蛋白质工程重点

关于蛋白质工程重点基因工程和蛋白质工程第2页,共154页，2024年2月25日，星期天1、蛋白质工程的基本研究内容蛋白质结构分析

——基础结构、功能的设计和预测

——基础的应用与验证创造和/或改造蛋白质——新蛋白质

——终目标第3页,共154页，2024年2月25日，星期天一、基本化学组件氨基酸amino肽单位和多肽链peptideunit,polypeptidechain

第4页,共154页，2024年2月25日，星期天氨基酸性质极性氨基酸：Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、His、Tyr、Trp

——二硫键疏水氨基酸：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Met——疏水内核荷电氨基酸：Arg、Lys（+）；Asp、Glu（-）——PI，蛋白分离光谱特性、紫外线吸收特性——检测第5页,共154页，2024年2月25日，星期天氨基酸的构型与构象构型configuration：一个分子中原子的特定空间排布（L-型的单一手性分子）构象conformation：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布旋转异构体rotamer：以优势构象（交错构象staggedconformation）出现的氨基酸残基（用于模建）肽键peptidebond:由一个氨基酸的

-羧基与另一个氨基酸的

-氨基脱水缩合而形成的化学键。具有反式(trans)和顺式(cis)两种构型第6页,共154页，2024年2月25日，星期天多肽链构象的表征参数（1）扭角(torsionangle)或双面角(dihedralangle)系统（2）多肽链的构象角(,)（3）拉氏构象图（Ramachandraplot）及多肽链构象的允许区第7页,共154页，2024年2月25日，星期天二、空间结构组件α螺旋αhelixβ层βsheet环肽链loop转角turn第8页,共154页，2024年2月25日，星期天α-螺旋结构（α-helix）多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。蛋白质分子为右手

-螺旋。第9页,共154页，2024年2月25日，星期天两亲性amphipathicity螺旋一侧主要分布亲水（荷电、极性）残基，另一侧主要集中疏水残基可用螺旋转轮(helicalwheel)的方式预测对生物活性具有重要作用疏水内核solventexcludedcore蛋白质结构具有的一个共同特征疏水内核是蛋白质折叠的主要驱动力疏水内核是天然蛋白质稳定的基本结构因素第10页,共154页，2024年2月25日，星期天β-折叠(β-sheet)

折叠的几种形式1.平行型2.反平行型3.混合型扭转的肽链twistedstrand：链都是沿其前进方向不断扭转，从而使实际蛋白质结构中出现的层都不是平直的，而是一种扭转层。右手扭转第11页,共154页，2024年2月25日，星期天环肽链（loop)1．回折(reverseturn)（1）β转折（转角）(-turn)在

-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中（2）γ转折(γ-turn):由3个氨基酸残基构成的转折2．β发夹（1）β发夹(β－hairpin)通过一段短的环链将2条相邻的链连接在一起环链可具有不同的长度（1～4，2）常具有重要的功能性意义（2）β凸起(β－bulge)第12页,共154页，2024年2月25日，星期天环肽链的意义连接二级结构元素的主要结构因素，在三级结构预测中，环链区构象的确定具有基本的重要性环链区常常出现在生物活性位置，三维结构构建具有功能意义环肽链结构库——用于结构预测和模建第13页,共154页，2024年2月25日，星期天三、蛋白质空间结构层次一级结构（primerystructure）二级结构(secondarystructure)结构模体(motif)结构域(domain）三级结构（tertiarystructure)/亚基（subunit）四级结构(quaternarystructure)第14页,共154页，2024年2月25日，星期天1.蛋白质的一级结构primerystructure多肽链中氨基酸的排列序列同源(homology)2.蛋白质的二级结构secondarystructure多肽链主链骨架中的若干肽段，各自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键维系，从而形成有规则的构象，不涉及氨基酸残基的侧链构象。

α-螺旋（α-helix）

β-折叠(β-sheet)β-转角(β-turn)β-凸起（β-burgle）无规则卷曲（randomcoil）第15页,共154页，2024年2月25日，星期天3.结构模体

（supersecondarystructure，motif）

介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（blockbuilding），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。第16页,共154页，2024年2月25日，星期天4.结构域domain是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，一条多肽链在这个域范围内来回折叠，但相邻的域常被一个或两个多肽片段连结。通常由50-300个氨基酸残基组成，其特点是在三维空间可以明显区分和相对独立，并且具有一定的生物功能如结合小分子。模体或基序（motif）是结构域的亚单位通常由2～3二级结构单位组成，一般为α螺旋、β折叠和环（loop）。第17页,共154页，2024年2月25日，星期天5.三级结构tertiarystructure

在二级结构的基础上再折叠ABCA胰岛素的三级结构B溶菌酶分子的三级结构C磷酸丙糖异构酶三级结构C丙酮酸激酶的三级结构D第18页,共154页，2024年2月25日，星期天6.四级结构quaternarystructure亚基聚合而成的寡聚蛋白结构侧重强调亚基之间的相互作用和空间排布情况均一、非均一；对称、不对称亚基(subunit)1)蛋白质分子的最小共价单位2)具有完整的三级结构3)是四级结构的基本组件4)均一、非均一第19页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质结构类型——α型——

