections/drugtherapy/*epidemiology/*microbiology</keyword></keywords><dates><year>2012</year><pub-dates><date>May1</date></pub-dates></dates><isbn>2150-5594(Print) 2150-5594</isbn><accession-num>22546906</accession-num><urls></urls><custom2>PMC3442836</custom2><electronic-resource-num>10.4161/viru.19700</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[2]。鲍曼不动杆菌具有多种耐药机制，包括β-内酰胺酶、外排泵、通透性缺陷和靶位点修饰，这些耐药机制的积累使得可用于治疗鲍曼不动杆菌感染的抗生素种类不断减少ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[3]。使得鲍曼不动杆菌对多种药物产生耐药性的一个关键因素是它们具有强大的形成生物膜的能力。生物膜为其提供了足够的保护，使其免受恶劣条件的侵害，并进一步发展慢性感染ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4]。OmpA、Bap、pgaA、pgaC等基因均与生物膜形成相关。OmpA在促进鲍曼不动杆菌粘附、侵袭和生物膜的形成以及随后宿主上皮细胞凋亡等免疫反应方面的作用至关重要ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[5]。有研究表明，在饥饿等不利环境下OmpA表达有所下调ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[6]；转录调节因子Hfq的表达与OmpA的表达水平密切相关ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[7]；在某些抗生素的亚抑菌浓度能够促进鲍曼不动杆菌OmpA的表达以及生物膜的形成ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[8,9]。这些因素都能够影响OmpA的表达调节，还有更多未知的调节机制亟待探索。生物膜相关蛋白（Bap）是一种在鲍曼不动杆菌细胞表面大量表达的蛋白质，是生物膜形成的关键因素，能够增加对人体细胞的黏附用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[10,11]。Bap基因的存在与鲍曼不动杆菌分离株生物膜的形成之间存在较强的相关性ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Fallah</Author><Year>2017</Year><RecNum>96</RecNum><DisplayText>[12]</DisplayText><record><rec-number>96</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685202944">96</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Fallah,A.</author><author>Rezaee,M.A.</author><author>Hasani,A.</author><author>Barhaghi,M.H.S.</author><author>Kafil,H.S.</author></authors></contributors><auth-address>ImmunologyResearchCenter,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran. StudentResearchCommittee,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran. InfectiousandTropicalDiseasesResearchCenter,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran. DepartmentofMicrobiology,FacultyofMedicine,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran. DrugAppliedResearchCenter,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran.</auth-address><titles><title>FrequencyofbapandcpaAvirulencegenesindrugresistantclinicalisolatesofAcinetobacterbaumanniiandtheirroleinbiofilmformation</title><secondary-title>IranJBasicMedSci</secondary-title></titles><periodical><full-title>IranJBasicMedSci</full-title></periodical><pages>849-855</pages><volume>20</volume><number>8</number><edition>2017/11/01</edition><keywords><keyword>Acinetobacterbaumannii</keyword><keyword>Antibioticresistance</keyword><keyword>Bap</keyword><keyword>Biofilm</keyword><keyword>CpaA</keyword></keywords><dates><year>2017</year><pub-dates><date>Aug</date></pub-dates></dates><isbn>2008-3866(Print) 2008-3866</isbn><accession-num>29085575</accession-num><urls></urls><custom2>PMC5651469</custom2><electronic-resource-num>10.22038/ijbms.2017.9105</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[12]。