地形地势特征

地形地势特征地形地势特征地形地势特征基因工程的工具及操作过程

基因工程的工具及操作过程限制酶、DNA连接酶及载体(质粒)显微注射法

农杆菌转化法

花粉管通道法

Ca2＋处理法

启动子

终止子

限制酶、DNA连接酶及载体(质粒)显微注射法农杆菌转构建基因表达载体逆转录法

cDNA文库

抗原—抗体杂交

构建基因表达载体逆转录法cDNA文库抗原—抗体杂无限增殖

产生特异性抗体

动物细胞培养

单克隆抗体制备

无限增殖产生特异性抗体动物细胞培养单克隆抗体制备细胞工程

细胞工程聚乙二醇

植物细胞的全能性

植物组织培养技术

脱分化

再分化

基因选择性表达

聚乙二醇植物细胞的全能性植物组织培养技术脱分化三

杂交瘤

克隆化

抗体

三杂交瘤克隆化抗体胰蛋白酶

动物血清

贴壁生长

接触抑制

胰蛋白酶动物血清贴壁生长接触抑制MⅡ中期

使克隆牛的遗传物质几乎

全部来自供体细胞

生物法

灭活的病毒

基因工程

动物细胞培养

动物细胞融合

体细胞核移植

MⅡ中期使克隆牛的遗传物质几乎全部来自供体细胞生基因工程的原理及蛋白质工程

1.基因工程的原理(1)基本工具①限制性核酸内切酶：识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，形成平末端或黏性末端。②DNA连接酶：连接两个DNA片段的磷酸二酯键，不能连接RNA。包括E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。基因工程的原理及蛋白质工程1.基因工程的原理③载体：将目的基因导入受体细胞，能在宿主细胞中稳定存在并复制，具有遗传标记基因，具有多个限制性核酸内切酶的酶切位点。常使用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。③载体：将目的基因导入受体细胞，能在宿主细胞中稳定存在并复制(2)基本操作步骤①目的基因的获取a．从基因文库中获取。b．利用PCR技术扩增。c．用化学方法直接人工合成。②基因表达载体的构建a．基因表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因。(2)基本操作步骤地形地势特征③将目的基因导入受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法(用Ca2＋处理)受体细胞受精卵、体细胞受精卵原核细胞③将目的基因导入受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农④目的基因的检测与鉴定a．目的基因插入检测：DNA分子杂交技术。b．目的基因转录检测：(核酸)分子杂交技术。c．目的基因翻译检测：抗原—抗体杂交技术。d．个体生物学水平检测：根据目的基因表达出的性状判断。④目的基因的检测与鉴定地形地势特征1．注意切割的序列是否会连接成环：切割图1中的目的基因时，最好不要只用BamHⅠ，因为只用BamHⅠ切割时，目的基因的两端具有相同的黏性末端，易自行连接成环，因此最好同时用BamHⅠ和HindⅢ切割。2．限制酶的切割序列具有包含关系：图2中BamHⅠ和MboⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别是G↓GATCC、↓GATC，这两个限制酶都可切割同一碱基序列GGATCC。3．切割时注意是否破坏所有抗性基因，导致缺乏标记基因。1．注意切割的序列是否会连接成环：切割图1中的目的基因时，最地形地势特征1．(2013·原创题)转基因抗病香蕉的培育过程如下图所示。图中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等为限制酶，质粒和抗病基因上的箭头表示限制酶的切割位点。下图表示四种限制酶的识别序列及酶切位点。1．(2013·原创题)转基因抗病香蕉的培育过程如下图所示。下列有关叙述错误的是(

)A．获得含抗病基因的重组质粒不可用PstⅠ、ApaⅠ限制酶切割质粒B．由①→②、②→③阶段均涉及细胞的分裂与分化C．④阶段可用不添加植物激素的培养基D．上述培育过程涉及的生物技术有基因工程、植物组织培养等下列有关叙述错误的是()【解析】

由①→②为脱分化过程，细胞只分裂形成愈伤组织；而由②→③为再分化过程，细胞既分裂又分化。【答案】

B【解析】由①→②为脱分化过程，细胞只分裂形成愈伤组织；而由1.动物细胞培养与植物组织培养的比较项目动物细胞培养植物组织培养培养前处理无菌、用胰蛋白酶处理，使组织细胞相互分散开无菌、离体培养基成分葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素、动物血清等矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素等培养基状态液体培养基固体培养基1.动物细胞培养与植物组织培养的比较项目动物细胞培养植物组织地形地势特征地形地势特征地形地势特征据图回答下列问题：(1)过程①所需的酶是____________________。(2)过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的________存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。(3)原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是______________________。原生质体经过________再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。(4)若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和________植株的根尖，通过________、________、染色和制片等过程制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目。据图回答下列问题：地形地势特征【解析】