型——α/

型——α＋

型——无规型／富含二硫键和金属离子型第20页,共154页，2024年2月25日，星期天维持蛋白质三维结构的作用力盐键又称盐桥或离子键（ionicbond):正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。氢键(hydrogenbond):多肽主链上的羰基氧和酰胺氢之间、侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。疏水作用（hydrophobicinteraction):介质中球状蛋白质的折叠总是倾向与把疏水残基埋藏在分子的内部，在稳定蛋白质的三维结构方面占有突出地位。范德华力(vanderwaalsforce）：指分子间的作用力。广义上的范德华力包括3种较弱的作用力：定向效应，诱导效应，分散效应。二硫键（disulfidebond）绝大多数情况下二硫键是在多肽链的β－转角附近形成的第21页,共154页，2024年2月25日，星期天二、蛋白质折叠的概念蛋白质的折叠proteinfolding从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。折叠研究：研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性和与其生物活性的关系。蛋白质复性：将蛋白质从结构不规则、无活性的状态，恢复到有唯一立体结构、有生物活性的状态的过程。蛋白质变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性第22页,共154页，2024年2月25日，星期天1、“自组装学说”

（self-assembly）

20世纪60年代，Anfinsen基于还原变性的牛胰RNase在不需其他任何物质帮助下，仅通过去除变性剂和还原剂就使其恢复天然结构的实验结果，提出了“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息”的“自组装学说”。1965，中国，化学合成活性结晶牛胰岛素Anfinsen，1972，NobelPrice第23页,共154页，2024年2月25日，星期天2。“热力学假说”天然蛋白质多肽采取的构象是在一定环境条件下热力学上最稳定的结果，采取天然构象的多肽链和它所处的一定环境条件（如溶液组分、pH、温度、离子强度等）整个系统的自由能最低，所以处于变性状态的多肽链在一定的环境条件下能够自发折叠成天然构象。第24页,共154页，2024年2月25日，星期天3、“辅助性组装学说”体内蛋白质的折叠往往需要有其他辅助因子的参与，并伴随有ATP的水解不仅仅受“热力学”控制，也受到“动力学”的控制二者是统一的二者所起作用大小在不同的蛋白质中可能不同1987年，Ellis第25页,共154页，2024年2月25日，星期天新支持三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。（1988，邹承鲁）90年代辅助蛋白(Accessory

protein)的发现——细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。第26页,共154页，2024年2月25日，星期天二、帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子分子伴侣（molecularchaperone）是一类相互之间有关系的蛋白，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装，并且不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能时的组成部分(1993,Ellis)折叠酶：催化与折叠直接有关的化学反应的酶。蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI)肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase,PPI)第27页,共154页，2024年2月25日，星期天分子伴侣的定义完全是功能上的。分子伴侣与酶的异同点相同点参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现不同点分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性分子伴侣的催化效率很低分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进其正确折叠。第28页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质折叠的特点不是一步形成的，而是通过一些中间折叠物而完成的。新生肽链的不完整性形成最终成熟蛋白分子中不存在也不应该有的瞬间结构。在大分子拥挤的环境下经常会产生错误折叠。折叠中间态的正确途径与错误途径竞争失败时。第29页,共154页，2024年2月25日，星期天分子伴侣在蛋白质分子折叠中的作用识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然结构。与这些中间物结合，生成复合物，防止过早的或者错误的相互作用而阻止不正确的无效的折叠途径，抑制不可逆的聚合物的产生，促进折叠向正确的有效的途径进行。分子伴侣首先会识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然构象，而不会去理会天然构象。分子伴侣与早期形成的中间物相互作用而防止它们之间的聚合；一旦聚合形成，分子伴侣就无能为力了。可以说分子伴侣能“治病救人”，但并无“起死回生”的绝招。第30页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质二硫键异构酶(PDI)催化新生肽链的巯基氧化形成二硫键。PDI首先和含有巯基的肽链结合。PDI对含有二硫键蛋白折叠的底物特异性不高。通过二硫键的交换，PDI可帮助蛋白快速找到可以达到的热力学上最稳定状态的二硫键对。PDI含有两个Cys-Gly-His-Cys序列，并且Cys上的巯基是非常活性的.PDI在动力学错配折叠中间体加速二硫键的交换中起到非常重要的作用。第31页,共154页，2024年2月25日，星期天肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)蛋白质的肽键几乎都是反式的（99.95%），但脯氨酰亚氨基的肽键有6%是顺式的。脯氨酰亚氨基异构是很多蛋白体外折叠过程中的限速步骤。PPI可以提高脯氨酰亚氨基顺反异构300倍的效率。第32页,共154页，2024年2月25日，星期天第一遗传密码遗传信息的传递—从核酸序列到功能蛋白质的全过程。第一遗传密码—三联遗传密码3个相连的核苷酸顺序决定蛋白质分子肽链中的一个氨基酸。第二遗传密码现有的遗传密码仅有从核酸序列到无结构的多肽链的信息传递，因此是不完整的。无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分—遗传密码的第二部分，即蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密码第33页,共154页，2024年2月25日，星期天第二遗传密码的特点简并性氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构。多意性相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构。全局性在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用，并对分子总体结构产生重要影响；后形成的肽段可以影响已经形成的肽段个构象从而造成对分子整体的影响等。第34页,共154页，2024年2月25日，星期天与蛋白错误折叠有关的疾病蛋白传染子导致的疾病（priondiseases）淀粉样蛋白病（amyloiddiseases）癌症（cancer）第35页,共154页，2024年2月25日，星期天常见“折叠病”老年性痴呆症(Alzheimersyndrome)病人脑中充满了由错误折叠蛋白形成的杂乱的蛋白质簇。主要分为两类：含有沉淀样β蛋白（Aβ）的沉淀样斑，tau蛋白引起的神经细胞内自损伤。帕金森氏症（Parkinsondisease）主要是由于蛋白质的错误折叠，病人随意运动的控制能力逐渐丧失，因为能产生多巴胺的神经细胞逐步被破坏，其原因和发生机制尚不清楚。某些肿瘤抑癌基因突变造成抑癌基因编码的蛋白质稳定性改变引起的一些癌症的发生。p53稳定性的降低导致癌症的发生。第36页,共154页，2024年2月25日，星期天三、折叠机制的理论模型▲框架模型（FrameworkModel）