细胞外基质（ECM）的合成为鲍曼不动杆菌生物膜形成的关键环节，其主要成分多聚β1-6-N-乙酰氨基葡萄糖胺（PNAG）受pgaABC基因序列的编码调控，ECM合成的缺失会影响鲍曼不动杆菌生物膜形成ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>向军</Author><Year>2011</Year><RecNum>97</RecNum><DisplayText>[13]</DisplayText><record><rec-number>97</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685203937">97</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>向军</author><author>孙珍</author><author>宋菲</author><author>郇京宁</author></authors><translated-authors><author>XiangJun</author><author>S.U.N.Zhen</author><author>SongFei</author><author>HuanJing-ning</author></translated-authors></contributors><titles><title>烧伤患者鲍氏不动杆菌pgaABC基因簇表达及生物膜表型变化</title><secondary-title>中华烧伤杂志</secondary-title></titles><periodical><full-title>中华烧伤杂志</full-title></periodical><pages>100-103</pages><number>02</number><keywords><keyword>烧伤；感染；鲍氏不动杆菌；基因；生物膜</keyword></keywords><dates><year>2011</year></dates><urls><related-urls><url>/ss201102/53780.htm</url></related-urls></urls><remote-database-provider>《中华医学杂志》社有限责任公司</remote-database-provider><language>chi</language></record></Cite></EndNote>[13]。由于耐多药鲍曼不动杆菌的广泛传播对公共卫生具有重要意义，世界卫生组织（WHO）已于2017将该病原体置于优先研发活性抗生素名单的首位ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lima</Author><Year>2023</Year><RecNum>99</RecNum><DisplayText>[14]</DisplayText><record><rec-number>99</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685204464">99</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lima,W.G.</author><author>deLima,M.E.</author></authors></contributors><auth-address>ProgramadePósGraduaçãoemMedicina-Biomedicina,FaculdadeSantaCasadeBeloHorizonte,BeloHorizonte30150-250,MG,Brazil.</auth-address><titles><title>TherapeuticProspectionofAnimalVenoms-DerivedAntimicrobialPeptidesagainstInfectionsbyMultidrug-ResistantAcinetobacterbaumannii:ASystematicReviewofPre-ClinicalStudies</title><secondary-title>Toxins(Basel)</secondary-title></titles><periodical><full-title>Toxins(Basel)</full-title></periodical><volume>15</volume><number>4</number><edition>2023/04/27</edition><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>*Acinetobacterbaumannii</keyword><keyword>AntimicrobialPeptides</keyword><keyword>*AcinetobacterInfections/drugtherapy/microbiology</keyword><keyword>Anti-BacterialAgents/pharmacology/therapeuticuse/chemistry</keyword><keyword