细胞融合与单克隆抗体

关于细胞融合与单克隆抗体蔬菜水果杂交新品种第2页,共59页，2024年2月25日，星期天第3页,共59页，2024年2月25日，星期天第4页,共59页，2024年2月25日，星期天第5页,共59页，2024年2月25日，星期天第6页,共59页，2024年2月25日，星期天杂交水稻之父第7页,共59页，2024年2月25日，星期天动物杂交——斑马驴第8页,共59页，2024年2月25日，星期天狮虎兽第9页,共59页，2024年2月25日，星期天野牛和黄牛杂交第10页,共59页，2024年2月25日，星期天细胞融合的方法病毒融合：副粘病毒最有效，副流感病毒、仙台病毒等PEG融合：PEG导致脂质双分子层不稳定，降低细胞膜极性，促进细胞膜融合。电融合法：细胞膜出现微孔，通透性升高，继发细胞融合。神经氨酸酶第11页,共59页，2024年2月25日，星期天细胞融合是杂交瘤抗体技术的基础。第12页,共59页，2024年2月25日，星期天二、鼠源性单克隆抗体制备历史：

KohlerandMilstein“ContinuousCultureofFusedCellsSecretingAntibodyofPredefinedSpecificity”,Nature,1975.骨髓瘤细胞+小鼠脾细胞（经羊红细胞免疫）NobelPrizein1984持续分泌抗羊红细胞抗体的杂交瘤细胞第13页,共59页，2024年2月25日，星期天Ab的产生和单克隆抗体：多克隆抗体单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）：针对一种抗原决定簇的抗体。第14页,共59页，2024年2月25日，星期天Burnet选择学说：一个淋巴细胞（B细胞）只接受一个抗原决定簇刺激，刺激后扩增的淋巴细胞克隆只产生均一的同质抗体，即单克隆抗体。体外要获得某种抗原的单克隆抗体，需要有体外持续分泌抗体的单一B淋巴细胞克隆。第15页,共59页，2024年2月25日，星期天如何获得体外持续分泌抗体的细胞

细胞融合和融合细胞的筛选是杂交瘤制备抗体的技术基础。能分泌抗体，不能长期在体外培养survive第16页,共59页，2024年2月25日，星期天杂交瘤细胞的筛选——HAT培养基细胞DNA合成有两条途径：

主要途径：糖、氨基酸合成核苷酸，叶酸作为重要的辅酶参与。

另一辅助途径是在H、T存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的作用合成DNA。第17页,共59页，2024年2月25日，星期天HAT培养基：