框架模型假设蛋白质的局部构象依赖于局部的氨基酸序列。在多肽链折叠过程的起始阶段,先迅速形成不稳定的二级结构单元；称为“flickeringcluster”,随后这些二级结构靠近接触,从而形成稳定的二级结构框架；最后，二级结构框架相互拼接，肽链逐渐紧缩，形成了蛋白质的三级结构。这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的进行折叠,其间形成的亚结构域是折叠中间体的重要结构。第37页,共154页，2024年2月25日，星期天▲疏水塌缩模型（HydrophobicCollapseModel）

在疏水塌缩模型中，疏水作用力被认为是在蛋白质折叠过程中起决定性作用的力的因素。在形成任何二级结构和三级结构之前首先发生很快的非特异性的疏水塌缩。——疏水内核包埋

三、折叠机制的理论模型

第38页,共154页，2024年2月25日，星期天▲扩散-碰撞-粘合机制（Diffusion-Collision-AdhesionModel）

该模型认为蛋白质的折叠起始于伸展肽链上的几个位点，在这些位点上生成不稳定的二级结构单元或者疏水簇，主要依靠局部序列的进程或中程（3-4个残基）相互作用来维系。它们以非特异性布朗运动的方式扩散、碰撞、相互黏附，导致大的结构生成并因此而增加了稳定性。进一步的碰撞形成具有疏水核心和二级结构的类熔球态中间体的球状结构。球形中间体调整为致密的、无活性的类似天然结构的高度有序熔球态结构。最后无活性的高度有序熔球态转变为完整的有活力的天然态。三、折叠机制的理论模型

第39页,共154页，2024年2月25日，星期天▲成核-凝聚-生长模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）

根据这种模型，肽链中的某一区域可以形成“折叠晶核”，以它们为核心，整个肽链继续折叠进而获得天然构象。所谓“晶核”实际上是由一些特殊的氨基酸残基形成的类似于天然态相互作用的网络结构，这些残基间不是以非特异的疏水作用维系的，而是由特异的相互作用使这些残基形成了紧密堆积。晶核的形成是折叠起始阶段限速步骤。三、折叠机制的理论模型

第40页,共154页，2024年2月25日，星期天▲拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）

此模型的中心思想就是多肽链可以沿多条不同的途径进行折叠,在沿每条途径折叠的过程中都是天然结构越来越多,最终都能形成天然构象,而且沿每条途径的折叠速度都较快,与单一途径折叠方式相比,多肽链速度较快,另一方面,外界生理生化环境的微小变化或突变等因素可能会给单一折叠途径造成较大的影响，而对具有多条途径的折叠方式而言,这些变化可能给某条折叠途径带来影响,但不会影响另外的折叠途径,因而不会从总体上干扰多肽链的折叠,除非这些因素造成的变化太大以致于从根本上影响多肽链的折叠。三、折叠机制的理论模型

第41页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质设计的目的意义为蛋白质工程提供指导性信息探索蛋白质的折叠机制

——蛋白质工程的核心内容之一第42页,共154页，2024年2月25日，星期天常见设计目标提高蛋白的热、酸稳定性增加活性降低副作用提高专一性进行结构-功能关系研究……

第43页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质设计的目标及解决办法

第44页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质设计流程根据结构或功能需求，从天然蛋白质的结构出发，确定突变位点及替换的氨基酸；预测修饰后的蛋白质结构；预测新蛋白质可能的性质；实验验证；循环至达到目标第45页,共154页，2024年2月25日，星期天分子设计的步骤（1）建立所研究蛋白质的结构模型（2）找出对所要求的性质有重要影响的位置（3）选择一系列的在（2）中所选出位点上改变残基所得到的突变体（4）预测突变体的结构（5）定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质第46页,共154页，2024年2月25日，星期天设计应注意问题应确定对蛋白质折叠敏感的区域：带有特殊扭角的氨基酸、盐桥、密堆积区应确定对功能非常重要的位置：结构－功能关系应考虑剩余位置对所希望改变的影响当进行互换或插入/删除残基时应考虑它们对结构特征的影响第47页,共154页，2024年2月25日，星期天功能残基鉴定根据结构信息序列同源性分析实验技术手段随机突变删除分析及连接段扫描突变第48页,共154页，2024年2月25日，星期天Sample1:胰岛素的改造常规胰岛素的缺点:在高于生理浓度(10-8~10-10mol/L)自身聚合[药用浓度高,>10-4mol/L]发挥生理功能需要单体形式与专一受体结合解决途径基于IGF-1是以单体形式存在,将胰岛素B链的B28-B29的残基序列颠倒成IGF-1相应序列向胰岛素二聚体形成面引入带电荷或具有大的侧链的残基,以阻碍二聚体的形成第49页,共154页，2024年2月25日，星期天Sample2:酶分子的定向进化定点突变等基因改造技术，改变蛋白序列中的个别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工程技术又称为分子进化的理性设计。第50页,共154页，2024年2月25日，星期天人胰岛素的生产方法直接提取法制人胰岛素化学合成法制人胰岛素化学转型法制人胰岛素在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。基因重组法重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点第51页,共154页，2024年2月25日，星期天第52页,共154页，2024年2月25日，星期天定点突变和随机突变其代表性的方法