>*ArthropodVenoms/pharmacology</keyword><keyword>DrugResistance,Multiple,Bacterial</keyword><keyword>MicrobialSensitivityTests</keyword><keyword>Acinetobacterbaumannii</keyword><keyword>antimicrobialdevelopment</keyword><keyword>anura</keyword><keyword>arthropods</keyword><keyword>melittin</keyword><keyword>pneumonia</keyword><keyword>systemicinfection</keyword><keyword>venom</keyword><keyword>wound</keyword></keywords><dates><year>2023</year><pub-dates><date>Apr3</date></pub-dates></dates><isbn>2072-6651</isbn><accession-num>37104206</accession-num><urls></urls><custom2>PMC10143903</custom2><electronic-resource-num>10.3390/toxins15040268</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[14]。中医是中华民族的传统医学，历经上千年的沉淀，具有独属于自己的完整理论体系。同时，中药材相较于抗生素，拥有毒副用有限、不易产生耐药性、国内资源丰富等优点ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[15]。在多重耐药鲍曼不动杆菌的严峻情况下，抗菌肽（AMP）的应用是一条新的途径ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[16-18]。AMP有植物、动物、真菌等多种来源，本研究抗菌肽源于蜜蜂毒液中提取的蜂毒素——由26种氨基酸组成的多肽，该多肽N端区域有+4个电荷，C端有+2个电荷，在生理pH下总共产生+6个电荷ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[19]。小儿青翘颗粒具有较好的广谱抑菌活性，能抑制鲍曼不动杆菌等多种常见呼吸道病原菌的生长，组方为为山银花，连翘，粉葛，大青叶，山豆根，柴胡，甘草ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[20,21]。其中连翘有清热解毒之效，其有效活性成分连翘脂苷-A具有许多药理活性，抗菌、抗氧化、抗病毒、抗炎、神经保护，肾组织保护，肺组织保护和肝组织保护等ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[22,23]。连翘脂苷-A对铜绿假单胞菌、嗜水气假单胞菌等革兰阴性菌有较明显抗菌用，鲍曼不动杆菌同为革兰阴性菌，连翘脂苷-A能否有效抑制尚未可知。金银花中可提取木犀草素，木犀草素是常见的黄酮之一，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗凋亡、抗过敏、抗糖尿病、化疗、心脏保护和神经保护特性ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>López-Lázaro</Author><Year>2009</Year><RecNum>109</RecNum><DisplayText>[24]</DisplayText><record><rec-number>109</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685245731">109</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>López-Lázaro,M.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofPharmacology,FacultyofPharmacy,UniversityofSeville,Spain.C/ProfesorGarciaGonzalez,41011,Sevilla,Spain.mlopezlazaro@us.es</auth-address><titles><title>Distributionandbiologicalactivitiesoftheflavonoidluteolin</title><secondary-title>MiniRevMedChem</secondary-title></titles><periodical><full-title>MiniRevMedChem</full-title></periodical><pages>31-59</pages><volume>9</volume><number>1</number><edition>2009/01/20</edition><keywords><keyword>Anti-InfectiveAgents/metabolism/pharmacology</keyword><keyword>Anti-InflammatoryAgents/metabolism/pharmacology</keyword><keyword>AntineoplasticAgents/metabolism/pharmacology</keyword><keyword>Antioxidants/metabolism/pharmacology</keyword><keyword>Flavonoids/chemistry/pharmacology</keyword><keyword>Luteolin/chemistry/*pharmacology</keyword><keyword>Plants,Medicinal/chemistry</keyword></keywords><dates><year>2009</year><pub-dates><date>Jan</date></pub-dates></dates><isbn>1389-5575(Print) 1389-5575</isbn><accession-num>19149659</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.2174/138955709787001712</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[24]。目前，木犀草素的用研究多聚焦于其抗炎作用。