熟记植物体细胞杂交过程，准确解读信息是解题关键。(1)获取植物细胞的原生质体可用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞。(2)根据题干信息可知，供体使用的是叶肉细胞的原生质体，所以可将融合的细胞是否含叶绿体作为初步筛选杂种细胞的标志。(3)原生质体因没有了细胞壁，在低渗溶液中容易吸水涨破，加入甘露醇可保持一定的渗透压，以保持原生质体的完整性。原生质体需再生出细胞壁形成杂种细胞，然后经分裂、脱分化形成愈伤组织。

【解析】熟记植物体细胞杂交过程，准确解读信息是解题关键。(4)若要分析再生植株的染色体变异类型，需对再生植株细胞和双亲细胞的染色体形态与数目进行比较。植物细胞有丝分裂装片的制作包括解离、漂洗、染色和制片四个步骤。(5)由图可知，植株1、2、4的条带中除了具有花椰菜的DNA片段外，还有来自黑芥的DNA片段，所以是杂种植株。(6)对杂种植株进行病原体(黑腐病菌)接种实验，若不患黑腐病，即为高抗性杂种植株。【答案】

(1)纤维素酶和果胶酶(2)叶绿体(3)保持原生质体完整性细胞壁(4)双亲(或花椰菜和黑芥)解离漂洗(5)1、2、4

(6)黑腐病菌(4)若要分析再生植株的染色体变异类型，需对再生植株细胞和双1．(2012·广东高考T2－B)培养草莓脱毒苗所采用的主要技术是细胞杂交。(×)【提示】

主要技术应为组织培养。2．(2013·大纲全国卷T2－B)动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶。(×)【提示】

植物组织培养不需要用胰蛋白酶。1．(2012·广东高考T2－B)培养草莓脱毒苗所采用的主要3．(2013·重庆高考T2－A改编)与鼠骨髓瘤细胞融合的淋巴细胞是效应T细胞。(×)【提示】

用到的淋巴细胞应为已免疫的B细胞。4．(2013·重庆高考T5－C)愈伤组织培养后的出芽是细胞再分化的结果，受基因选择性表达的调控。(√)5．(2013·江苏高考T22－B)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)3．(2013·重庆高考T2－A改编)与鼠骨髓瘤细胞融合的淋【典例】图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：【典例】图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基地形地势特征(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是_________________________。(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因【研析】

审题信息1：“目的基因D中的一条脱氧核苷酸链中相邻的两碱基”的连接——得出通过“脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖”连接信息2：由题干一个关键词“bp即碱基对”及SmaⅠ的切割位点——得出切割产物为三部分，796bp的长度向左向右分别减小了3个bp信息3：由“目的基因D中C—G被T—A替换”——推出SmaⅠ无法再对突变后形成的d基因中突变碱基序列进行切割，即d基因只能被切割为两部分(1327bp和661bp)信息4：图2标记基因A(抗生素A抗性基因)、B(抗生素B抗性基因)的碱基序列分别为GGATCC、GATC——推测只有BamHⅠ切割才能保留其中的一个标记基因和目的基因不受破坏【研析】审信息1：“目的基因D中的一条脱氧核苷酸链中相邻的破题思考1：基因的平面结构中单、双链中相邻碱基间的不同连接方式思考2：限制酶在基因工程操作中的作用特点思考3：表达载体构建时必须注意的问题思考4：基因工程操作的基本流程答题(1)忽略设问中单链脱氧核苷酸链上碱基的连接而误答为双链上两碱基间的连接“氢键”(2)忽视题干一个关键信息“DNA片段长度(bp即碱基对)”，造成对限制酶切割后的碱基序列长度无法计算(3)标记基因的碱基序列特点决定了对表达载体进行切割时的酶只有BamHⅠ(4)目的基因与载体连接时一定要注意彼此末端的方向性，否则连接后会造成“基因沉默”即基因不能正常表达破思考1：基因的平面结构中单、双链中相邻碱基间的不同连接方式【答案】

(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖(2)平537bp、790bp、661bp(3)4

(4)BamHⅠ抗生素B同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接【答案】(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖(2)平537b【方法总结】1．熟练掌握基因工程的原理(工具及操作程序)是解答有关基因工程题目的关键。限制酶和DNA连接酶作用部位为磷酸二酯键，基本程序可概括为“切、接、增、转、检”。2．依据受体细胞的种类确定导入方法；依据对表达产物的要求确定不同水平上的检测方法。【方法总结】【考情分析】

近几年来，对于动物细胞工程中的单克隆抗体制备的考查尤为突出。多考查制备的原理、过程及材料的选择、二次筛选的目的等知识。试题多以选择题形式呈现，如2013·重庆高考T2；2012·上海高考T13；2011·江苏高考T14等。常考实验单克隆抗体的制备【考情分析】近几年来，对于动物细胞工程中的单克隆抗体制备的地形地势特征A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应T淋巴细胞B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成C．③同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群【解析】