次黄嘌呤（hypoxanthine，H）

氨基蝶呤（aminopterin，A）:叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA。

胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）第18页,共59页，2024年2月25日，星期天融合后五种细胞的命运：B，瘤细胞（HGPRT缺陷），B-B，瘤-瘤（HGPRT缺陷），瘤-BB，B-B细胞能分泌抗体，含有HGPRT，能在HAT培养基短期存活，但不能长期体外存活。瘤细胞，瘤-瘤细胞能在体外长期存活，但不含有HGPRT，不能在HAT培养基存活，不能分泌抗体。只有瘤-B融合细胞具有亲代双方的遗传性能，在HAT培养基存活，且能在体外长期存活，能分泌抗体。第19页,共59页，2024年2月25日，星期天杂交瘤技术制备McAb的原理克隆选择学说将抗原免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞在体外进行细胞融合用HAT培养基选择杂交瘤细胞的原理以及各种细胞的命运第20页,共59页，2024年2月25日，星期天McAb制备主要流程克隆化抗体特异性筛选扩大培养制备大量McAb动物免疫细胞融合第21页,共59页，2024年2月25日，星期天McAb制备主要步骤动物免疫细胞融合和筛选抗体特异性筛选克隆化扩大培养第22页,共59页，2024年2月25日，星期天动物免疫：获得产生高效价特异性抗体的B细胞抗原：可溶性抗原（蛋白质、核酸、多肽、多糖）、颗粒性抗原（细胞、细菌、真菌）。可溶性抗原+佐剂动物：6周龄的雌性Balb/c小鼠第23页,共59页，2024年2月25日，星期天免疫途径：腹腔注射、静脉注射、皮内或肌肉内注射。腹腔内注射尤其适合于颗粒性抗原；对于可溶性抗原来讲，初次免疫一般选用弗氏佐剂和抗原的混合乳化物进行背部皮下多点注射，加强免疫在首次免疫后10～14天，一般是静脉或腹腔内注射，融合前还要进行抗原冲击。脾内免疫法可获得更满意的免疫效果，此法免疫周期短、抗原用量少。免疫剂量：初次免疫10~20µg，可达50µg，一般不超过200µg。第24页,共59页，2024年2月25日，星期天举例：动物免疫：将纯化的CysC蛋白（0.5mg/ml）从-86℃冰箱取出，冰上融解，抗原乳化采用三通管双注射器互推法。第25页,共59页，2024年2月25日，星期天免疫方案：0天首次免疫，100μgCysC/只（0.2ml）+等体积弗氏完全佐剂，背部、大腿肌肉皮内多点注射；14天，100μgCysC/只（0.2ml）+等体积弗氏不完全佐剂，大腿肌肉皮内多点注射；21天，100μgCysC/只（0.2ml），于小鼠腹腔注射；第25天眼眶取血，分离血清，用ELISA试测定效价；28天，选择效价达到要求（1：32000）的小鼠进行尾静脉注射50μgCysC/只（0.05ml），加强免疫。第26页,共59页，2024年2月25日，星期天细胞融合——主要细胞系和培养基骨髓瘤细胞：SP2/0，NS-1，均自Balb/c小鼠。最好每隔3~6月将细胞置于含8-AG（8-杂氮鸟嘌呤）的培养基中培养一次，已去除HGPRT+的细胞。培养基：高糖DMEM，RPMI-1640第27页,共59页，2024年2月25日，星期天血清：

10%胎牛血清用于亲代细胞培养，融合、筛选、克隆用20%胎牛血清；不同商家、不同批次血清对细胞支持作用明显不同，应筛选出能促进克隆细胞生长增殖的优质血清，购置足够数量分装保存。第28页,共59页，2024年2月25日，星期天细胞融合——融合前的准备（1）PEG的配制：PEG1000、1500、4000均可用于融合，浓度为40%～50%。50％聚乙二醇（PEG，MW4000）配制：

称取2gPEG4000，放入青霉素小瓶内，盖上橡皮塞，插上9号针头排气，沸水浴中30min，使PEG融化并除菌；待其冷却至50～60℃时，加入37℃预温的1640（1.7ml）和DMSO（0.3ml）混合液，充分混匀，封口胶封紧瓶塞，4°C保存，用前可置37°C加温助溶。第29页,共59页，2024年2月25日，星期天

Norwood提出，含15%（V/V）DMSO的50%PEG4000，DMSO可增加膜的通透性，使细胞膜的渗透压更易于与环境趋于平衡，从而提高融合频率。第30页,共59页，2024年2月25日，星期天细胞融合前的准备（2）制备饲养细胞（feedercell）：小鼠腹腔巨噬细胞，能分泌生长因子促使单个细胞容易生长，还能清除死亡破碎细胞及微生物。于细胞融合前一天，取SPF级健康Balb/c小鼠，处死，用75%酒精浸泡10min，消毒小鼠体表。将其移入超净工作台内，以仰卧位固定在解剖板上，用无菌注射器吸取10ml1640液注射入腹腔，用酒精棉球轻揉腹部2～3min；用无菌剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，吸出腹腔液，放入10ml离心管，1000rpm，离心10min，弃上清；第31页,共59页，2024年2月25日，星期天用5mlHAT培养基重悬细胞，计数调整细胞数1×105/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。一般一只小鼠可获得5×106～8×106个饲养细胞，用于3块96孔板融合细胞培养。第32页,共59页，2024年2月25日，星期天细胞融合前的准备（3）骨髓瘤细胞悬液的制备：细胞融合前两周复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，待细胞生长稳定后，以终浓度为20μg/mL8-AZ完全培养液培养两周，筛选HGPRT缺陷型细胞。融合前48h将SP2/0细胞进行传代培养，选取对数生长期的细胞，于融合前用新鲜培养液换液一次，融合当天收集细胞悬液，离心弃上清，用1640液洗涤一次，重悬于培养液中，计数细胞总数。