一、实验材料（一）实验菌株江苏省盱眙县人民医院检验科收集临床标本分离的鲍曼不动杆菌，共8株。（二）实验试剂试剂、耗材厂家氯化钠北京索莱宝科技有限公司胰蛋白胨OXOID琼脂GMATE酵母提取物OXOID琼脂糖Bioweste2×TaqPlusMasterMix南京诺唯赞生物科技股份有限公司96孔聚苯乙烯板无锡耐思生命科技股份有限公司Goldview核酸染料生物工程(上海)股份有限公司MH培养基杭州滨和微生物试剂有限公司连翘脂苷-A阿拉丁生化科技股份有限公司木犀草素阿拉丁生化科技股份有限公司蜂毒素阿拉丁生化科技股份有限公司DL2000PIusDNAMarker南京诺唯赞生物科技股份有限公司抗生素：哌拉西林、替卡西林、头孢他啶、美罗培南、多粘菌素E、庆大霉素、妥布霉素、四环素、左氧氟沙星购买自大连美仑生物技术有限公司；环丙沙星购买自上海源叶生物科技有限公司。（三）实验仪器仪器厂家纯水仪ULUP-Ⅲ-5T四川优普超纯科技有限公司立式高压蒸汽灭菌锅日本TOMY公司生物安全柜美国Thermo公司DNP-9162型恒温培养箱上海博迅医疗生物仪器股份有限公司恒温摇床德国Eppendorf公司PCR仪美国应用生物系统公司电泳仪美国Bio-RAD公司全自动凝胶成像仪英国SYNGENE公司细菌比浊仪英国OXOID公司微波炉格兰仕集团微量移液器赛默飞世尔科技公司冰箱（4℃和-20℃）海尔集团多功能酶标仪美国Biotek公司（四）主要试剂配制LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，加入1.5%琼脂。121℃，20min高压灭菌。MH肉汤培养基：称取MH肉汤干粉10.5g，向其中加入500mL双蒸水，121℃，0.15Mpa，20min高压蒸汽灭菌。取出冷却至室温后，于4℃冰箱中冷藏备用。1%琼脂糖凝胶：将0.4g琼脂糖粉末溶于40mL1×TAE缓冲液中，微波炉加热溶解，待冷却片刻后加入4μlGoldView核酸染料，混匀后倒入制胶槽，待琼脂糖凝固后备用。PBS缓冲液：将8gNaCl,2.9gNa2HPO4.H2O,0.2gKCL,0.24gKH2PO4,加入900mL超纯水中溶解后，调节PH至7.4后，用超纯水定容至1L，高压备用。LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH7.3-7.4。121℃，20min高压灭菌。连翘脂苷-A溶液配制：10mg连翘脂苷-A粉末溶于1mLDMSO中，充分溶解，过滤除菌后-20℃储存备用。木犀草素溶液配制：91.6mg木犀草素粉末溶于1mL乙醇中，充分溶解，过滤除菌后-20℃储存备用。蜂毒素溶液配制：1mg蜂毒素粉末溶于1mL高压灭菌过得超纯水中，充分溶解，过滤除菌后-20℃储存备用。抗生素溶液配制：哌拉西林配制成30mg/mL-20℃储存备用，替卡西林配制成100mg/mL-20℃储存备用，头孢他啶配制成100mg/mL-20℃储存备用，美罗培南配制成32mg/mL-20℃储存备用，多粘菌素E配制成100mg/mL-20℃储存备用，庆大霉素配制成100mg/mL-20℃储存备用，妥布霉素配制成100mg/mL-20℃储存备用，四环素配制成64mg/mL-20℃储存备用，左氧氟沙星配制成100mg/mL-20℃储存备用，环丙沙星配制成64mg/mL-20℃储存备用。二、实验方法（一）药敏试验菌液制备：从-80℃低温冰箱取出冻存的鲍曼不动杆菌菌种。于冰上解冻后在生物安全柜中，接种环蘸取少量菌液，四区划线法接种于LB固体培养基平板上，在37℃培养箱孵育18-24h。取复苏后的细菌平板，挑取单克隆于2mLLB液体培养基中，然后将其置于37℃，200rmp恒温摇床中过夜培养。移液枪取20ul过夜培养菌液接种于2mLMH肉汤培养基中扩增，在37℃恒温摇床中培养,直至OD600为0.5，用MH液体培养基将其稀释至1×106CFU/mL备用。药液制备：用MH液体培养基将哌拉西林、替卡西林、头孢他啶、氨曲南、美罗培南、多粘菌素E、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星和左氧氟沙星稀释成浓度分别为1024μg/mL、1024μg/mL、512μg/mL、512μg/mL、512μg/mL、64μg/mL、512μg/mL、512μg/mL、128μg/mL和512μg/mL。微量肉汤稀释法：96孔聚苯乙烯板第1-7行每孔加入100ulMH培养基，再向第1行加入配制100ul的抗生素以及中药母液，排枪依次倍比稀释至第7行，弃去100ul，每种抗生素做3个复孔。第8行，阴性对照和阳性对照各3个复孔，阴性孔加入200ulMH液体培养基，阳性孔加入100ulMH液体培养基和100ul菌悬液。除阴性对照外，各孔加入100ul配备好的菌悬液（终浓度为1×105CFU/mL），封口膜封口，置于37℃温箱中孵育18-20h，观察有无细菌生长，阴性对照组澄清透亮，阳性对照组浑浊或有菌沉淀，并根据CLSIM100文件判断确定MIC。（二）临床分离鲍曼不动杆菌的中药活性成分的最小抑菌浓度（MIC）用MH液体培养基制备1×106CFU/mL的菌悬液备用。用MH液体培养基将连翘脂苷-A、木犀草素和蜂毒素稀释成浓度分别为229μg/mL、200μg/mL和16μg/mL。