明确单克隆抗体制备过程的几个关键环节是准确解答本题的关键。①是从小鼠脾脏中获得的能产生抗体的浆细胞，A项错误；②中应该使用能促进细胞融合的促融剂，如聚乙二醇等，B项错误；③同时具有从脾脏中分离出的浆细胞和骨髓瘤细胞的特性，C项错误；④是经筛选培养获得的能产生特异性抗体的细胞群，D项正确。【答案】

DA．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应T淋巴细胞单克隆抗体制备中的两次筛选1.第一次筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及B—B融合的细胞、瘤—瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B—瘤融合的细胞。2.第二次筛选是将能产生特定抗体的B—瘤融合的细胞通过细胞培养、用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内获取的免疫过的B淋巴细胞有很多种，形成的杂交瘤细胞就有很多种，所以需筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体制备中的两次筛选基因工程

考点频度3年18考考查特点10选择题＋8非选择题基因工程考点频度3年18考考查特点10选择题＋8非选择题地形地势特征C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶【解析】

设计引物时应当考虑需扩增的目的基因与载体两端的序列进行互补配对，A项错误；利用PCR技术扩增目的基因只需要知道基因两端的序列，据此设计合适的引物即可，不必知道基因的全部序列，B项正确；PCR体系中应该用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶，C项错误；需根据目的基因的编码产物的特性来选择合适的受体细胞，如果是分泌蛋白，则最好选用真核细胞作为受体细胞，D项正确。【答案】

BD【解析】设计引物时应当考虑需扩增的目的基因与载体两端的序列角度备考看点基因工程的原理1.加强有关基因工程中生物学术语的识记如“显微注射”、“基因表达载体的构建”、“抗原—抗体杂交”等。2.目的基因的获取方法及导入方法。3.基因工程的“四步曲”基因工程与其他技术手段的综合1.转基因技术与植物细胞工程的综合。2.转基因动物与体细胞核移植结合克隆动物。3.转基因生物的安全性。4.基因工程与胚胎工程中胚胎移植的综合考查角度备考看点基因工程的原理1.加强有关基因工程中生物学术语的1．(2013·惠州二模)下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。资料1

巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达【5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子】。1．(2013·惠州二模)下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主资料2

巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。资料2巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图(1)如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上________、________限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。(2)酶切获取HBsAg基因后，需用________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取________。(3)步骤3中应选用限制酶________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。(1)如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在H(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用________方法进行检测。(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。(6)与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行________并分泌到细胞外，便于提取。(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加【解析】

(1)重组质粒上的目的基因若要表达，需要目的基因的首尾含有启动子和终止子。而SnaBⅠ、AvrⅡ识别的序列在启动子与终止子之间，只要在目的基因两侧的A和B位置分别接上这两种序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ这两种限制酶对质粒和目的基因同时进行切割，便会各自出现相同的黏性末端，便于重组与表达，同时可防止自身环化，因此在HBsAg基因两侧的A和B位置应接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的识别序列。

【解析】(1)重组质粒上的目的基因若要表达，需要目的基因的(2)①用DNA连接酶可将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒；②将重组质粒导入大肠杆菌体内，目的是利用大肠杆菌的无性繁殖，短时间内获取大量的重组质粒。(3)重组DNA的两侧分别是启动子和终止子，除Bgl

Ⅱ外，其他限制酶均会破坏含有启动子、终止子的目的基因。(4)可用DNA分子杂交技术检测巴斯德毕赤酵母菌内是否导入了目的基因。

(5)资料1显示，甲醇为该酵母菌的唯一碳源，同时可诱导HBsAg基因表达。(6)酵母菌为真核生物，细胞内具有能对分泌蛋白进行加工的内质网和高尔基体等细胞器，细菌等原核生物不具有内质网和高尔基体等细胞器。(2)①用DNA连接酶可将切割后的HBsAg基因和pPIC9【答案】

(1)SnaBⅠ

AvrⅡ

(2)DNA连接酶大量重组质粒(3)BglⅡ

(4)DNA分子杂交(5)甲醇(6)加工(修饰)【答案】(1)SnaBⅠAvrⅡ(2)DNA连接酶细胞工程

考点频度3年12考考查特点9选择题＋3非选择题细胞工程考点频度3年12考考查特点9选择题＋3非选择题地形地势特征【解析】

培育草莓脱毒苗是利用草莓的茎尖分生组织细胞几乎不带病毒的特点，进行植物组织培养形成无毒种苗的过程，A正确。植物体细胞杂交是将不同种的植物体细胞在一定条件下融合成杂种细胞，培育成新的植物体的技术；显微注射是将目的基因导入动物细胞的方法；细胞核移植用于获得克隆动物，B、C、D错误。【答案】

A【解析】培育草莓脱毒苗是利用草莓的茎尖分生组织细胞几乎不带角度备考看点植物细胞工程1.植物组织培养的过程原理及条件。2.植物体细胞杂交的过程及原理。3.植物细胞工程的应用，如快速繁殖、人工种子的制备、细胞产物的生产等动物细胞工程1.动物细胞培养的过程、原理及条件。2.体细胞核