第33页,共59页，2024年2月25日，星期天细胞融合前的准备（4）免疫鼠脾细胞悬液的制备：处死一只免疫好的Balb/C小鼠，小鼠用75%酒精浸泡10min；无菌操作取出脾脏，放入盛有10ml不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的结缔组织和脂肪组织。然后换一新玻璃皿，加入1640液30ml，将脾脏置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，期间用不完全培养基冲洗数次，使脾细胞穿过网孔进入溶液中；第34页,共59页，2024年2月25日，星期天将脾细胞移至10ml玻璃离心管中，1000rpm，去上清，用不完全培养基10ml洗涤细胞3次，离心收集脾细胞；将脾细胞用10ml不完全培养基重悬混匀，计数，置室温待用。第35页,共59页，2024年2月25日，星期天细胞融合融合前将50%PEG置于37℃培养箱中预温；吸取SP2/0细胞悬液和脾细胞悬液至一个50ml离心管中，使脾细胞∶骨髓瘤细胞=10∶1，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清；吸取0.7ml50%PEG，离管底约2cm处沿管壁加入PEG，1min左右加完，静置90s；逐滴加入37℃预温的不完全培养基1ml，再吸取不完全培养基10ml，缓慢加入，最后加入20ml不完全培养基；第36页,共59页，2024年2月25日，星期天800rpm，离心8min，弃去上清，加入HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀；将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，每孔100μl；每块培养板留3~5孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃、5%CO2培养箱中培养。第37页,共59页，2024年2月25日，星期天PEG介导细胞融合的机制第38页,共59页，2024年2月25日，星期天提高融合率的技术措施饲养细胞的加入有助于促进杂交瘤细胞的生长。PEG浓度要准确：PEG在50～60℃时仍为液体状态，含DMSO的1640液要保温50℃，两种液体混合时一定要充分混匀；当脾细胞和瘤融合时，末次离心后应尽量吸出上清，可避免对PEG的稀释作用；由于PEG能引起蛋白质的沉淀，故脾细胞、瘤细胞需经不含小牛血清的1640液的洗涤。第39页,共59页，2024年2月25日，星期天PEG作用瘤细胞和脾细胞融合后，加入无血清1640液时要控制好速度，否则当渗入的液体太快，细胞可能胀破；融合后离心速度不要太高，一般为800rpm，5min。细胞融合时，脾细胞∶骨髓瘤细胞的比例一般为5～10∶1，每孔接种的细胞大约为1×105～2×105，接种过多，容易在单孔内形成多个克隆集落，不利于克隆化操作。第40页,共59页，2024年2月25日，星期天杂交瘤细胞的筛选：HAT培养基融合后每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并于第5天每孔半量换液HAT培养基100μl。第41页,共59页，2024年2月25日，星期天杂交瘤细胞融合情况观察4d10d9d7d5d第42页,共59页，2024年2月25日，星期天抗体特异性筛选：融合后10天～14天，细胞克隆长至孔底的1/3～1/2时，即可采用间接ELISA法检测各细胞培养孔上清液，筛选分泌目的抗体的阳性克隆。第43页,共59页，2024年2月25日，星期天挑出融合板阳性孔细胞，加入8-10mlHT培养基，混匀铺板4-6纵行，待亚克隆生长5-7天，克隆长大约1万个细胞以上/孔，再用ELISA方法检测。再次筛选出阳性克隆后，立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培养。