微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度。（三）中药活性成分与常见抗生素联合抑菌实验棋盘法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>张肖冰</Author><Year>2017</Year><RecNum>132</RecNum><DisplayText>[25]</DisplayText><record><rec-number>132</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685718387">132</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>张肖冰</author><author>杨事达</author><author>姚志成</author><author>单风平</author></authors></contributors><auth-address>中国医科大学基础医学院免疫学教研室;辽宁省人民医院检验科;辽宁省人民医院神经内科;</auth-address><titles><title>替加环素与5种抗生素对多重耐药鲍曼不动杆菌体外联合药敏实验的研究</title><secondary-title>微生物学杂志</secondary-title></titles><periodical><full-title>微生物学杂志</full-title></periodical><pages>82-87</pages><volume>37</volume><number>05</number><keywords><keyword>鲍曼不动杆菌</keyword><keyword>替加环素</keyword><keyword>联合用药</keyword><keyword>FIC</keyword></keywords><dates><year>2017</year></dates><isbn>1005-7021</isbn><call-num>21-1186/Q</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[25]：用MH液体培养基制备1×106CFU/mL的菌悬液备用。取96孔聚苯乙烯板，纵向(A～H)为加入中药药液的升梯度方向，横向(1～8)为加入抗生素溶液的降梯度方向。每孔分别加入50μL中药药液和50μL抗生素溶液后，再加入100μL菌悬液，混匀后，第11列4个复孔加200ulMH液体培养基作为阴性对照，第12列4个复孔加入100ulMH液体培养基和100ul菌悬液作为阳性对照，封口膜封口，置于37℃培养箱孵育18-20h，用酶标仪测定样品在595nm处的吸光度，计算平均光密度值。分数抑制浓度（FIC）指数公式计算：FIC=（MIC药物A联合/MIC药物A单独）+（MIC药物B联合/MIC药物B单独）。FIC指数对应药物相互作用的类型：协同作用，值n≤0.5部分协同作用，值0.5<n<1加性效应，值n=1无差别效果，对于值1<n<4拮抗作用，值为4≤nADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Year>2019</Year><RecNum>128</RecNum><DisplayText>[26]</DisplayText><record><rec-number>128</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685440903">128</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title>HighlySynergisticEffectsofMelittinwithConventionalAntibioticsAgainstMultidrug-ResistantIsolatesofAcinetobacterbaumanniiandPseudomonasaeruginosa</title><secondary-title>MicrobialDrugResistance</secondary-title></titles><periodical><full-title>MicrobialDrugResistance</full-title></periodical><pages>193-202</pages><volume>25</volume><number>2</number><keywords><keyword>burninfections,melittin,antibiotic,synergism,Acinetobacterbaumannii,Pseudomonasaeruginosa</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><accession-num>30281385</accession-num><urls><related-urls><url>/doi/abs/10.1089/mdr.2018.0016</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1089/mdr.2018.0016</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[26]。（四）鲍曼不动杆菌生物膜形成能力的检测结晶紫染色法：用MH液体培养基制备1×106CFU/mL的菌悬液备用。取96孔聚苯乙烯板孔，每株菌每孔200μL，做3个复孔，封口膜封口，置于37℃恒温孵育24h，弃上清后用200ul的PBS轻柔清洗每孔两次，加入0.5％结晶紫染色避光37℃孵育30min，PBS冲洗2次，最终加入95％乙醇脱色，37℃干燥后用酶标仪测定样品在595nm处的吸光度，读取光密度（D）值。取其3次D平均值的均值为该菌株最终D值，以鲍曼不动杆菌ATCC17978为生物被膜形成阳性对照菌株，MH液体培养基为阴性对照（均一式3孔）。