定点方法旧的使用RE的片段改组盒式突变新的寡核苷酸定点突变PCR为基础的点突变随机方法旧随机方法紫外线

X射线

其他化学方法新的随机方法转座子简并引物PCR介导的定点突变使用引物情况利用引物在基因的5’末端和3’末端产生定点突变利用引物在目的基因的中心区段产生定点突变第53页,共154页，2024年2月25日，星期天KaryB.Mullis"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"

TheNobelPrizeinChemistry1993MichaelSmith定点突变第54页,共154页，2024年2月25日，星期天引物设计原则①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+C含量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

第55页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质融合表达的主要方法重组基因直接剪接于适当信号肽之后将外源按阅读框架自我融合目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合分泌亲和融合双亲和融合分泌插入融合第56页,共154页，2024年2月25日，星期天改造蛋白质的方法物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等。生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。第57页,共154页，2024年2月25日，星期天分子生物学途径：①利用体外重组或PCR技术进行定位突变（插入/删除/替换一个或多个氨基酸残基）；②基因融合和剪接：将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。改造蛋白质的方法第58页,共154页，2024年2月25日，星期天改变蛋白质结构的核心技术——

基因的人工定点突变

插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。

——重组DNA技术或PCR方法第59页,共154页，2024年2月25日，星期天1.M13载体法(Kunkel突变法)人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物将待研究的基因插入载体M13，制得单链模板，合成相应的互补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。（制备单链DNA常用菌株是M13噬菌体）经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。

经此扩增出来的基因有1/2是突变了的基因，经一定的筛选便可获得突变基因。第60页,共154页，2024年2月25日，星期天2.重组PCR定点诱变法

利用两个互补的带有突变碱基的内侧引物及两个外侧引物，先进行两次PCR扩增，获得两条彼此重叠的DNA片段。两条片段由于具有重叠区，因此在体外变性和复性后可形成两种不同的异源双链DNA分子，其中一种带有３’凹险末端的DNA可通过Taq酶延伸而形成带有突变位点的全长基因。该基因再利用两个外侧引物进行第三次PCR扩增，便可获得人工定点突变的基因。3.大引物诱变法

利用一个带突变位点的内侧引物与一个外侧引物先进行PCR扩增，再以扩增产物作为引物与另一个外侧引物进行第二次PCR扩增而获得人工定点突变的全长基因。第61页,共154页，2024年2月25日，星期天4.盒式突变

(cassettemutagenesis)1985年Wells提出特点：区域性的突变，又称片段取代法(DNAfragmentreplacement)。要点：是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。优势：一次处理就可以得到多种突变型基因。第62页,共154页，2024年2月25日，星期天5.硫代负链法核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物（α－（S）－dCTP）对某些内切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核苷酸外切酶III从3｀→5｀扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因。第63页,共154页，2024年2月25日，星期天1、蛋白质结构的设计方法

—从头设计二级结构模块单元的自组装配体诱导组装通过共价交叉连接实现肽的自组装在合成模板上肽的组装线性多肽折叠为球状结构基于组合库的全新蛋白质设计第64页,共154页，2024年2月25日，星期天①二级结构模块单元的自组装模块设计设计合成单一二级结构单元（α螺旋或折叠股）作为多肽链的片段的模块，然后复制这些二级结构模块并把它们连接为整个蛋白质结构。优点：简单、直接、容易合成缺点：稳定性依赖于浓度、结构简单重复第65页,共154页，2024年2月25日，星期天②配体诱导自组装典型的是以金属离子作为配体将配体结合位点设计在结构中几个相互作用片段的界面处如果这个位点对配体有很高的亲和力，则结合配体的合适的自由能将充分克服熵消耗并肽自组装第66页,共154页，2024年2月25日，星期天③通过共价交叉连接实现肽的自组装二硫键DAB法：8股-barrel中形成简单的从上到下的连接方法肽键：赖氨酸的侧链基团以及谷氨酸、天冬氨酸的侧链羧酸彼此间形成肽键；或者与主链的N端或C端形成肽键适用于设计由平行或反平行二级结构单元组成的结构第67页,共154页，2024年2月25日，星期天④在合成模板上肽的组装模板组装合成蛋白法（TASPs,Mutter）使用人工模板形成turn或loop特点：每条肽链显示最低限度的浓度倚赖关系，但是一旦它们连接到模板上，它们的结构倾向于稳定并且不依赖于年度优点：能模拟天然蛋白质的性质第68页,共154页，2024年2月25日，星期天⑤线性多肽折叠为球状结构最小化途径：把全新设计的复杂性简化为几个涉及天然蛋白稳定性的关键特征，然后优化这些特征。内堆积因素“负设计”：设计一个互补的不稳定的竞争结构第69页,共154页，2024年2月25日，星期天⑥基于组合库的全新设计“二元模式”通过合成基因在细菌中表达制备，同时通过基因编码实现组合多样性。疏水核堆积优化、二级结构单元间界面优化计算机辅助设计方法第70页,共154页，2024年2月25日，星期天抗体人源化体现的蛋白质工程的思想

蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然存在的蛋白质更加优良、更加符合人类对生产和生活的需要的新型蛋白质鼠源性抗体有以下缺点：应用于人体可产生人抗小鼠抗体；其次鼠源性抗体通常不能有效地激活人体的生物效应功能；此外其次鼠源性抗体在人体内的半衰期也短为了克服以上缺点，对鼠源性抗体进行了从人-鼠嵌合抗体到改形抗体到表面重塑抗体到抗体库技术优化人改形抗体

的不断改良与优化的人源化过程第71页,共154页，2024年2月25日，星期天(1)人-鼠嵌合抗体

人-鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中表达而得到的抗体。人-鼠嵌合抗体的特点含75～80%人抗体，20%鼠抗体。恒定区是人源性的，大大降低了HAMA。可有效激活CDC和ADCC。可变区为鼠源，保留了亲本单抗的亲和力和特异性。在人体内的半衰期明显延长。第72页,共154页，2024年2月25日，星期天(2)改形抗体（CDR移植抗体）CDR移植抗体(CDRgraftingantibody)即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改形抗体，也就是人源化抗体。改形抗体的特点与人-鼠嵌合抗体相比抗原性进一补降低但仍有可能产生抗独特型抗体在保持抗原结合活性与降低免疫原性之间有难以调和的矛盾第73页,共154页，2024年2月25日，星期天(3)表面重塑抗体将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中与人可变区相应的氨基酸残基改为人源的，就可以使可变区表面人源化，消除了异源性而不影响可变区的整体空间构象，这种对鼠单抗进行人源改造的方式称表面氨基酸残基的“人源化”。

第74页,共154页，2024年2月25日，星期天

抗体库技术优化人改形抗体

先通过分子结构分析找出可能影响抗原结合部位立体结构的骨架区残基，将这些残基的鼠源副本和人源副本同时组合到一个抗体库中，或将这些残基随机化，通过筛选过程寻找最佳组合，确定哪些位置需要保留亲本鼠源残基。如，抗原表位定向选择：以鼠单抗可变区为模板，利用噬菌体展示技术，通过抗原导向，筛选能够模拟鼠单抗可变区，结合相同抗原决定簇的人抗体(4)通过抗体库技术人源化第75页,共154页，2024年2月25日，星期天抗体人源化体现的蛋白质工程的思想而此人源化过程的目的：从鼠源性抗体的恒定区人源化到可变区的最大限度人源化，恰好与蛋白质工程对现有蛋白质进行定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然存在的蛋白质更加优良、更加符合人类对生产和生活的需要的新型蛋白质的思想不谋而合第76页,共154页，2024年2月25日，星期天体外蛋白质折叠与

细胞内新生肽链折叠的区别完整肽链在试管内的重折叠相当于翻译完成后才折叠，与新生肽链的合成延伸与折叠同时进行的不同。细胞内新生肽链折叠是一个比蛋白质体外重折叠快得多的过程。哺乳动物细胞的温度大约在37℃附近，pH值一般在中性范围内。蛋白质体外复性一般会降低温度甚至直到4℃。而且针对不同的蛋白所选用的pH值范围也很不同。细胞和试管另一个重要差别是“大分子拥挤”问题。第77页,共154页，2024年2月25日，星期天

体外：体外蛋白合成系统

原核表达系统

–

大肠杆菌,芽孢杆菌

体内酵母

真核表达系统昆虫细胞

动物细胞转基因动植物重组表达系统的类型及其优缺点

第78页,共154页，2024年2月25日，星期天重组表达系统的类型及其优缺点

第79页,共154页，2024年2月25日，星期天重组表达系统的类型及其优缺点

第80页,共154页，2024年2月25日，星期天2.原核（大肠杆菌）表达载体的组件2.1复制起始点2.2选择性基因2.3多克隆位点2.4启动子2.5终止子2.6核糖体结合位点第81页,共154页，2024年2月25日，星期天2.真核（哺乳动物细胞）表达载体的组件哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体（一）质粒型载体

哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。目前有多种质粒载体可供选择。（二）病毒型载体

病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。（目前应用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等）典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下作用元件:

(1)启动子，(2)多聚腺苷酸化信号，(3)选择标记和(4)几个原核作用元件，如细菌抗生素选择标记和用于质粒扩增的复制子（具有原核作用元件才能作为原核细胞和真核细胞之间的穿梭质粒）等。第82页,共154页，2024年2月25日，星期天

3.1

包涵体型异源蛋白的表达

3.2可溶性异源蛋白的表达3.外源基因在大肠杆菌中的表达第83页,共154页，2024年2月25日，星期天包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子3.1包涵体型异源蛋白的表达第84页,共154页，2024年2月25日，星期天

包涵体表达形式的优点

1。在一定程度上保持表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集

2。简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来

3。能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白3.1包涵体型异源蛋白的表达第85页,共154页，2024年2月25日，星期天包涵体表达形式的缺点