第44页,共59页，2024年2月25日，星期天筛选分泌特异Ab的杂交瘤细胞新方法：electro-FACS-fusion单独筛选分泌某种抗体（如IgM型）的杂交瘤细胞磁性颗粒筛选免疫渗滤法第45页,共59页，2024年2月25日，星期天克隆化：有限稀释法：逐步稀释使平均每孔只有一个细胞。收集阳性克隆细胞，计数，取用4.6ml培养液悬浮230个杂交瘤细胞（此时平均0.1ml溶液中含5个细胞），接种于预先已加有饲养细胞的96孔培养板，共接种3排，每孔0.1ml；余下1.0ml，再加入4ml培养液，共5ml（此时平均0.1ml溶液中含1个细胞），再接种3排；第46页,共59页，2024年2月25日，星期天最后剩余1.4ml，再补加培养液1.4ml（此时平均0.1ml溶液中含0.5个细胞），接种最后的24孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养5天左右，在倒置显微镜下观察细胞克隆生长情况，并进行ELISA检测。将分泌作用最强的阳性克隆再次克隆化，直至细胞阳性率达100%，转移到24孔板、6孔板中扩大培养，收集细胞冻存。第47页,共59页，2024年2月25日，星期天克隆化的注意事项：克隆化应及早进行，以免无关克隆生长抑制阳性克隆的抗体分泌。杂交瘤细胞不稳定，抗体分泌特性易丢失，多次克隆得到稳定的细胞株。定期进行冻存后复苏和克隆，监测细胞株的抗体分泌特性。第48页,共59页，2024年2月25日，星期天杂交瘤细胞及其单抗鉴定

染色体分析：

小鼠B细胞40条，SP2/068条，杂交瘤细胞为90-100条。第49页,共59页，2024年2月25日，星期天单克隆抗体亚类的鉴定

——IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA包被酶标板：用包被液将抗原稀释为10μg/ml，每孔加100μl抗原液，共加12孔，于4℃过夜，洗涤3遍，拍干。封闭：每孔加1%牛血清白蛋白液200μl，37℃孵育45min，洗涤3遍，拍干。每孔加入100μl新鲜的杂交瘤细胞培养上清，室温静置2h，洗涤3次。用抗体稀释液以1∶1000稀释IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA，每孔加入100μl稀释的抗体，每种抗体作复孔，室温静置30min，洗涤3次。每孔加入100μl1∶1000稀释的酶标兔抗羊IgG抗体，室温静置15min，洗涤3次。每孔加入100μl底物显色液，室温避光反应10～15min。每孔加入100μl终止液，观察结果，确定Ig亚类。第50页,共59页，2024年2月25日，星期天Westernblotting鉴定单克隆抗体与相应抗原的特异性反应

取重组的CysC蛋白行12%SDS电泳。电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡20～60min，22V恒压电转移1h。转移后的PVDF膜在丽春红S中染色5min，再用蒸馏水脱去红色。将转移膜置于封闭液中，室温封闭过夜。弃去封闭液，用1×TBST漂洗膜3次，每次10～15min。加入以1∶10稀释的杂交瘤培养上清，37℃孵育4h。1×TBST漂洗膜3次，每次10～15min。加入已稀释1∶5000的HRP-羊抗小鼠IgG，37℃孵育2h。1×TBST洗涤3次，每次10～15min.加入DAB显色液，轻摇至显色，蒸馏水漂洗终止反应，观察分析结果。第51页,共59页，2024年2月25日，星期天单克隆抗体纯度鉴定SDS电泳第52页,共59页，2024年2月25日，星期天单克隆抗体的大量制备——体内诱生腹水法

采用小鼠体内诱生腹水的方法大量制备单克隆抗体：在接种杂交瘤细胞前1～2周，选取9～10周龄的雌性Balb/C小鼠，腹腔注射0.5ml石蜡油。将培养的杂交瘤细胞1000rpm