生物被膜形成能力定量-定性判读标准：测定阴性对照（培养液）D值，以其平均D+3S定义为Dc，将待测菌株最终D与Dc进行比较分为4类：阴性（-）：D≤Dc；弱阳性（1+）：Dc＜D≤2Dc；阳性（2+）：2Dc＜D≤4Dc；强阳性（3+）：D＞4DcADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>尹珍</Author><Year>2018</Year><RecNum>133</RecNum><DisplayText>[27]</DisplayText><record><rec-number>133</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685722752">133</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>尹珍</author><author>黄文祥</author><author>杨均均</author><author>李佳俊</author><author>刘成伟</author></authors></contributors><auth-address>重庆医科大学附属第一医院感染科;</auth-address><titles><title>耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌流行克隆株生物被膜形成能力分析</title><secondary-title>中国感染与化疗杂志</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国感染与化疗杂志</full-title></periodical><pages>184-189</pages><volume>18</volume><number>02</number><keywords><keyword>鲍曼不动杆菌</keyword><keyword>碳青霉烯类耐药</keyword><keyword>流行克隆</keyword><keyword>多位点序列分型</keyword><keyword>生物被膜</keyword></keywords><dates><year>2018</year></dates><isbn>1009-7708</isbn><call-num>31-1965/R</call-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.16718/j.1009-7708.2018.02.010</electronic-resource-num><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[27]。（五）PCR测定生物膜相关基因1、引物设计菌株基因序列(5'to3')长度(bp)退火温度（℃）OMPA-FGTCGTCCCCGCCTTCCT102358℃OMPA-RAGCATTTCGGATGGGAACTTTAAB2BAP-FGGCAGCCGCATCTGTTAATG85052℃BAP-RCAAAGCGTGCCTGCGTATTTpgaA-FCCATAGCTATCTGGCAGCCC61856℃pgaA-RAAAACGGCCAAAGGAATGCCpgaC-FACCAATGACAATGGACGGCT116456℃pgaC-RGCACCGTCATGGGCAAATTT2、反应体系成分体积（μl）正向引物F1反向引物R12×TaqPlusMasterMix12.5H2O（调整终体积至25ul）9.5PCR模板13、PCR扩增条件引物OMPA的反应条件温度时间循环数95℃5min

95℃30s58

℃60s3572℃30s72℃8min4℃+∞引物BAP的反应条件温度时间循环数95℃5min

95℃30s52

℃60s3572℃30s72℃8min4℃+∞引物pgaA的反应条件温度时间循环数95℃5min

95℃30s56

℃60s3572℃30s72℃8min4℃+∞引物pgaC的反应条件温度时间循环数95℃5min

95℃30s56

℃60s3572℃30s72℃8min4℃+∞4、琼脂糖凝胶电泳：准备洗净的电泳所需器具，放好梳子。配制1%的琼脂糖凝胶，室温下凝固后，小心拔出梳子，并准备点样。电泳槽中加入30mL左右的电泳缓冲液，加样完成的凝胶放入电泳槽中，排出孔内气泡。按照正负极，接通电源，电压220v，40min。电泳结束后，关闭电源，凝胶成像仪观察凝胶成像结果，与marker对比，确定片段大小。（六）中药活性成分对鲍曼不动杆菌的生物膜抑制实验用MH液体培养基制备1×106CFU/mL的菌悬液备用。取96孔聚苯乙烯板孔，纵向（A-F），每行3个复孔，每孔加入100ulLB液体培养基和100ul菌悬液。加入200ulLB液体培养基作为阴性对照，加入100ulLB液体培养基和100ul菌悬液作为阳性对照，阴阳对照组各3个复孔，封口后置于37℃培养箱培养24h。24h后，移液枪吸取板内菌液，用PBS缓冲液轻柔洗板2次，每行依次加入200ul配制好的6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.57μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL药液，阴阳对照加入200ulLB液体培养基，封口置于37℃培养箱孵育24h。24h后，弃上清后用200ul的PBS轻柔清洗每孔两次，加入0.5％结晶紫染色避光37℃孵育30min，PBS冲洗2次，最终加入95％乙醇脱色，37℃干燥后用酶标仪测定样品在595nm处的吸光度，计算平均光密度值。（七））鲍曼不动杆菌对蜂毒素的剂量依赖曲线测定从-80℃低温冰箱取出冻存的鲍曼不动杆菌菌种。于冰上解冻后在生物安全柜中，接种环蘸取少量菌液，四区划线法接种于LB固体培养基平板上，在37℃培养箱孵育18-24h。取复苏后的细菌平板，挑取单克隆于2mLLB液体培养基中，然后将其置于37℃，200rmp恒温摇床中过夜培养。