以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变性复性操作的效率对目标物的收率至关重要。

经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%

复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。3.1包涵体型异源蛋白的表达第86页,共154页，2024年2月25日，星期天1.原则以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整性。2.步骤选择实验材料，实验材料预处理蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定第87页,共154页，2024年2月25日，星期天3.分离方法沉淀法相分配法电泳法离心法超滤法层析法第88页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质的粗分级使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质，这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级。硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋白质结晶等。第89页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析盐析原理：高浓度盐离子与蛋白质分子争夺水化水，破坏蛋白质分子表面的水膜，同时盐离子也会影响蛋白质分子所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。如，硫酸铵分级沉淀蛋白质分子表面的疏水性区域，都聚集许多氺分子，当盐类加入时，这些氺分子被抽出，以便于盐离子进行氺合，暴露出来的疏水性区域互相结合，形成沉淀。第90页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质的细分级粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特称或分子带电状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。常用的实验技术：层析和电泳第91页,共154页，2024年2月25日，星期天层析分离方法第92页,共154页，2024年2月25日，星期天1.1分子筛层析

Gelfiltrationchromatography原理分子筛层析,也称为凝胶过滤、分子排阻层析。是以多孔性凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。

分子质量大的蛋白质难以进入凝胶颗粒内部，因此主要从凝胶颗粒的间隙里通过，所受到的阻滞作用小，分子质量小的蛋白质则容易进入凝胶颗粒内部，所受到的阻滞作用大，因此大分子蛋白质先流出凝胶，而小分子蛋白质后流出凝胶，从而将分子质量大小不同的蛋白质分开凝胶介质葡聚糖（glucose）琼脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纤维素（cellulose）第93页,共154页，2024年2月25日，星期天1.2离子交换层析（Ionexchange）原理蛋白质是两性分子，在一定的pH条件下带有电荷，不同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白质和带电凝胶的作用力的差别从而把蛋白质分开的层析方法。种类阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷介质惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖带电基团：羧甲基—带负电二乙基氨基—带正电平衡离子：负电基团的平衡离子氢或钠离子正电基团的平衡离子氢氧根离子或氯离子第94页,共154页，2024年2月25日，星期天1.3亲和层析

（Affinitychromatography）原理亲合层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合，而其他杂蛋白不能结合。先用结合缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。第95页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质组（proteome）Proteome＝PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因组表达的所有蛋白质）。一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质第96页,共154页，2024年2月25日，星期天二、电泳（Electrophoresis）原理：不同的物质由于其带电性质及其颗粒大小和形状不同，在一定的电场中它们的移动方向和移动速度不同，故此可使它们分离。种类：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）（由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异，使移动速度只和颗粒大小和形状相关。）等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing-IEF）双向电泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）第97页,共154页，2024年2月25日，星期天包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子3.1包涵体型异源蛋白的表达第98页,共154页，2024年2月25日，星期天

包涵体表达形式的优点

1。在一定程度上保持表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集

2。简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来

3。能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白3.1包涵体型异源蛋白的表达第99页,共154页，2024年2月25日，星期天包涵体表达形式的缺点

以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变性复性操作的效率对目标物的收率至关重要。

经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%

复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。3.1包涵体型异源蛋白的表达第100页,共154页，2024年2月25日，星期天一级结构测定的基本策略与步骤（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目（2）拆分蛋白质分子的多肽链（3）断开多肽链内的二硫桥（4）鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基（5）裂解多肽链成较小的片段（6）测定各肽段的氨基酸序列（7）分析每一多肽链的氨基酸组成（8）重建完整多肽链的一级结构（9）确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥的位置第101页,共154页，2024年2月25日，星期天一级结构测定的方法化学法（手工、自动）水解法Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法肼解法、羧肽酶法质谱法推定法第102页,共154页，2024年2月25日，星期天2．肽链选择性地裂解并鉴定

上述测定多肽结构顺序的方法，对于分子量大的多肽是不适用的。对于大分子量多肽顺序的测定，是将其多肽用不同的蛋白酶进行部分水解，使之生成二肽、三肽等碎片，再用端基分析法分析个碎片的结构，最后将各碎片在排列顺序上比较并合并，即可推出多肽中氨基酸的顺序。部分水解法常用的蛋白酶有：胰蛋白酶——只水解羰基属于赖氨酸、精氨酸的肽键。糜蛋白酶——水解羰基属于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的肽键。溴化氰———只能断裂羰基属于蛋氨酸的肽键。

第103页,共154页，2024年2月25日，星期天2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。Sanger法（二硝基氟苯（DNFB）法）3．测定N端和C端1）测定N端第104页,共154页，2024年2月25日，星期天F.Sanger及其他工作者花了约10年时间于1953年（35岁）首先测定出牛胰岛素的氨基酸顺序，由此Sanger获得了1958年（41岁）的诺贝尔化学奖。此后，有几百种多肽和蛋白质的氨基酸顺序被测定出来，其中包括含333个氨基酸单位的甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶。以后F.Sanger又测定了DNA核苷酸顺序，因而他第二次（1980年62岁）获得了诺贝尔奖（同美国人伯格、吉尔伯特共享）。两次获得诺贝尔奖的化学家是很少见的，F.Sanger是一个伟大的化学家。第105页,共154页，2024年2月25日，星期天②异硫氰酸酯法——艾德曼(Edman)降解法