移液枪取20ul过夜培养菌液接种于2mLMH肉汤培养基中扩增，在37℃恒温摇床中培养,直至OD600为0.5，用MH液体培养基将其稀释至1×106CFU/mL备用。蜂毒素配制浓度为6.25μg/mL，依次倍比稀释为3.125μg/mL、1.57μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL备用。取一块96孔板，第1-5行依次加入6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.57μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL的药液100ul，第6行加入100ulLB液体培养基，每个浓度3个复孔。阴性对照将入200ulLB液体培养基，阳性对照加入100ulLB液体培养基和100ul菌悬液，阴阳对照组各3个复孔，封口后置于37℃培养箱培养24h。24h后，移液枪吸取板内不同浓度菌液100ul，用PBS缓冲液以1:10稀释后，点滴于LB固体平板上，37℃培养18-20h后计数，prism作图。三、实验结果（一）药敏试验结果本研究中收集的8株临床分离的鲍曼不动杆菌均多重耐药鲍曼不动杆菌，药敏结果如表1所示。以标准菌株ATCC17978作为对照组，8株鲍曼不动杆菌对哌拉西林、替卡西林、头孢他啶、四环素、美罗培南、庆大霉素及环丙沙星均表现出耐药性，对多粘菌素E均敏感；其中有4株临床分离株对妥布霉素敏感，2株临床分离株对左氧氟沙星敏感。表1ATCC17978及8株鲍曼不动杆菌药敏结果抗生素ATCC17978AB1AB2AB3AB4AB5AB6AB7AB8哌拉西林SRRRRRRRR替卡西林SRRRRRRRR头孢他啶SRRRRRRRR四环素SRRRRRRRR美罗培南SRRRRRRRR多粘菌素ESSSSSSSSS庆大霉素SRRRRRRRR妥布霉素SRRRSSRSS环丙沙星SRRRRRRRR左氧氟沙星SSIIRRSII（二）中药活性成分单独抑菌结果根据表1所示的药敏结果，挑选耐药性较强的4株临床分离株和标准菌株ATCC17978作为对照，微量肉汤稀释法检测中药活性成分单独抑菌效果，结果如表2所示。连翘脂苷-A的MIC＞229μg/mL、木犀草素的MIC＞200μg/mL、蜂毒素的MIC=4μg/mL和2μg/mL，MIC(ATCC17978)=4μg/mL，木犀草素和连翘脂苷-A的单独抑菌效果并不明显，标准ATCC17978对两种中药活性成分也并未表现出敏感性，蜂毒素的单独抑菌效果较为显著。表2中药活性成分抑制鲍曼不动杆菌药敏结果中药（μg/mL）ATCCAB1AB2AB3AB417978木犀草素＞229＞229＞229＞229＞229连翘酯苷-A＞200＞200＞200＞200＞200蜂毒素42244（三）中药活性成分联合常见抗生素抑制鲍曼不动杆菌多重耐药菌株在临床上愈发多见，单独抗生素的使用已经难以达到理想疗效，通常会根据感染部位的不同，叠加使用不同抗生素治疗，但是其对人体的毒副作用也是不可忽视的。所以，本研究期望可以通过中药活性成分和常见抗生素联用，以降低抗抗生素的使用浓度，联合用药的结果如图1所示。中药活性成分与抗生素联合用药的抑菌效果并不明显，对照组的标准菌株ATCC17978的联合用药结果，主要是抗生素抑制其生长，并没有达到预期效果；临床分离株的联合用药效果也不理想，并未达到预期目的。图1中药活性成分连翘脂苷-A、木犀草素和蜂毒素联合常见抗生素抑制AB2的效果（四）生物膜筛选结果阴性对照平均D+3S为0.4983+3×0.0377，故在Dc=0.536水平对挑选出的4株耐药性较强的临床分离菌株生物膜形成能力进行分析，结果如表3所示。4株临床分离株中，2株生物膜形成能力弱，另外2株有较强的生物膜形成能力。表34株鲍曼不动杆菌生物膜形成能力强弱定性菌株生物膜形成能力阴性弱阳性阳性强阳性MH*AB1*AB2*AB3*AB4*（五）PCR验证AB2生物膜相关基因根据鲍曼不动杆菌生物膜形成能力筛查结果，挑选具备较强的生物膜形成能力的AB2，检测其是否包含与生物膜形成相关的基因，结果如图2所示。临床分离株AB2包含OMPA、BAP、pgaA、pgaC与生物膜相关的基因。OmpA能够促进鲍曼不动杆菌粘附、侵袭和生物膜的形成；BAP是生物膜形成的关键因素；pgaABC基因序列编码调控细胞外基质的合成，从而影响鲍曼不动杆菌生物膜的形成。这些基因与鲍曼不动杆菌生物膜的形成密切相关，从而验证了临床分离株AB2确实具有较强生物膜形成能力。图2AB2生物膜相关基因的PCR扩增结果（六）中药活性成分对鲍曼不动杆菌生物膜抑制结果生物膜的形成是鲍曼不动杆菌耐药性发展的一个重要因素，鲍曼不动杆菌的生物膜形成能力与鲍曼不动杆菌造成的感染性疾病病情加重密切相关。生物膜形成能力筛查和PCR验证，AB2具备较强的生物膜形成能力，检测三种中药活性成分对其的生物膜形成能力是否有影响，结果如图2所示。木犀草素和连翘脂苷-A抑制AB2生物膜形成的效果不明显，蜂毒素对AB2的生物膜形成有明显的抑制效果。图3中药活性成分对鲍曼不动杆菌AB2的生物膜抑制结果（七）鲍曼不动杆菌对蜂毒素的剂量依赖曲线测定蜂毒素能够抑制AB2生长，对AB2的生物膜形成有很好的抑制效果，针对其对AB2的抑制效果作时间依赖性曲线，如图所示。图4鲍曼不动杆菌AB2对蜂毒素的剂量依赖曲线四、讨论鲍曼不动杆菌耐药性问题已然成为现代医疗保健系统中亟待解决的问题，本研究中的8株实验菌株均为多重耐药菌株。目前，临床上可选择的抗生素种类越来越有限，治疗感染疾病的困难愈发加重，病人愈后并不理想ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[28]。目前常用的策略是考虑感染部位，选择最适的抗生素联合用药ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[29]。研发新型抗生素需要时间，因此，寻求一种非抗生素的治疗手段，例如中药、佐剂、噬菌体疗法等被认为是一种不错的新型途径。