测定咪唑衍生物的R，即可知是哪种氨基酸。特点:除多肽N端的氨基酸外，其余多肽链会保留下来。这样就可以继续不断的测定其N端。第106页,共154页，2024年2月25日，星期天③氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。第107页,共154页，2024年2月25日，星期天2）测定C端（1）多肽与肼反应(肼解法)

所有的肽键（酰胺）都与肼反应而断裂成酰肼，只有C端的氨基酸有游离的羧基，不会与肼反应成酰肼。这就是说与肼反应后仍具有游离羧基的氨基酸就是多肽C端的氨基酸。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。第108页,共154页，2024年2月25日，星期天（2）羧肽酶水解法在羧肽酶催化下，多肽链中只有C端的氨基酸能逐个断裂下来。羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。2）测定C端第109页,共154页，2024年2月25日，星期天例：某八肽

完全水解后，经分析氨基酸的组成为：丙、亮、赖、苯丙、脯、丝、酪、缬。端基分析：N-端丙……亮C-端。

胰蛋白酶催化水解：分离得到酪氨酸，一种三肽和一种四肽。

用Edman降解分别测定三肽、四肽的顺序，结果为：丙-脯-苯丙；赖-丝-缬-亮。由上述信息得知，八肽的顺序为：第110页,共154页，2024年2月25日，星期天空间结构测定的主要方法（1）X射线晶体技术（X-raycrystallography）（2）核磁共振波谱技术NMR(3)电子显微技术ElectronMicroscopy（4）其他第111页,共154页，2024年2月25日，星期天二、X射线晶体结构分析

概念：使用X射线作为物理工具，依赖X射线衍射现象为物理原理，以晶体作为研究对象，晶体结构作为研究结果的一种分析方法。第112页,共154页，2024年2月25日，星期天X射线的产生条件

实验证明，高速运动着的电子突然被阻止时，伴随着电子动能的消失或转化，会产生X射线。

⑴产生并发射自由电子的电子源，如加热钨丝发射热电子；

⑵在真空中（一般为10-6mmHg），使电子作定向的高速运动；

⑶在高速电子流的运动路程上设置一障碍物（阳极靶），使高速运动的电子突然受阻而停止下来。第113页,共154页，2024年2月25日，星期天X射线晶体结构测定样本要求蛋白质在溶液中处于过饱和状态时分子间以规则的方式堆积——结晶分子间以无规则的方式堆积——沉淀正确错误第114页,共154页，2024年2月25日，星期天5、衍射分析的基本理论（1）布拉格方程（衍射产生的条件）

nλ=2dsinθ

（2）周期函数和傅里叶定理

衍射强度与晶胞中原子的种类及分布的关系，并可互相转换。

d——晶面间距；θ——掠射角或布拉格角（半衍射角）

λ——入射线波长2θ——衍射角

n——为整数，称反射级数

第115页,共154页，2024年2月25日，星期天几何理论的物理意义将入射线波长、衍射线方向以及光栅结构三者建立起了数学的定量关系。为晶体结构分析奠定了基础。把光栅结构（即晶体种晶胞的大小、形状，包括对称性）和衍射方向联系起来。晶胞中原子分类及分布和电子密度图联系起来。第116页,共154页，2024年2月25日，星期天X射线晶体结构测定优点分辨率高无污染相对快捷能得到晶体完整性的大量信息

X射线晶体结构测定缺点晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈）X射线晶体衍射的工作流程较长。第117页,共154页，2024年2月25日，星期天3、几个概念晶体(crystal)

Thearrangementofatomsinthecrystalisperiodic.指离子、原子或分子这些微粒在三维空间中周期性重复排列形成的结构。晶胞（UnitCell）Thesmallestcomponentofthecrystal,whichwhenstackedtogetherwithpuretranslationalrepetitionreproducesthewholecrystal.空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。第118页,共154页，2024年2月25日，星期天（4）晶体的初步鉴定第119页,共154页，2024年2月25日，星期天利用核磁共振现象获取分子结构、人体内容结构信息的波谱技术。“四大名谱”：核磁共振谱、紫外光谱、红外光谱、质谱核磁共振波谱法（nuclearmagneticresonance，NMR）第120页,共154页，2024年2月25日，星期天共振条件(1)核有自旋(磁性核)(2)外磁场,能级裂分;(3)照射频率与外磁场的比值

0/H0=

/(2)——外加射场的频率与原子核自旋进动的频率相同第121页,共154页，2024年2月25日，星期天二、几个重要波谱参数化学势（位）移

在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。来源于核外电子云的磁屏蔽效应大小与外加磁场强度成正比

化学势移与蛋白质结构信息是分析分子中各类氢原子所处位置的重要依据直接反映出蛋白质的二级结构信息可以用于直接判断氨基酸肽段的-螺旋、-折叠等二级结构第122页,共154页，2024年2月25日，星期天2.NOE信号强度当分子内有2个空间距离小于0.5nm的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚好使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效应（NOE)原因：空间位置靠近，交叉驰豫较强而导致核自旋之间的磁化强度转移。该效应的大小与原子之间距离的6次方成反比。NOE与蛋白质结构信息是三维结构的只要实验依据可以直接反映蛋白质中质子对间的距离2个质子间越近，NOE信号强度越大有相邻氨基酸残基，短程，NOE强相隔1~4个氨基酸残基，中程；以及相隔5个以上氨基酸残基的远程，NOE弱二、几个重要波谱参数第123页,共154页，2024年2月25日，星期天3.耦合常数J用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。耦合常数J与蛋白质结构信息蛋白质分子中异核间的单键J都具较大值在蛋白质分子中，通过3个单键的核磁矩之间的远程J是反映主链与侧链构象的重要参数造成NMR谱图中的信号峰形状发生变化，通过解析这些峰形的变化，可以推测出分子结构中各原子之间的连接关系。二、几个重要波谱参数第124页,共154页，2024年2月25日，星期天4.驰豫时间原子核从激发状态回复到平衡排列状态的过程叫驰豫过程，其所需时间叫驰豫时间自旋晶格驰豫：又称纵向驰豫（t1)，处于高能态的氢核把能量转给周围的分子（固体为晶格，液体则为周围的液体分子或同类分子）变成热运动而回到低能状态。自旋-自旋驰豫：又称横向驰豫（t2)，2个进动频率相同而取向不同的磁性核（能态不同的相同核），在一定距离内相互交换能量，改变进动方向。驰豫时间与蛋白质结构信息提供空间位阻、各向异性、分子大小、形状等信息二、几个重要波谱参数第125页,共154页，2024年2月25日，星期天5.谱峰面积峰面积与同类质子数成正比，仅能确定各类质子之间的相对比例。峰面积的积分值可作为定量分析的基础谱图中化合物的结构信息（1）峰的数目：标志分子中磁不等性质子的种类，多少种；（2）峰的强度(面积)：每类质子的数目(相对)，多少个；（3）峰的位移(

)：每类质子所处的化学环境，化合物中位置；（4）峰的裂分数：相邻碳原子上质子数；（5）偶合常数(J)：确定化合物构型。（二）几个重要波谱参数第126页,共154页，2024年2月25日，星期天样品要求高纯度高浓度：核磁共振信号的强度与处于谱仪中“灵敏体积”内的样品的量成正比。稳定分子量分子量的增大对核磁共振谱有两方面的影响：(a)

谱的复杂程度会增加。(b)

每条谱峰的线宽也会增加。

NMR实验注意点第127页,共154页，2024年2月25日，星期天核磁共振技术优点可以在溶液中操作，接近生理状态同样具有高分辨率分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理核磁共振技术的不足样品的分子量要比较小（50KD以下）对不溶的蛋白比较困难（如膜蛋白）实验周期长（>1年）第128页,共154页，2024年2月25日，星期天电子晶体学单颗粒冷冻电镜技术电子断层成像术电子显微技术

第129页,共154页，2024年2月25日，星期天1、电子晶体学首先必须得到在二维方向上高度有序且足够大的蛋白质二维晶体其三维重构是通过倾转样品，拍摄不同角度下的电子衍射谱和电子显微像，获取不同转角下的振幅好相位信息，在三维倒易空间中拟合，并加入相应的晶体学对称，通过逆傅里叶变换得到实空间的晶体结构最大优势：得到的膜蛋白好膜相关的水溶性蛋白在膜环境中的结构信息更反映生理状态下的真实结构。目前只能对二维晶体结构的样品达到原子或接近原子的分辨率水平第130页,共154页，2024年2月25日，星期天2、冷冻电镜单粒子法是将样品保存在液氮或液氮温度下利用透射电子显微镜进行二维成像，再经过二维投射图像的分析进行三维重构。优点不用结晶高压快速液氮冷冻包埋，减少了样品在制备过程中的结构破坏，接近生理状态，同时也可减少电子束带来的损伤场发射抢的使用提高了信噪比可捕捉不同概念状态的瞬时构象实时分辨（time-resolution)第131页,共154页，2024年2月25日，星期天3、电子断层成像技术通过对每一样品每间隔一定角度拍摄一副照片，得到几十副（上百副）代表同一结构不同角度下的二维投影像，然后对这一系列投影像对正，用加权背投影的方法获得样品的空间结构。显示的是完整结构系统的静态结构信息面临挑战：冷冻含水技术、超薄切片技术、重复照射适用于细胞器、细胞结构、或巨大的超分子复合物在解决不具备周期性或全同性的生物大分子复合体系或细胞器的结构上具有优势第132页,共154页，2024年2月25日，星期天电子显微技术的优点1.可以直接获得分子的形貌信息；2.适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品（如难以结晶的膜蛋白，大分子复合体等）；3.适于捕捉动态结构变化信息；4.易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息；5.电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X射线晶体学直接和方便。一种公认的研究生物大分子、超分子复合体及亚细胞结构的有力手段。目前唯一能研究不同大小和结构的方法。第133页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质的二级结构预测的基本依据是： 每一段相邻的氨基酸残基具有形成一定二级结构的倾向。二级结构预测问题是模式分类问题二级结构预测的目标：判断每一段中心的残基是否处于

螺旋、

折叠、转角（或其它状态）之一的二级结构态。

1、二级结构预测概述第134页,共154页，2024年2月25日，星期天蛋白质组学（Proteomics）

研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学同基因组学一样,蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系,而是一个领域。是基因组ＤＮＡ序列与基因功能之间的桥梁第135页,共154页，2024年2月25日，星期天第136页,共154页，2024年2月25日，星期天主要解决问题基本生物学问题Post-translationalmodificationProtein-proteininteract