本研究中所用的三种中药活性成分木犀草素、连翘脂苷-A、蜂毒素，其中木犀草素提取自金银花，是常见黄酮之一；连翘脂苷-A源自小儿青翘颗粒组方；蜂毒素属于抗菌肽，是目前潜力巨大的一种治疗策略。本研究结果表明，蜂毒素相较于其他两种中药活性成分，对鲍曼不动杆菌生长有明显的抑制效果，蜂毒素的MIC=4μg/mL和2μg/mL，与文献ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[30]中的结果相一致。连翘脂苷-A、木犀草素并未找到有关其MIC的文献数据。中药活性成分和常见抗生素联用，并未达到降低抗生素或中药活性成分的使用浓度，与\o"RezaAkbari"RezaAkbariADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Year>2019</Year><RecNum>135</RecNum><DisplayText>[26]</DisplayText><record><rec-number>135</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685805662">135</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title>HighlySynergisticEffectsofMelittinwithConventionalAntibioticsAgainstMultidrug-ResistantIsolatesofAcinetobacterbaumanniiandPseudomonasaeruginosa</title><secondary-title>MicrobialDrugResistance</secondary-title></titles><periodical><full-title>MicrobialDrugResistance</full-title></periodical><pages>193-202</pages><volume>25</volume><number>2</number><keywords><keyword>burninfections,melittin,antibiotic,synergism,Acinetobacterbaumannii,Pseudomonasaeruginosa</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><accession-num>30281385</accession-num><urls><related-urls><url>/doi/abs/10.1089/mdr.2018.0016</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1089/mdr.2018.0016</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[26]等人的实验结果不一致。RezaAkbari等人的文献中以蜂毒素和多尼培南、多西环素及多粘菌素-E三种抗生素联合应用，蜂毒素-多尼培南这一组合显示了协同抑菌效果，联用后降低了多尼培南的最低抑菌浓度。该文献中，蜂毒素的MIC=0.25μg/mL和0.5μg/mL,远低于本研究结果。与文献中的临床分离株相比，本研究的临床分离株的耐药性较强，配制蜂毒素溶液所用溶剂为高压灭菌的超纯水（查阅文献中未提及蜂毒素溶剂），所用蜂毒素的药物纯度与文献中是否一致仍有待考证，以上众多因素均可能导致联合用药效果不佳。生物膜已经成为耐药菌迅速发展的一个重要因素，在生物膜的保护之下，病原菌对抗生素和宿主的免疫调节具有更强抵抗力，同时提高病原菌在恶劣条件下的生存几率。生物膜引起的慢性或亚急性感染，也是临床治疗上难以解决的棘手问题ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Gedefie</Author><Year>2021</Year><RecNum>127</RecNum><DisplayText>[31]</DisplayText><record><rec-number>127</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685440256">127</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Gedefie,A.</author><author>Demsis,W.</author><author>Ashagrie,M.</author><author>Kassa,Y.</author><author>Tesfaye,M.</author><author>Tilahun,M.</author><author>Bisetegn,H.</author><author>Sahle,Z.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMedicalLaboratorySciences,CollegeofMedicineandHealthScience,WolloUniversity,Dessie,Ethiopia. DepartmentofMedicalLaboratorySciences,DebreBirhanHealthScienceCollege,DebreBirhan,Ethiopia.</auth-address><titles><title>AcinetobacterbaumanniiBiofilmFormationandItsRoleinDiseasePathogenesis:AReview</title><secondary-title>InfectDrugResist</secondary-title></titles><periodical><full-title>InfectDrugResist</full-title></periodical><pages>3711-3719</pages><v